Intracellular and Extracellular Redox Status and Free Radical Generation in Primary Immune Cells from Children with Autism
1. Pendahuluan
Autisme adalah gangguan perkembangan saraf perilaku yang biasanya tampak pada anak usia dini dan ditandai oleh gangguan yang signifikan dalam interaksi sosial, komunikasi, dan perilaku abnormal berulang yang selalu terfokus. Prevalensi gangguan autisme telah meningkat lebih dari 10 kali lipat dalam dua dekade terakhir, mempengaruhi satu dari 110 anak-anak di AS, namun etiologi dari gangguan ini masih sulit dipahami [1]. Deplesi glutathione dan stres oksidatif telah terlibat dalam patologi berbagai gangguan neurobehavioral termasuk skizofrenia [2], gangguan bipolar [3], dan penyakit Alzheimer [4]. Bukti-bukti yang ada menunjukkan bahwa ketidakseimbangan redoks dan stres oksidatif juga dapat berperan dalam patofisiologi autisme. Beberapa biomarker stres oksidatif telah diidentifikasi pada sampel darah dari anak autis [5-12]. Kelompok kami telah melaporkan penurunan konsentrasi glutation (GSH) dan beberapa prekursor metabolik, peningkatan glutation disulfida teroksidasi (GSSG), dan penurunan rasio glutation redoks (GSH / GSSG) dalam evaluasi plasma pada penelitian case-control dan jalur sel lymfoblastoid yang berasal dari anak autis [13-16]. Baru-baru ini, beberapa polimorfisme interaktif enzim yang mengatur sintesis glutation ditemukan menjadi lebih banyak pada anak dengan autisme menunjukkan bahwa defisit glutation dan kecenderungan untuk mengalami stres oksidatif mungkin didapatkan secara genetik pada beberapa anak [17]. Stres oksidatif terjadi ketika mekanisme pertahanan antioksidan seluler gagal untuk mempertahankan keseimbangan produksi ROS endogen dan / atau eksposur prooksidan eksogen lingkungan. Glutation ((γγ-L-glutamil-L-cysteinylglycine) merupakan tripeptida yang berfungsi sebagai antioksidan intraseluler utama dan buffer redoks terhadap kerusakan oksidatif makromolekul. Pasangan glutation tiol / disulfida redoks (GSH / GSSG) adalah mekanisme utama untuk menjaga lingkungan mikro intraseluler dalam keadaan yang sangat minim yang penting bagi kapasitas antioksidan / detoksifikasi, pengaturan enzim redoks, progresi siklus sel, dan transkripsi elemen respon antioksidan (ADALAH) [18-23]. Variasi halus dalam konsentrasi relatif dari glutation berkurang dan teroksidasi menyediakan mekanisme sinyal dinamis redoks yang mengatur proses-proses vital selular [24-27]. Misalnya, dalam prekursor sel SSP dan sel imun yang naive, keadaan glutathione intraseluler redoks adalah penentu utama pengaturan sel untuk menjalani penahanan siklus sel, diferensiasi, atau proliferasi [27]. Sebuah lingkungan intraseluler yang berkurang diperlukan
untuk proliferasi, sementara lingkungan mikro yang lebih teroksidasi membantu penahanan siklus sel dan diferensiasi sel. Defisit kronis dalam rasio GSH / GSSG redoks dianggap sebagai indikator yang dapat diandalkan dari stres oksidatif dan meningkatkan kerentanan terhadap kerusakan oksidatif dari paparan prooksidan lingkungan [28, 29]. Dalam kompartemen plasma ekstraseluler, pasangan redoks sistein / sistin (tiol / disulfida) pasangan redoks secara independen memberikan lingkungan redoks ambient untuk sel imun di dalam sirkulasi. Sistein ekstrasel / sistin redoks potensial ekstraseluler telah terbukti lebih teroksidasi daripada GSH intrasel / GSSG potensial redoks dan secara independen diatur [30]. Pergeseran dinamis dalam plasma sistein / sistin potensial redoks mengubah status redoks dari gugus sistein dalam protein permukaan sel untuk menginduksi perubahan struktur protein yang secara reversibel dapat mengubah fungsi [31, 32]. Sebagai contoh, di bawah kondisi ekstraseluler teroksidasi, residu sistein sensitif-redoks dalam inti katalitik dari tirosin protein fosfatase menjadi teroksidasi dan secara reversibel menonaktifkan aktivitas enzim tergantung pada sistein ambien / sistin potensial redoks [31, 33, 34]. Sistein ekstraseluler / status sistin redoks muncul sebagai transduksi penting sinyal baru mekanisme yang dapat menginduksi perubahan posttranslational pada aliran protein sensitif redoks termasuk berbagai enzim, faktor transkripsi, reseptor, adesi molekul, dan protein penanda membran yang berpengaruh pada pengaturan kedinamisan aktivitas dan fungsi mereka [32, 35, 36]. Penelitian terbaru telah mengungkapkan kelainan imunologi di antara anak autis termasuk perubahan dalam proporsi sel imun [37-40] dan pergeseran populasi sel T-helper setelah stimulasi mitogenik [41, 42]. Sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari individu dengan autisme telah terbukti menghasilkan sitokin proinflamasi lebih tinggi dan terdapat level abnormal sitokin yang beredar dibandingkan dengan kontrol PBMC pada awal dan pada stimulasi mitogenik [43-46]. Secara keseluruhan, studi imunologi menunjukkan peran untuk sistem kekebalan yang tidak teregulasi dalam autisme yang berpotensi terkait dengan defisit antioksidan dimediasi-glutation dan sel imun mikro teroksidasi dalam lingkungan mikro. Untuk menyelidiki kemungkinan ini, kami memeriksa apakah sel-sel imun primer (PBMC) dari anak-anak dengan autisme menunjukkan penurunan kapasitas glutathione intraseluler redoks dibandingkan dengan PBMC dari anak-anak dengan usia-kontrol dan apakah lingkungan mikro intraseluler dan ekstraseluler lebih teroksidasi dikaitkan dengan peningkatan produksi radikal bebas intraseluler yang beroksidasi. Karena sel-sel imun dari anak autis telah terbukti memiliki respon abnormal terhadap stimulasi, kami juga memilih untuk menantang PBMC dengan aktivator sel imun yang dikenal untuk memberikan stres
oksidatif dan mengukur status glutation redoks intraseluler dalam monosit terisolasi yang diaktifkan dan sel T.
2. Subjek dan Metode
2.1. Peserta. Penelitian ini dilakukan pada
anak-anak autis IMAGE (Integrated
Metabolic and Genomic Endeavor) di Arkansas Childrens’ Hospital Research Institute (ACHRI) yang telah merekrut lebih dari 162 kasus dan kontrol keluarga sampai saat ini. Kohort IMAGE untuk penelitian ini terdiri dari 43 anak didiagnosis dengan gangguan autis dan 41 anak-anak kontrol yang tidak terpengaruh (16 di antaranya adalah saudara kandung terpengaruh). Keluarga autisme ini direkrut secara lokal setelah dirujuk ke University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS), Dennis Developmental Center dan didiagnosa oleh dokter anak terlatih. Anak-anak berusia 3 sampai 10 tahun dengan diagnosis gangguan autistik seperti yang didefinisikan oleh DSM-IV 299.0, Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS), dan / atau Childhood Autism Rating Scales (CARS > 30) yang terdaftar. Anak yang didiagnosis dengan kondisi lain pada spektrum autisme atau penyakit genetik yang langka dikaitkan dengan gejala autisme tidak dimasukkan dalam penelitian. Anak-anak dengan gangguan kejang kronis, infeksi baru, dan dengan suplemen vitamin atau mineral dosis tinggi melebihi RDA juga dikeluarkan karena kondisi ini merupakan pembaur potensial yang dapat mempengaruhi status redoks. Saudara tidak terpengaruh dan tidak terkait, anakanak neurotypical berusia 3 sampai 10 tahun yang tidak memiliki riwayat medis kelainan perilaku atau neurologis berdasarkan laporan orang tua menjadi kelompok pembanding. Protokol ini telah disetujui oleh Institutional Review Board di UAMS, dan semua orangtua menandatangani informed consent. 2.2. Bahan. Termos, piring, dan pipet setempat diperoleh dari Corning Life Sciences (Lowell, Mass, USA). RPMI 1640, penisilin / streptomisin, garam phosphatebuffered Dulbecco (PBS), serum janin sapi (FBS), dan glutamin yang dibeli dari Life Technologies (Carlsbad,
California,
USA).
Karboksi-H2DCFDA
(6-karboksi-2_,
7_-
dichlorodihydrofluorescein diasetat, ester diacetoxymethyl) diperoleh dari Molecular Probes (Carlsbad, California, USA). Human Monocyte Isolation Kit II dan Human CD4 T Cell Isolation Kit II yang dibeli dari Miltenyi Biotec (Bergisch-Gladbach, Jerman). Histopaque1077 dan semua bahan kimia lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, Mo, USA).
2.3 Isolasi PBMC dan Stimulasi Monosit dan Sel T CD4
Sampel darah puasa diambil sebelum jam 09.00 dan dimasukkan ke tabung EDTAVacutainer dan segera didinginkan di dalam es sebelum disentrifugasi pada 1300xg selama 0
0
10 menit pada suhu 4 C. Alikuot plasma disimpan pada suhu -80 C di dalam tabung cryostat sampai ekstraksi dan kuantifikasi HPLC. PBMC diisolasi dengan sentrifugasi pada Histopaque-1077. Sel darah merah dilisis menggunakan inkubasi singkat (15 detik) dengan 1 6
mL air es. Sekitar 30x10 PBMC diresuspensi dalam medium RPMI 1640 (ditambah dengan 10% FBS, 1% penisillin/streptomysin, dan 2mM glutamin) dengan kepadatan 10
6
sel/mL.
Mengingat bahwa sulit untuk memperoleh 20mL volume darah dari setiap anak, maka isolasi dan analisa monosit dan sel-T CD4 tidak mungkin dilakukan pada semua peserta. Untuk stimulasi monosit, PBMC ditambahkan dengan 0.1 μg/mL lipopolisakarida (LPS); untuk stimulasi sel-T, PBMC ditambahkan dengan 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate 0
(PMA) dan 1 μg/mL ionomysin. Sel ditempatkan di dalam inkubator 5% CO 2 pada suhu 37 C selama 4 jam. Monosit yang sudah distimulasi dan sel-T CD4 kemudian diisolasi oleh seleksi negatif menggunakan pelabelan sel magnetik seperti yang dijelaskan oleh pabrik (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany). Dengan menggunakan flowsitometri, dapat ditentukan bahwa ≥ 75% monosit isolasi positif untuk CD14 dan ≥ 87% sel-T CD4 positif 6
untuk CD4. Untuk kuantifikasi HPLC dari GSH and GSSG, sekitar 2x10 PBMC yang belum distimulasi, monosit stimulasi, atau sel-T CD4 stimulasi digabung, dibekukan di es kering, 0
dan disimpan pada suhu -80 C.
2.4. Ekstraksi Sel dan Kuantifikasi HPLC Glutathione Intraseluler dan Plasma Sistein Redox Status.
Interval penyimpanan
0
pada -80 C
sebelum ekstraksi secara
konsisten antara
1-
2 minggu setelah pengambilan darah dan isolasi sel untuk meminimalisir potensi interkonversi metabolit. Rincian metodologis untuk intraseluler dan ekstraseluler ekstraksi GSH dan elusi HPLC dan deteksi elektrokemikal sudah dijelaskan sebelumnya [15, 16], dan deteksi metabolit tidak memerlukan derivatisasi. Meskipun kebanyakan GSSG merupakan disulfida campuran dengan thiol termasuk cysteine, pengukuran kami hanya mendeteksi GSSG bebas dalam plasma. Konsentrasi glutathione dan cysteine dikalkulasi dari daerah puncak kurva standar kalibrasi menggunakan software HPLC. Hasil intraseluler dinyatakan sebagai nanomoles per milligram protein menggunakan BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, Ill, USA), dan hasil plasma dinyatakan sebagai micromoles per liter.
2.5. Pengukuran Radikal Bebas Intraseluler.
Carboxy-H2DCFDA (DCF) adalah sebuah membran permeabel ROS/RNS-sensitif probe yang tetap nonfluoresen sampai dioksidasi oleh intraseluler radikal bebas. Intensitas fluoresen DCF berbanding lurus dengan tingkat oksidasi radikal bebas. Sekitar 10
6
PBMC
diresuspensi dalam 1 mL RPMI 1640 medium ditambahkan dengan 10% FBS, 1% penisilin/streptomysin, and 2mM glutamin dan diwarnai di tempat gelap selama 20 menit 0
dengan 1 μM DCF pada suhu 37 C. Sel yang diwarnai, dicuci dan diresuspensi dalam PBS segera dianalisa dengan flowsitometer Partec CyFlow (G¨orlitz, Germany) menggunakan panjang gelombang eksitasi 488 nm dan dengan emisi penyaring (FL1) 530/30 nm. Untuk setiap analisa, fluoresensi dari 10000 sel dikumpulkan, dan data dianalisa menggunakan software FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, Calif, USA). Radikal bebas intraseluler dinyatakan sebagai median fluorescence intensity (MFI) dari sampel subjek fluoresensi DCF normalisasi untuk fluoresensi DCF dari standar persiapan PBMC. Sebagai kontrol internal, standar persiapan PBMC diisolasi dari 100 mL sampel darah dari 0
sukarelawan dewasa sehat yang tidak terpengaruh, dialikuosi dan dibekukan pada -180 C dalam 90% FBS/10% DMSO. Alikuot dari standar persiapan PBMC diwarnai dan dianalisa dengan setiap sampel subjek. Evaluasi oksidasi produksi radikal bebas hanya mungkin dilakukan pada kasus tersebut dan diperoleh sampel kontrol yang tidak berhubungan pada (~20 mL) volume darah. Tabel 1: Demografi Populasi Penelitian.
Umur; rata-rata (SD) Laki-laki; n (%) Putih; n (%) Asia; n (%) Afrika Amerika; n (%) Hispanic; n (%) Penggunaan multivitamin OTC; n (%)
Anak Kasus n = 43 5.42 (1.98) 36 (84) 38 (88.4) 2 (4.65) 2 (4.65) 1 (2.3) 17 (39.5)
Anak Kontrol n = 41 6.16 (2.29) 20 (49) 31 (75.6) 0 (0) 8 (19.5) 2 (4.9) 8 (19.5)
2.6. Analisa Statistik.
Dalam
kelompok kontrol,
16
dari 41 anak-anak tidak
terpengaruh
kontrol adalah saudara kandung kelompok kasus. Ada 27 orang tambahan anak kelompok kasus tanpa saudara dan 25 orang tambahan anak yang tidak berhubungan dengan anak kelompok kontrol sehingga total 84 orang anak kohort kontrol kasus. Untuk menurunkan dampak asing, tiga observasi metabolit dibatasi pada ekstrim dari distribusi PBMC GSH, PBMC GSSG, and Monocytes GSH/GSSG (lihat Tabel 2). Data saudara berkorelasi sehingga
menghasilkan kombinasi sampel data berkorelasi dan data tidak berkorelasi.; dengan demikian, asumsi semua data independen tidak memuaskan untuk standar dua sampel tes-t. Untuk memanfaatkan semua data dari observasi dependen dan independen, kami menggunakan koreksi tes-Z oleh Looney and Jones [47]. Pendekatan statistik ini memberikan kontrol yang memadai dari
kesalahan Tipe 1 dan memiliki kekuatan lebih dari standar
Student’s t -test. Karena data DCF dibandingkan kasus dan control yang tidak berhubungan (tanpa saudara kandung) standar Student’s t -test digunakan dengan set signifikansi pada 0.05. Interkorelasi nonparametrik (Spearman correlation coefficients) antara umur dan gender dan 7 variabel hasil, GSH, GSSG, GSH/GSSG, % glutathione oksidasi, cysteine, cystine, and cysteine/cystine ditentukan dengan set tingkat signifikansi di 0.05. Data dianalisa menggunakan software SAS 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, USA).
3.1. Demografi Populasi Penelitian
Table 1 menunjukkan demografi populasi penelitian. Satu-satunya perbedaan utama antara kasus dan kontrol adalah bahwa kelompok kontrol terdiri dari proporsi perempuan dan Afrika-Amerika yang lebih besar, sedangkan kelompok kasus mempunyai proporsi Asia yang lebih besar. Penggunaan suplemen multivitamin lebih tinggi pada kalompok kasus (39.5%) dibandingkan kelompok kontrol (19.5%); namun, status redoks glutathione secara statistik tidak terpengaruh oleh penggunaan vitamin (data tidak ditampilkan).
3.2 Penurunan Status Intraselular Glutathione Redoks dalam Autisme Tabel 2 menyajikan konsentrasi intraseluler relatif dari GSH, GSSG, rasio redoks glutathione, dan persentase dari glutation teroksidasi seimbang dalam keadaan istirahat (tidak distimulasi) PBMC dan stimulasi monosit terisolasi dan sel T CD4 dari anak autis dan anak usia kontrol yang cocok. Persentase glutathione teroksidasi dinyatakan dalam absolut glutathione ekuivalen sebagai 2GSSG / (GSH +2 GSSG). Sehubungan dengan kontrol, konsentrasi intraselular GSSG dan persen glutation teroksidasi meningkat secara signifikan (~ 40%), dan rasio GSH / GSSG menurun (~ 21%) di PBMC dari anak autis (P <0,001). Setelah stimulasi dengan LPS, monosit dari anak autis juga menunjukkan penurunan yang signifikan GSH / GSSG (~ 31%, P = 0,003), konsentrasi GSSG meningkat (~ 32%, P = 0,01), dan 40% persen lebih tinggi glutation teroksidasi (P <0,001). Dalam rangsangan mitogen sel T CD4 dari anak autis, konsentrasi GSH intraseluler adalah ~ 33% lebih rendah, GSH / GSSG adalah ~ 40% lebih rendah (P <0,001), dan persen glutathione teroksidasi adalah ~ 55% lebih tinggi dari pada rangsangan sel T CD4 dari anak-anak kontrol (<0,001). Seperti yang diharapkan, aktivasi dengan LPS dan PMA menunjukkan penurunan kadar GSH intraseluler dan GSH / GSSG di monosit terisolasi dan sel T CD4 dibandingkan dengan beristirahat (tidak distimulasi) PBMC. Setelah stimulasi, terjadi penurunan yang lebih besar dalam GSH intraseluler dan GSH / GSSG di kedua sel T CD4 dan monosit dari anak autis dibandingkan dengan anak-anak
kontrol. Baik umur atau jenis kelamin secara signifikan berkorelasi dengan ukuran hasil. 6 Kandungan protein per 10 sel tidak berbeda antara kasus dan kontrol (data tidak ditunjukkan). 3.3. Penurunan Glutathione Ekstraselular dan Status Sistein Redoks dalam Autisme. Tabel 3 menyajikan konsentrasi relatif GSH, GSSG G SH / GSSG,% teroksidasi GSH, sistein, sistin, dan sistein / sistin rasio redoks di kompartemen plasma ekstraseluler. Anak autis menunjukkan penurunan yang signifikan konsentrasi ekstraseluler GSH (~ 21%) dan GSH/GSSG (~ 54%) dan peningkatan konsentrasi GSSG dan persentase glutation teroksidasi (52% dan 82%, resp, P <0,001. ). Gambar 1 (a) dan 1 (b) membandingkan GSH/GSSG dan % ekuivalen glutation teroksidasi , masing-masing, dalam plasma, sel T, dan monosit dari kasus dan anak-anak kontrol dan grafis menunjukkan penurunan yang konsisten di kedua ekstraseluler dan intraseluler Status redoks antara glutation anak-anak kasus.
Konsentrasi sistin, bentuk teroksidasi dari sistein, secara signifikan meningkat 52%, sedangkan perbandingansistein / sistin redoks secara signifikan menurun 31%dalam plasma dari anak autis. nilai Ehuntuk sistein juga dapat dihitung dari persamaan Nernst (lihat di atas) dimana E0untuk sistein sama dengan -250 mV .Nilai Eh yang terhitunguntuk sistein pada anak dengan autisme adalah -106 mV, atau 5 mV lebih teroksidasi daripada nilai Ehkontrolyakni – 111Mv. 3.4 Peningkatan produksi radikal bebas pada anak dengan autisme
Jumlah radikal bebas intraseluler anakautisdiukur dari PBMC yang terdapatpada anak autis (n-=15) dananak control yang tidakterpengaruh (n=16)menggunakan DCF, sebuah ROS / RNS-sensitif probe neon.Monosit dan limfosit terpisahkankarenasifat menghamburkan cahayanya(ukuran dan densitas) dan dapatdianalisis secara terpisah. Gambar 2 menyajikan intensitas fluoresensi median (LKM) limfosit dari anak autis dan anak-anak kontrol tidak terpengaruh (dinormalkan untuk LKM dari persiapan PBMC standar). Limfosit gated dari anak autis menunjukkan tingkat rata-rata jauh lebih tinggi dari radikal bebas intraseluler dibandingkan dengan limfosit dari anak-anak kontrol (p< 0,05) Tidak ada perbedaan dalam produksi radikal bebas yang diamati pada monosit dari anak-anakkasus autism dan anak-anak kontrol. Dalamhalini, Produksi radikal bebas intraselular tidak berhubungan dengan usia atau gender. 4.DISKUSI Stres oksidatif secara umum didefinisikan sebagai ketidakseimbangan antara produksi oksidan dan mekanisme pertahanan antioksidan endogen dan dapatditemukanpada orang dengan penurunan status redoks GSH / GSSG dan sistein / sistin tiol / disulfida pasangan redoks. Keseimbangan relatif antara kelompok sulfhidril kurang dan dengansulfhidrilteroksidasi didefinisikan keadaan redoks ambien. Rendahnya glutation Status redoks telah dikaitkan dengan patofisiologi gangguan neurobehavioral, beberapa diantaranyatermasuk skizofrenia,gangguan bipolar, alkoholisme, HIV
dan penyakit
Alzheimer. Ini adalah penelitian pertama untuk mengevaluasi antioksidanglutation intraselularyang dimediasi redoks dalam sel primer dari anak autis serta plasma ekstraseluler sistein / status redoks sistin. Karena kedua sistem redoks inisudah diatur, makaevaluasi dari kedua pasangan redoks inidapatmemberikan
gambaran
lengkap
sel
imunprimer
darikekebalan
pada
anak
autis.Untukmendukung dan memperluas temuan kami sebelumnya tentangpenurunanplasma dan sel limfoblastoid GSH / GSSG, kami sekarang melaporkan bahwa kedua sel imun primer GSH / GSSG dan plasma sistein / sistin pasangan redoks sama-sama dikompromikan menghasilkan lingkungan mikro sel lebih teroksidasi kekebalan tubuh pada anak dengan autisme dibandingkan untuk mengendalikan anak-anak
Bukti terbaru mendukung gagasan bahwa fluktuasi halus dalam ambient status redoks dapat memberikan suatu mekanisme pengaturan penting yang secara dinamis dapat mengatur fungsi dari sel kekebalan tubuh. Aktivasi dan proliferasi dari sel T membutuhkan pengurangan
lingkungan
mikro
teroksidasi mendorong
penghentian
stimulasi kekebalan
tubuh.
intraseluler, siklus sel dan Sebagai
sedangkan lingkungan menumpulkan
contoh,
yang
respon terhadap
sebuah mekanisme yang
melibatkan modulasi redoks ekstraselular oleh pengaturan sel T (Tregs) yang baru-baru ini dijelaskan oleh Yan et al. Tregs yang ditampilkan untuk menghambat pelepasan dari sistein ke dalam imun sinaps diantara sel – sel dendritik dan sel T ¨ na ive , yang secara
efektif mengurangi kadar GSH dalam sel T dengan mengeliminasi kecepatan pembatasan asam
amino untuk
sintesis GSH.
Rasio
menjadi glutasi teroksidasi adalah dibutuhkan untuk sel dari fase G1 ke S
dan induksi dari
yang tinggi dikurangi
perkembangan
respon sel
T proliferasi.
siklus
Dengan
demikian,
semakin teroksidasi GSH / GSSG redoks dari glutasi intraseluler di PBMC dan diaktifkan sel T
CD
4
yang
diamati pada
anak
menyarankan fenotipe hyporesponsive yang dan proliferasi.
Sejalan
dengan autisme (Tabel
kurang kondusif
dengan hipotesis
2) akan
untuk sel
ini, beberapa
studi
T aktivasi terbaru telah
mendokumentasikan kelainan pada respon imun adaptif pada anak autis. Defisit glutasi dalam
sel
T telah
terbukti negatif mempengaruhi
adaptasi
respon kekebalan tubuh dan sel T proliferasi dengan mengurangi pergantian reseptor IL2 dan
IL-2-bergantung sintesis
DNA.
lingkungan intraseluler teroksidasi telah
Dalam monosit,
terbukti mengubah profil
sitokin dan
condong terhadap keseimbangan Th1 dan Th2. Studi pada tikus telah menunjukkan bahwa kandungan GSH intraseluler
dari sel antigen
(APC) mengubah pola sitokin respon Th1 dan
Th2
presentasi
secara
reversibel.
Secara
khusus, defisit GSH mengurangi Th1 terkait produksi IFN-γ dan Th2-terkait produksi IL-4 berlebihan. Perbaikan GSH mengembalikan Th1 respon sitokin dan normalisasi respon Th2. Sejalan dengan pengamatan ini, dua studi telah melaporkan bahwa subpopulasi di PBMC dari anak
autis bergeser
ke
arah
dominasi T
sel T Helper Helper 2
(Th2).
Selanjutnya, penurunan ekspresi reseptor sel T IL-2 telah dilaporkan berhubungan dengan penurunan respon proliferasi setelah rangsangan mitogen pada anak autis. GSH / GSSG status redox teroksidasi berlebihan dalam plasma dan sel-sel kekebalan tubuh
primer pada
mekanis untuk
anak
adaptasi
dilaporkan pada
dengan autisme (Gambar 1)
abnormal
dari
respon kekebalan
anak-anak.
melebihi kapasitas redoks glutasi,
dapat memberikan penjelasan
Ketika
sel – sel
tubuh yang
sebelumnya
stres oksidatif intraseluler
mengeluarkan
GSSG ke plasma sebagai
mekanisme untuk memulihkan homeostasis redoks internal. Konsentrasi GSSG meningkat pada PBMC (Tabel
2) menunjukkan bahwa
kapasitas antioksidan intraseluler tidak homeostasis redoks intraseluler anak-anak.
Hubungan
dan bahwa
antara lingkungan
mekanisme pengeluaran GSSG dan
mencukupi
untuk mempertahankan
ketidakseimbangan redoks adalah kronis pada mikro sel kekebalan
tubuh
yang
lebih
teroksidasi dan adaptasi yang abnormal menjamin kelanjutan penyelidikan terutama pada
penerangan dari potensi pengembalian dari disfungsi kekebalan tubuh dengan target penatalaksanaan untuk meperbarui homeostasis redoks. Perhitungan nilai Eh untuk GSH ekstraseluler dan kolam sistein (Tabel 3) dalam populasi kontrol kami agak berbeda dari nilai-nilai yang dipublikasikan sebelumnya. Pada orang
dewasa, glutation plasma Eh lebih berkurang sekitar -137 mV, dan sistein
plasma pasangan
redoks lebih teroksidasi di-80 mV.
mencerminkan perbedaan
Perbedaan
metodologi dalam
ini mungkin persiapan
sampel yang kami deteksi elektrokimia tidak memerlukan derivatisasi untuk deteksi. Hal ini juga
mungkin bahwa
anak-anak (usia 3-10 tahun) mungkin
memiliki
kapasitas kurang pereduksi dari yang dilaporkan sebelumnya pada orang dewasa(usia 2535 tahun). Meskipun demikian, kami menghitung nilai Eh yang konsisten dengan laporan sebelumnya bahwa sistein plasma Eh (-111 mV) lebih teroksidasi daripada GSH(-128 mv).
gambar 2 : Radikal Bebas intraselular yang meningkat pada Limfosit pada Anak-anak dengan autisme. Radikal bebas intraselular diukur dalam PBMC yang baru diisolasi dari anak autis dan anakanak tidak
terpengaruh kontrol menggunakan
adalah intensitas fluoresen median
(MFI)
1 DCF uM. dari
Disajikan
populasi limfosit gateddari
sampel subjek dinormalisasi untuk MFI dari persiapan PBMC standar juga diobati dengan 1 DCF uM dan dianalisis dengan setiap sampel subjek. Limfosit dari anak autis menunjukkan tingkat ratarata jauh lebih tinggi dari radikal bebas intraseluler daripada kontrol (P = 0,04). Kontrol ratarata (95% CI) = 0,576 (0,551-0,640); kasus rata-rata (95% CI) = 0,689 (0,561-1,086).
