INMUNIZACIÓN DE ANIMALES La Inmunización es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un inmunógeno. El tipo y magnitud de la respuesta producida se deben a múltiples variables entre ellas se encuentra: la inmunogenicidad de un antígeno, que depende de su complejidad estructural, peso molecular, conformación y naturaleza química, dosis, vía de administración etc. La síntesis de anticuerpos (Ac) es dirigida contra moléculas específicas que el organismo no reconoce como propias (determinantes antigénicos), para que esta síntesis ocurra, primero debe existir un contacto entre las células presentadoras de antígeno y el determinante antigénico, contacto que es mediado por algunas células involucradas en la respuesta celular (linfocitos T y B). Como resultado se induce una respuesta inmunológica. Cuando un organismo se expone a un antígeno desconocido, el sistema inmune puede requerir mucho tiempo para producir cantidades apreciables de anticuerpos, los se detectan en el suero a partir del dia de inmunización (fase lag), incrementa su producción (fase log) hasta llegar a un máximo (meseta) Al final de la infección la concentración alcanzada de anticuerpos declina. A tal respuesta se le llama primaria. La parte más reconocible de inmunoglobulina es IgM. Cuando el organismo se expone posteriormente al antígeno, la respuesta ocurre mucho más rápido (la fase lag disminuye) y la concentración alcanzada, es apreciablemente mayor, en este caso se habla de respuesta secundaria. La parte más reconocible en este caso es la inmunoglobulina IgG. Esta parte reconocible del Ac refleja la diferencia en la ruta de inmunización y la naturaleza del inmunogeno. Un mismo antígeno puede no tener la misma inmunogenicidad en diferentes especies de animales, ya que depende de las características genéticas, la edad y el sexo del individuo inmunizado. La dosis del inmunogeno es un factor importante para lograr una respuesta inmunológica, ya que cantidades excesivas o minimas del antígeno pueden inducir el fenómeno de tolerancia (estado de no respuesta de a un antígeno en particular). El estado físico del antígeno debe tomarse en cuenta para designar la ruta de inmunización, es decir, los antígenos particulados preferentemente son introducidos al organismo por vía intravenosa, mientras que los antígenos en solución pueden introducirse por diversas vías, como intramuscular, intraperitoneal, subcutánea e intradérmica. En estas dos últimas se utiliza preferentemente el antígeno acompañado de un inmunopotenciador o adyuvante. Estos actúan inespecíficamente para incrementar la respuesta inmune específica a un antígeno dado. Los adyuvantes pueden actuar a través de la retención y liberación del antígeno. El adyuvante más utilizado en animales de experimentación es el de Freund.
ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS Son sustancias inmunomoduladoras que constituyen una familia muy heterogénea si se toman en consideración su origen, naturaleza química y actividad biológica específica; Como los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2 funciones fundamentales: la estimulación de la resistencia no específica del huésped contra las enfermedades infecciosas y el cáncer; y, por otra parte, la potenciación de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunización experimental con vistas a la producción de antisueros.
Los adyuvantes son sustancias o preparados que incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos. El aumento de la inmunogenicidad puede estar mediado por uno o varios de los siguientes procesos: a) Incremento de la producción de anticuerpos específicos frente a un antígeno vacunal. b) Aumento de la afinidad de los anticuerpos inducidos con una potenciación de su función neutralizante, germicida, opsonizante etc. c) Incremento de la magnitud y/o efectividad de la respuesta mediada por células T d) Generación de una respuesta humoral y/o celular de mayor duración. e) Generación de una respuesta incrementada de memoria inmunológica. Los principales adyuvantes son:
ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: es una emulsión estabilizada de aceite no metabolizable en agua. Las emulsiones tienden a producir concentraciones más altas y duraderas de anticuerpos.
ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: es igual que el incompleto pero contiene bacterias atenuadas de Mycobacterium tuberculosis. Este produce granulomas y es muy irritante, por lo que no está indicado para su uso en el ser humano.
ALUMN: compuesto de aluminio (fosfato o hidróxidos) y es el más utilizado en el hombre. Para incrementar la estimulación no específica, se asocia en ocasiones a bacterias muertas de Bordetella pertussis. Si se emplea estas bacterias no se puedeinyectar por vía intravenosa, pero si por el resto de las vías de inmunización.
VIAS DE INMUNIZACIÓN La elección de la vía de inmunización va a depender de varios factores: cantidad que hade administrarse, Solución en la que a resuspenderse o diluirse el inmunógeno y qué otros componentes se han asociado (por ejemplo la B. pertussis no puede inocularse por vía intravenosa) y la rapidez o velocidad a la cual el inmunógeno debe ser liberado a los vasos linfáticos y a la circulación. Las principales vías de inmunización son: •Subcutánea: es muy fácil de realizar y permite inocular volúmenes grandes, pueden administrarse en sucesivas veces. •Intramuscular: el antígeno se libera lentamente, el volumen a inocular varía en función del tamaño del animal. •Intradérmica: es más difícil de realizar y permite inyectar volúmenes reducidos. •Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberación rápida del antígeno en el ratón, la inyección se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola) •Nódulos linfoides: empleada principalmente en el campo de la investigación, se realiza en raras ocasiones Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeños (cobaya, ratón, rata, hámster, etc.) permite inocular una grandes volúmenes en ratones, no está recomendada para conejos.
Excepto inmunógenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que sólo deben inyectarse vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, el resto (proteína solubles, insolubles ,carbohidratos y ácidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa además de las vías anteriores.
ASPECTOS DEL ANTIGENO, DEL ANIMAL DE EXPERIMENTACION Y METODOS DE INMUNIZACION QUE AFECTAN LAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS. El desarrollo de la respuesta inmune se ve afectado por numerosos procesos que dependen del propio hospedador, del agente patógeno o del medio externo. Factores intríns ecos
La especie animal es un factor fundamental en la respuesta inmune, pero dentro de ella se pueden observar grandes variaciones debidas a otros factores intrínsecos. a) Individuo: depende de las características genéticas, la edad y el sexo. b) Estado fisiológico: Reproducción: En adultos, el sistema inmune se ve gravemente comprometido en la maduración sexual y durante la época reproductiva, momento en el que se da una conjunción de factores que afectan negativamente a las defensas del organismo. c) Estrés: El estrés es una respuesta adaptativa del organismo que produce cambios en el sistema de defensa, pero que cuando es muy agudo o prolongado en el tiempo conlleva la supresión de la respuesta o un desarrollo desmesurado de la misma, lo que puede desequilibrar al resto de sistemas fisiológicos y desencadenar el desarrollo de enfermedad. La primera respuesta del organismo frente a un factor estresante, es la liberación de corticosteroides, siendo el cortisol su principal componente. Dependiendo de la naturaleza, intensidad y duración de los factores estresantes, los efectos en la resistencia a la enfermedad pueden ser completamente diferentes
Aspectos del Antígeno: Las respuestas inmunitarias son inducidas por los antígenos. Por ello, encontramos varios factores que afectan a la regulación de estas respuestas: • Naturaleza del antígeno: Las bacterias extracelulares, los productos bacterianos, y en general los antígenos solubles suelen inducir principalmente una respuesta humoral. Ahora bien, los antígenos polisacarídicos y lipídicos, al no poder ser ligados al MHC, no son presentados a los linfocitos T H restringidos por el MHC propio (aunque como dijimos, recientemente se ha comprobado que al menos algunos lípidos de micobacterias pueden ser asociados con moléculas CD1 y presentado a linfocitos T) por lo que no hay respuesta celular, sino que generan producción de IgM, sin memoria inmunológica ni maduración de la afinidad (respuesta humoral timoindependiente). Los patógenos intracelulares provocan sobre todo respuesta celular. Si los parásitos no logran ser eliminados, pueden aparecer patologías Cuando el antígeno es eliminado, las células T y B vuelven a reposo, por lo que el sistema inmune va disminuyendo la intensidad de su respuesta.
• Dosis de antígeno: una dosis excesiva o mínima puede generar un respuesta de “no respuesta” o tolerancia. • Competencia de antígenos: La presencia de un antígeno determinado es una mezcla de antígenos puede provocar una gran disminución de la respuesta inmune a estos otros antígenos. Esto puede ocurrir incluso entre epitopos de una misma molécula antigénica. La posible explicación estriba en la competencia entre distintos péptidos procesados (de distintas moléculas o de la misma) por unirse al surco de las moléculas MHC, de modo que el péptido más inmunodominante se une a casi todas las MHC disponibles, evitando la unión de otros péptidos; ello evita la activación de células T que reconocen esos otros péptidos Cuando el antígeno es eliminado, los linfocitos B y T vuelven a una situación de reposo y la respuesta inmune va disminuyendo de intensidad.
Aspectos del método de inmunización: • Subcutánea: es muy fácil de realizar y permite inocular volúmenesgrandes, pueden administrarse en sucesivas veces. Intramuscular : el antígeno se libera lentamente, el volumen a inocular varía en función deltamaño del animal. •Intradérmica: es más difícil de realizar y permite inyectar volúmenes reducidos. •Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberación rápida delantígeno en el ratón, la inyección se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola). Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeños (cobaya, ratón, rata,hámster, etc.) permite inocular una grandes volúmenes en ratones, no está recomendada para conejos. •
Métodos de purificación de proteínas: El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están: Lisis celular: Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura. Destrucción mecánica: Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido). Congelación-descongelación: La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC). Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción para solubilizar las proteínas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende
purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice.
Métodos cromatográficos para separación de proteínas: Las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias de carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. Uno de los métodos más habitualmente utilizados para la separación de proteínas es la cromatografía en columna, aunque también existe la cromatografía en papel y en placa. La columna está rellena con un material sólido con las características químicas adecuadas (fase estacionaria), y una solución tamponada se hace pasar a través de la columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de afinidad por la fase estacionaria. Existen distintos tipos de cromatografías en tres ellos: La filtración o exclusión molecular, El cromatografía de intercambio iónico , La cromatografía hidrofóbica, La cromatografía de afinidad.
Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular: La fase estacionaria esta constituida por partículas de polímeros de diferente porosidad. La separación se basa en el tamaño de las partículas. Las proteínas más grandes que no pueden penetrar en los poros de las partículas de la matriz de filtración son eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran por los poros de las partículas y siguen un camino más tortuoso y más largo. El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a proteínas por debajo de un determinado peso molecular.
Cromatografía de intercambio iónico: En ella, la columna está rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercambiador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl), de esta forma se eluyen primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas.
Cromatografía hidrofóbica: Se trata de un método similar al anterior con la única diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los resto de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este tipo tenga en su superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.
Cromatografía de afinidad: Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertas moléculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se aplica a la columna, la proteína
buscada se unirá al ligando inmovilizado mientras que las demás saldrán de la columna con el tampón.
Dialisis: utiliza un gradiente de concentración para forzar la difusión de moléculas de bajo peso molecular a través de una membrana semipermeable.
Centrifugación diferencial: después de la homogenización las células se someten a centrifugación diferencial, la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad. Si la proteína deseada no se consigue, entonces la velocidad aumenta para separar las mitocondrias y asi hasta obtener las proteínas deseadas para la investigación.
Precipitación por sales: utiliza sulfato de amonio para separar proteínas por salazón debido a que el sulfato de amonio es una sal divalente, son necesarias una mayor cantidad de moléculas de agua para solvatar los iones de sal presentes. De esta maneraexiste una menor cantidad de moléculas de agua disponibles para interactuar con la proteína y las interacciones proteína-proteína aumentan y la hacen precipitar.
Electroforesis: se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. El soporte para la electroforesis es un polímero de agarosa o acrilamida
