PRÁCTICA DE LABORATORIO No. 5 EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO Carlos Alberto Coronado Pinilla Nicolás Perilla Barbosa Profesor: Luis Eduardo Díaz Fecha: 29 de octubre de 2014
Código: 201313054 Código: 201312912
Ingeniería Química Ingeniería Química
RESUMEN Los lípidos son biomoléculas caracterizadas por su insolubilidad en solventes polares, especialmente el agua, sin embargo muchos tienen un carácter anfótero. Estos compuestos están presentes en alimentos y son consumidos para aumentar las reservas de energía. De acuerdo con lo anterior, en esta práctica se extrajeron tres lípidos de la yema de huevo: triglicéridos, colesterol y fosfolípidos. Para la extracción de estos se recurrió a la técnica de cromatografía en columna utilizando solventes de diferente polaridad y las fracciones recogidas fueron corridas en la cromatografía de capa fina. ABSTRACT Lipids are biomolecules characterized by their insolubility in some polar solvents, especially in water, nevertheless many have an amphoteric character. These compounds are present in foods and are consumed to increase energy reserves. According to the above, in practice three lipids were extracted egg yolk: triglycerides, cholesterol and phospholipids. For the extraction of these column chromatography technique was used through solvents of different polarity and the collected fractions were run on thin layer chromatography.
Palabras clave: Colesterol, cromatografía, fosfolípidos, triglicéridos, polaridad. OBJETIVOS
Extracción de tres lípidos presentes en la yema de huevo a través de cromatografía en columna Caracterización Caracteri zación de los lípidos mediante la cromatografía en capa fina y comparación con muestras de aceite de pescado y lecitina de soya. calidad-precio y ser ingrediente básico y versátil a nivel culinario. Un huevo está formado, básicamente, por una yema central (31%) rodeada por el albumen o clara (58%) y todo ello envuelto por una cáscara externa (11%). El huevo tiene
INTRODUCCIÓN
El huevo es un ingrediente habitual en la alimentación del hombre desde su origen. Se caracteriza por su alta densidad nutritiva, una excelente relación 1
unos contenidos moderados en calorías y ácidos grasos (AG) saturados.
grasos, los cuales provienen de fuentes de carbono e hidrógeno.
El huevo contiene aproximadamente un 11% de fracción grasa (6 g por huevo de 60 g) depositada exclusivamente en la yema. De la cual un 66 % son triglicéridos, un 28% son fosfolípidos y un 5 % colesterol. Es remarcable el alto nivel de fosfolípidos del huevo que representan, aproximadamente, 2 g por huevo y destaca la presencia de fosfatidilcolina o lecitina. Las vitaminas liposolubles y los carotenoides forman parte de un 1 % de los lípidos de la yema. En cuanto al colesterol, el contenido medio es de 385 mg por 100 g de huevo entero (210 mg en un huevo de unos 60g) y está depositado en la yema (Barroeta A., 1993).
Un compuesto anfipático contiene regiones polares y regiones no polares. Cuando una molécula de dicho compuesto es mezclada con agua, un solvente polar, la región hidrofílica interactúa favorablemente con el solvente y tiende a disolverse en el agua. Por otro lado las regiones apolares se disuelven fácilmente en disolventes de polaridad parecida (Nelson & Cox, 2005, págs. 52-53). Los compuestos lipídicos que se determinaran en la yema de huevo son: Fosfolípidos: Son los componentes principales de las membranas biológicas. Su característica común es que contienen un resto de ácido fosfórico esterificado con el grupo Sn-C-3 del glicerol. Debido a la presencia del residuo fosfatidato, a pH neutro los fosfolípidos tienen una carga negativa.
Los lípidos biológicos son un grupo de compuestos químicos muy diversos cuya su característica principal, no se cumple en todos los lípidos, es su insolubilidad en agua y pueden ser extraídos por solventes apolares (Nelson & Cox, 2005, pág. 343). Sus funciones biológicas son tan variadas como su química; los fosfolípidos y esteroles son principalmente elementos estructurales de membranas. Otros lípidos tienen un rol importante como cofactores enzimáticos, portadores de electrones, pigmentos absorbentes de luz, anclas hidrofóbicas para proteínas, “chaperones”
que
ayudan
a
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Triglicéridos: Los triglicéridos son los constituyentes principales de los aceites vegetales y las grasas animales. Los triglicéridos tienen densidades más bajas que el agua (flotan sobre el agua), y pueden ser sólidos o líquidos a la temperatura normal del ambiente. Cuando son sólidos
doblar
proteínas en la membrana y hormonas Las grasas y los aceites usados como forma de almacenamiento de energía en seres vivos son derivados de ácidos 2
se llaman "grasas", y cuando son líquidos se llaman "aceites". Un triglicérido, también llamado triacilglicérido, es un compuesto químico que consiste de una molécula de glicerol y tres ácidos grasos (Zamora, Antonio. Scientific physic, 2014).
disolventes de tipo apolar como puede ser por ejemplo, el cloroformo. En definitiva, el colesterol está formado por un centro, o núcleo de anillos bencénicos, una cadena de tipo alifática larga, radicales metilo, y un grupo –OH, el cual es fundamental para formar la parte hidrófila de la molécula de colesterol.
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Colesterol:
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El colesterol es un alcohol que se clasifica como esteroide, grupo que se encuentra formado por compuestos caracterizados por poseer una estructura molecular formada por cuatro ciclos que se encuentran condensados. El colesterol es una molécula de lípido que se encuentra en los tejidos y en el plasma sanguíneo del cuerpo, tanto de seres vertebrados como invertebrados. Las concentraciones más altas de esta molécula se encuentran en órganos como el hígado, cerebro, glándulas adrenales, medula espinal, la piel, etc.
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Para la caracterización de los lípidos utilizaremos la lecitina de soya y aceite de pescado. Lecitina: Es un fosfolípido, también conocido como fosfatildicolina. La lecitina puede encontrarse en gran concentración en la soya y en la yema de huevo. Aunque la lecitina es una sustancia grasa, actúa como agente emulgente, contribuyendo a la descomposición de las grasas y el colesterol.
En la molécula de colesterol podemos hacer referencia a una cabeza polar, formada por un grupo hidroxilo y una cola de tipo apolar que se encuentra formada por un ciclo de carbono con núcleos condensados y sustituyentes de tipos alifáticos. De esta manera, podemos decir que el colesterol es una molécula hidrofóbica, y bastante soluble en 3
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reacción, o bien eliminar las impurezas que lo acompañan en la mezcla de reacción, gracias a sus diferencias de solubilidad en el disolvente de extracción elegido.
Aceite de pescado: Los lípidos presentes en las especies de peces óseos pueden ser divididos en dos grandes grupos: los fosfolípidos y los triglicéridos. El Aceite de Pescado es una sustancia compuesta por ácidos grasos esenciales poliinsaturados, entre los que destaca el Omega 3. Este aceite posee escualeno y otros esteroles que ofrecen beneficios para la salud tales como: acciones antioxidantes y cardioprotectoras
Cromatografía en columna (CC): El principal objetivo de la extracción es separar selectivamente el producto de una reacción, o bien eliminar las impurezas que lo acompañan en la mezcla de reacción, gracias a sus diferencias de solubilidad en el disolvente de extracción elegido. Cromatografía capa fina (CCF): El principal objetivo de la extracción es separar selectivamente el producto de una reacción, o bien eliminar las impurezas que lo acompañan en la mezcla de reacción, gracias a sus diferencias de solubilidad en el disolvente de extracción elegido.
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Como se mencionó anteriormente los tres lípidos (colesterol, triglicéridos y fosfolípidos) se extraerán y se determinaran por 3 métodos los cuales son: Extracción, Cromatografía en columna (CC) y Cromatografía capa fina (CCF) los cuales se conceptualizaran a continuación.
Para revelar el TCL se utilizó una solución de sulfato de amonio al 20% por aspersión MATERIALES Solución NaCl 1 M, éter etílico, metanol / cloroformo (2: 1 en volumen), 5% de metanol en cloroformo, 9: 1 de éter de petróleo y éter etílico, cloroformo / metanol / agua (1: 3: 1 en volumen), cloroformo, columna empacada con 2ml de sílice gel en 4 ml de éter de petróleo, éter de petróleo / éter etílico / ácido acético (75: 25: 1 en volumen), cloroformo / metanol / ácido acético (65:25:10 en volumen), sulfato de amonio al 20%, pipeta Pasteur o gotero, tubos de centrifuga con tapa rosca de 15 ml., placas sílice gel, lecitina de soya, aceite
Extracción: La extracción con disolventes es la técnica de separación de un compuesto a partir de una mezcla sólida o líquida, aprovechando las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en un disolvente adecuado. Constituye una de las técnicas de separación de compuestos más utilizada en el laboratorio químico. El principal objetivo de la extracción es separar selectivamente el producto de una 4
de pescado, capilares, micropipetas de 1 mL, centrífuga, plancha de calentamiento, vórtex, pipetas de 5 y 10 mL, rota evaporador, crisoles, balanza analítica, cámara de extracción, papel aluminio, pinzas, probetas de 10 mL.
los 3 ml tomados de la dilución inicial. Lo anterior puede ayudar a estabilizar la dispersión ya que contiene proteínas, pero mucho menos de proteínas de la que inicialmente tendría si se toma la yema de huevo directamente, favoreciendo así una posterior extracción de lípidos.
Metodología
Extracción de lípidos
Para esta práctica, como se mencionaba en el marco teórico se utilizaron 3 métodos de separación los cuales fueron: extracción, separación por columna y cromatografía en capa fina. Esto con el fin de extraer las 3 grupos importantes de los lípidos que se encuentran en la yema de huevo utilizando como solvente metanol y cloroformo, separar fracciones de lípidos como triglicéridos, colesterol y fosfolípidos por medio de CC (cromatografía en columna) con una columna de gel sílice y finalmente analizarlas por medio de CCF (cromatografía capa fina).
Con la dispersión de lípidos de la yema de huevo en NaCl 1 M se mezclan 0,8 ml de esta dispersión con 3 ml de metanol/cloroformo (2:1) en un tubo de centrifuga de 15 ml con un tapón de rosca. Después de agitar el tubo, añadir 1 ml de NaCl 1 M y cloroformo. El tubo se tapa y se agita, luego se centrifuga brevemente para separar las fases. Después de retirar se desecha la fase superior acuosa, se pasa la fase inferior a un crisol previamente pesado, guardando 100 μL en un tubo de micro
centrífuga (solución A), de los cuales 5 μL se aplican a las placas de TLC (abajo). El disolvente de la solución presente en el crisol se elimina en la cámara de extracción con ayuda de un calentamiento suave. Cuando el residuo está seco se pesa el crisol. El residuo es el conjunto total de lípidos.
Para realizar las extracciones mencionadas anteriormente se deben preparar una dispersión de yema de huevo el cual se debe diluir la yema de huevo y agregar NaCl 1M hasta completar 80 mL, se mezcla bien y se extraen 3 mL de la mezcla, posteriormente se adicionan 190 mL de éter etílico. Se centrifugo a 8000 rpm por 30 minutos hasta lograr dos fases líquidas, con una fase intermedia delgada de material insoluble y se transfirió la fase superior amarilla al balón del rota evaporador. El Éter etílico de la fase orgánica se retira por evaporación rotatoria y los lípidos concentrados se dispersan en el mismo volumen de 60 ml de 1 M NaCl empleado inicialmente y se mezcla con
Cromatografía en columna Para separar las distintas fracciones de lípidos, se prepara una pequeña columna empacada con 2 mL de sílice gel en 4 mL de éter de petróleo en una jeringa con tapón de lana de vidrio en la parte inferior. Se disuelve el residuo extracción anterior en 2 ml de éter de petróleo y se vierte en la columna, guardando lo que sale inicialmente (solución que contiene algunas de triglicéridos) en un tubo previamente pesado. Para completar la 5
Cromatografía en capa fina
elución de los triglicéridos, se adicionan a la columna 9 ml de una mezcla 9: 1 de éter de petróleo y éter etílico, recogiendo el eluido en el mismo tubo anterior. El colesterol se eluye entonces en otro tubo previamente pesado usando 9 ml de 5% de metanol en cloroformo. Finalmente, para eluir por completo los fosfolípidos, se adicionan 9 ml de cloroformo / metanol / agua (1: 3: 1 en volumen) y se recoge en un tubo con tapa. A este tubo agregar 2 ml de cloroformo y 2 ml de 1 M NaCl para romper fases y deshacerse del agua (fase superior acuosa); la fase inferior orgánica se retira a un tubo limpio previamente pesado.
Se tienen dos placas de TLC (4x10 cm) por grupo (Merck Sílice Gel 60), y se aplican en cada placa las soluciones de A a D con ayuda de los capilares en la parte inferior de cada placa, junto con 5 μL de lecitina de soya y 5 μL de aceite
de pescado (de los que se comercializan encapsulados como suplemento alimenticio). Se desarrollan las placas en vasos de precipitados de 400 mL cubiertos con papel de aluminio que contienen 10 ml de mezclas de disolventes cloroformo / metanol / ácido acético (65:25:10 en volumen). La corrida se realiza hasta que la mezcla solvente alcance el 90% de la altura de la placa. Se deja retira la placa de los beakers y se deja evaporar la mezcla solvente. Los spots se revelan por aspersión, adición con gotero o pipeta Pasteur de sulfato de amonio al 20% sobre las placas, se retira el exceso de la solución de sulfato de amonio en caso de quedar muy empapada la placa, y luego se calienta durante un corto tiempo en una plancha de calentamiento a una temperatura no muy elevada.
10 μL de los eluidos de triglicéridos son
la solución B. 10 μL de los eluidos de colesterol son la
Solución C. 5 μL de los eluidos de fosfolípidos son la
Solución D. Estos se aplican a las placas de TLC para CCF. Después los disolventes de los eluidos se eliminan transfiriendo las soluciones B a D a crisoles secando con calentamiento suave en la cámara de extracción para luego pesar.
DATOS
Para los resultados obtenidos en la placa de TLC se hayo el respectivo rf (factor de retención) con la siguiente formula:
Tabla No. 1. Datos de pesos de los lípidos aislados durante la cromatografía.
=
6
() ( )
RESULTADOS Tabla No. 2. Factor de retención de las muestras en la cromatografía en capa fina.
Imágenes cromatografía en capa fina:
Nota: Nuestra placa la corrimos pero la no tomamos foto después de ser revelada, sin embargo calculamos los rf directamente sobre la placa.
ANÁLISIS De acuerdo a los resultados anexados en la tabla 1 de los pesos obtenidos de los lípidos extraídos nos podemos dar cuenta de que se obtuvieron más fosfolípidos que los demás, esto no era de esperarse debido a que según la literatura representa una cantidad grande pero no la mayor parte de la grasa total de la yema (2 g) debido a que los 7
triglicéridos son los que tienen mayor presencia en el huevo, sin embargo el resultado que obtuvimos fue bajo comparándolo con el de literatura, esto pudo deberse a que alguna parte de los fosfolípidos pudo ser arrastrados cuando se extrajeron las fracciones para colesterol y triglicéridos debido a que al hacer las mezclas de solventes de fase móvil también se agregaron sustancias tanto polares como apolares y como los fosfolípidos tienen tanto como un extremo polar como apolar esto sustenta la explicación anterior y produce que se pierda una cantidad considerable de este lípido.
encontrados a pesar de que constituyen cerca del 66% de las grasas encontradas en el huevo y segundo el dato esperado debería aproximarse a 6 g y resulto ser el dato más alejado, esto pudo haber ocurrido debido a que en los procedimientos anteriores se desechaban las fases superiores, ahí pudo haber ocurrido la mayor pérdida de este lípido, ya que es una perdida muy grande casi del 80% aproximadamente. Todo esto se comparó con el artículo El huevo y sus componentes como alimento funcional de A.C. Barroeta.
Podemos observar que la sustancia con mayor distancia recorrida fue el aceite de pescado, debido a que la moléculas del omega 3 y 6 presentan una larga cadena que distribuye la carga del grupo carboxilo a lo largo de ella. Por otro lado, el resultado de la lecitina de soya fue similar a uno de los sustratos separados de las soluciones C y D, correspondiendo a la de colesterol y fosfolípidos respectivamente; debido a que es un fosfolípido concuerda con su homólogo D. No obstante, la cromatografía en columna no fue efectiva pues se obtuvo una separación inefectiva donde se puede ver que el colesterol también pasó a la solución D.
Para el colesterol pudo haber ocurrido lo mismo debido a que como el fosfolípido tiene también una parte polar por el grupo hidroxilo y apolar por el grupo carbonado del otro extremo y al realizar la extracción de triglicéridos que fue la primera, una parte del colesterol se pudo ir junta con los triglicéridos, según la literatura en un huevo común de 60 g hay 210 mg de colesterol al compararlo con el resultado obtenido podemos darnos cuenta que perdimos una cantidad próxima a la mitad del colesterol que debíamos encontrar, pero debido a que no sabemos los datos exactos del huevo utilizado en la práctica no se puede hacer una correcta aproximación a los resultados.
CONCLUSIONES El proceso de extracción por cromatografía en columna fue poco efectivo debido a que al comparar lo obtenido con la literatura el resultado varía mucho a lo que debería aproximarse dando un dato muy pequeño.
Para los triglicéridos se esperó que el resultado sea el más exacto y el más alto debido a que es la primera extracción y es poco probable que se haya ido parte hacia otra fracción, pero cuando lo comparamos con los resultados de los lípidos y contra la literatura nos damos cuenta que; primero no es el peso más alto de lípidos
Es recomendable cambiar la proporción de solventes debido a que estas no 8
fueron efectivas extracción.
para
una
óptima
A.C. Barroeta. El huevo y sus componentes como alimento funcional.
Departament de Ciència Animal i dels Aliments. Universitat Autònoma de Barcelona. 1993. Bellaterra, Barcelona.
En la cromatografía de capa fina se obtuvo un comportamiento esperado debido a la polaridad de las moléculas de los lípidos.
Takehiko Yamamoto, Lekh Raj Juneja, Hajime Hatta, Mujo Kim. Hen Eggs: Basic and Applied Science. Pags 73-83. CRC press LLC. 1997. Link: (http://books.google.com.br/books?hl=es &lr=&id=fLmAYGxmTfIC&oi=fnd&pg=PA 73&dq=egg+yolk+lipids&ots=NzvmNYSh SJ&sig=AJA53iadVWsrfU4GKiLfKUfuVs#v=onepa ge&q=egg%20yolk%20lipids&f=false)
BIBLIOGRAFÍA
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