Manipulación y manejo de ratones (Mus musculus), observación de estructuras internas, macrófagos alveolares, intraperitoneales, médula ósea y esplenocitos estimulados con tioglicolato. Universidad de las Fuerzas Armadas – ESPE. Departamento de Ciencias de la Vida Carrera de Ingeniería en iotecnología Inmunología !a"riela Sevillano #$ de marzo de %#&'
RESME! (a presente pr)ctica se llev* a ca"o usando ratones + Mus musculus, un animal animal -)cil de manipular mu utilizado para e/perimentos de la"oratorio. Para esto se necesita conocer los reglamentos necesarios para una manipulaci*n correcta0 la -orma de administraci*n peritoneal e intrad1rmica0 adem)s de los m1todos de necropsia para o"tener macr*-agos esplenocitos. (os macr*-agos son c1lulas mononucleadas 2ue se caracterizan por su capacidad de -agocitar degradar material particulado0 los esplenocitos esplenocitos son c1lulas 2ue se encuentran en el "azo0 constituen la primera línea de de-ens de-ensaa contra contra agent agentes es e/tra e/tra3os 3os contro controla lann proces procesos os degen degenera erativ tivos os elimin eliminand andoo c1lul c1lulas as anormales e in4i"iendo su divisi*n dentro del organismo. El presente tra"a5o tiene como o"5etivo manipular ratones mac4os de $ semanas0 para o"tener macr*-agos de lí2uido peritoneal0 alveolar de la m1dula *sea0 adem)s de esplenocitos del "azo para su posterior o"servaci*n en microscopio invert invertido ido conte conteoo celul celular ar emplea empleando ndo c)mar c)maras as de 6eu"ae 6eu"aerr0 respec respectiv tivame amente nte.. (os (os result resultado adoss o"tenidos demostraron la presencia de macr*-agos al estimular al rat*n con tioglicolato0 de esplenocitos0 de los cuales se realiz* un conteo mediante c)mara de 6eu"auer0 teniendo un total de %0%'/&# $ macr*-agos7ml en la m1dula *sea0 80#9/&# $ macr*-agos7ml en el lí2uido peritoneal 90:'/&# ' esplenocitos7ml del "azo
"alabras clave# ;acr*-agos0 esplenocitos0 Mus musculus.
$%S&R$'& <4is practice =as carried out using mice +;us musculus, eas to 4andle and ver animals used -or la"orator e/periments. For t4is =e need to >no= t4e regulations necessar -or t4e proper 4andling0 4o= to peritoneal and intradermal administration0 "esides autops met4ods -or macrop4ages and splenoctes. splenoctes. ;acrop4ages are mononuclear cells t4at are c4aracterized " t4eir a"ilit to p4agoctose and degrade particulate material0 splenoctes are cells -ound in t4e spleen0 and are t4e -irst line ode-ense against -oreign organisms and eliminating control degenerative processes and in4i"iting
a"normal cell division =it4in t4e organism. <4is paper aims to manipulate male mice o- $ =ee>s0 -or peritoneal macrop4ages0 alveolar -luid and "one marro=0 spleen plus splenoctes -or -urt4er o"servation inverted microscope and cell counting using cameras 6eu"aer0 respectivel. <4e results o"tained s4o=ed t4e presence o- macrop4ages " stimulating t4e mouse t4ioglcolate0 and splenoctes0 o- =4ic4 a count =as per-ormed using a 6eu"auer c4am"er0 4aving a total o- %0%'/&#$ macrop4ages 7 ml in t4e "one marro=0 macrop4ages 80#9/&#$ 7 ml in peritoneal -luid and 90:'/&#' splenoctes 7 ml spleen.
eyords# macrop4ages0 splenoctes0 Mus musculus.
*. +!&R-''+! (os modelos e/perimentales son 4erramientas "iol*gicas 2ue en los ?ltimos a3os -acilitan el conocimiento de los procesos naturales patol*gicos. En las primeras -ases de e/perimentaci*n se implementa el uso de animales de la"oratorio0 los cuales son utilizados como instrumentos de investigaci*n cientí-ica +P1rez0 %##:,. Un animal de la"oratorio es a2uel 2ue es engendrado producido "a5o condiciones controladas0 mantenido su entorno controlado como la alimentaci*n0 am"iente0 antecedentes micro"iol*gicos gen1ticos conocidos e/iste una compro"aci*n sistem)tica de estos antecedentes +Instituto 6acional de Salud0 %##9,. (os animales de"en ser mane5ados adecuadamente para poder realizar di-erentes m1todos como los siguientes@ administraci*n de su"stancias las cuales pueden ser por varias vías como su"cut)nea0 intravenosa0 intrad1rmica0 intraperitonial0 intramuscular0 entre otras +Fuente0 %#&#,. (a elecci*n de la vía depende del o"5etivo de la investigaci*n 2ue se va a realizar el uso
de sustancias de administraci*n de"en ser apropiadas para la vía elegida puesto 2ue estos incluen solu"ilidad0 viscosidad0 p0 pureza esta"ilidad las cuales pueden a-ectar al rat*n por lo 2ue antes de inectar la sustancia de"e conocerse lo 2ue esta tieneB la a"sorci*n de la misma depende de estas características incluidas la vías de administraci*n +;ort*n0 %##&,.
*.*.
M$'R/$0S
(os macr*-agos son c1lulas mononucleadas 2ue se caracterizan por su capacidad de -agocitar degradar material particulado0 presentan características como@ son c1lulas -usi-ormes o estrelladas0 2ue poseen una gran plasticidad de 8## micras de di)metro0 tienen un n?cleo arri3onado0 tienen cromatina la/a0 su citoplasma es acid*-ilo0 emiten pseud*podos0 sus org)nulos est)n desarrollados o no seg?n la actividad de la c1lula0 tienen ac?mulos de gluc*geno vacuolas lipídicas en el citoplasma0 sintetizan li"eran interleu2uina& +I(&,0 -actor de necrosis tumoral +<6F,0 -actor de crecimiento de -i"ro"lastos+F!F,0 interleu2uina$0 -actor pir*geno0 pero/idasas0 lisozima0 4idrolasas +Universidad Cat*lica de C4ile0 %#&8,.
(os macr*-agos alveolares +;A, son las c1lulas presentadoras de antígenos m)s a"undantes en las vías a1reas espacios alveolares0 donde 5uegan un rol importante en la regulaci*n del sistema inmune en cuadros de in-lamaci*n. El macr*-ago tiene su origen en las c1lulas germinales pluripotenciales +C!p!;, de la m1dula *sea +(am"rec4t0 %##$,.
*.1 ES"2E!'+&S (os esplenocitos son c1lulas mononucleares -agocitarias presentes en el seno del "azo0 2ue identi-ican agentes e/tra3os 2ue ingresan
al organismo los destruen por lo 2ue los estas c1lulas constituen una de las líneas de de-ensa del organismo contra in-ecciones +oitt et al0 %##9,. Para la o"tenci*n de esplenocitos es necesario sacri-icar los ratones mediante dislocaci*n cervical0 seguida de la e/tracci*n del "azo0 est) se de"e realizar con cuidado "a5o condiciones de esterilidad0 para ma/imizar los niveles de "ioseguridad0 la e/tracci*n se realiza empleando ca"ina de -lu5o laminar. El *rgano es depositado en una ca5a de Petri con medio P;I suplementado con suero -etal "ovino +SF, al &#. (a per-usi*n de los "azos se realiza con 5eringa en condiciones de esterilidad 4asta o"tener m)s del G# del contenido celular. (os esplenocitos mononucleares se separaran con gradiente de densidad +Si>oraHSmedle0 %###,. Por lo cual el presente estudio pretende realizar la o"tenci*n de macr*-agos esplenocitos a partir de -luidos peritoneales0 alveolares de la m1dula *sea0 adem)s del "azo respectivamente0 mediante la utilizaci*n de diversas t1cnicas de ratones in vivo.
3. ME&-204$ 3.* Material %iológico Se o"tuvieron ' ratones mac4os de $ semanas de edad0 de la tienda >pet u"icada en el arrio San Vicente0 Juito – Ecuador. Se las mantuvo ma5o condiciones controladas de alimentaci*n0 su dieta consta"a de zana4oria0 gelatina sin sa"or agua.
3.3. Manejo y manipulación de los ratones
Para el mane5o de los ratones se realiz* una su5eci*n con una mano0 se sac* al rat*n del vaso de precipitaci*n tom)ndolo de la cola se lo apo* en una re5illa0 se estir* la cola 4acia atr)s0 posteriormente se agarr* un pliegue de la piel en la parte trasera del cuello con los dedos pulgar e índice. (uego se gir* la mano 4acia adelante coloc)ndose al rat*n con su lado ventral 4acia arri"a -inalmente se su5et* la cola. (a ca"eza el cuerpo se colocaron en una posici*n recta c*moda de espaldas apoada en la palma de la mano. +Imagen &,.
/igura *. ;ane5o manipulaci*n del rat*n +(lamuca0 %#&', 3.1. +nmuni5ación (a inmunizaci*n se realiz* a los # días0 se realiz* una simulaci*n de inmunizaci*n con #0% m( de PS &K administrados a los ratones por vía intraperitoneal. Despu1s de &# minutos se realiz* la inmunizaci*n inoculando #0% m( de medio tioglicolato por vía intraperitoneal como se o"serva en la imagen %.
/igura 3. Administraci*n de tioglicolato por vía intraperitonial. +(lamuca0 %#&', 3.6. btención y cultivo de los macrófagos en l78uido peritoneal Cinco días luego de la inmunizaci*n0 se sacri-icaron % ratones por dislocaci*n cervical0 se realiz* cortes en la piel para e/poner el )rea del peritoneo se us* medio &# ml de P;I para llenar toda la cavidad peritoneal realizar un lavado0 despu1s se recuper* el medio lí2uido con la misma 5eringuilla o"teni1ndose apro/imadamente 9ml0 ver imagen 80 luego se verti* el medio con los macr*-agos en una ca5a Petri se llev* la incu"aci*n en C% al '0 8:LC durante 4oras0 posteriormente se o"serv* los resultados en el microscopio invertido. A parte de la recuperaci*n de los macr*-agos se retir* los *rganos principales del rat*n entre ellos cere"ro0 intestino0 coraz*n0 pulmones "azo se midi* el tama3o de estos.
/igura 1. (avado de la cavidad peritoneal con medio P;I para o"tenci*n de macr*-agos. +(lamuca0 %#&', 3.9. btención de macrófagos de la médula ósea Se realiz* el corte del -1mur el peron1 del rat*n0 o"teni1ndose el 4ueso li"re de te5ido muscular0 a continuaci*n se cortaron las ca"ezas0 se colocaron en tu"os eppendorde %ml0 se llev* a centri-uga a &### rpm por &# min0 una vez o"tenido esto se retir* en so"renadante el pellet se mezcl* &ml de P;&0 se prepar* la disoluci*n con (UE <IPA6 &#Ml de muestraG#Ml del reactivo. S1 coloc* en la c)mara de 6eu"auer0 se o"serv* al microcopio *ptico.
3.:. btención de macrófagos alveolares Se procedi* a realizar una microcirugía tra2ueal0 siguiendo las consideraciones indicadas0 estas son la -i5aci*n del rat*n la super-icie0 el corte en la zona del cuello0 se identi-ic* la tr)2uea0 se inect* &ml de P;I0 despu1s se recuper* el medio lí2uido con la misma 5eringuilla0 a continuaci*n luego se verti* el medio con los macr*-agos en una ca5a Petri se o"serv* los resultados en el microscopio invertido.
/igura 6. Administraci*n de tioglicolato por vía tra2ueal. +(lamuca0 %#&', 3.;. btención de esplenocitos Para la o"tenci*n de esplenocitos se sacri-ic* % ratones por dislocaci*n cervical0 se recuper* el "azo se lo tritur* mec)nicamente con el pist*n de una 5eringa0 4asta o"tener pedazos pe2ue3os. Para puri-icar lo esplenocitos se utiliz* una gasa para -iltrar el lí2uido como se o"serva en la imagen . Posteriormente se centri-ug* el preparado por 9 minutos a &%## rpm se suspendi* el pellet en 'm( de medio P;I0 de"ido a 2ue e/iste contaminaci*n por gl*"ulos ro5os se a3adi* el "u--er lisis se realiz* aspiraci*n sucesivas por & min0 se volvi* a centri-ugar por &# minutos el pellet se resuspendi* en medio P;I0 se prepar* la disoluci*n con (UE<IPA6 &#Ml de muestraG#Ml del reactivo. S1 coloc* en la c)mara de 6eu"auer0 se o"serv* al microcopio *ptico. Para determinar la cantidad de esplenocitos se aplic* la siguiente -*rmula@ C =
¿ células x factor de dilución x 100000 ¿ cuadrículas x volumendeunmuestra
Para 4acer una estimaci*n real se multiplic*0 por el -actor de diluci*n & en � un volumen inicial de #0&.
Peso de ratones vs. Tiempo No. ratón A
!
" #
/igura 9.
Peso ratón (g) 15
5
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0
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% disminción
P$&' "
1. RES2&$-S
1"
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"6!06
152*
&abla. 1. esultados de las mediciones de cere"ro0 intestino0 "azo0 coraz*n pulmones.
&abla. *. esultado de datos individuales de supervivencia +, vs.
0 5 7 12
Tiemp o en días 0
&ediciones de ór+anos de ,os ratones No. $atón A
vivos (%) 5 3 3 0
100 60 60 0
&abla. 3. esultado de datos individuales de peso +, vs.
"
P$&'"
'strctr as ere*ro
Tamao (cm) 1!"
+ntestino
3#
,a-o
1!"
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0!
Pmone s ere*ro
1!$
+ntestino
36
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1!5
ora-ón
0!&
Pmone s ere*ro
1!" 1!1
+ntestino
35
1
,a-o
1!35
ora-ón
0!5
Pmone s
1!#5
&abla. 6. esultado del conteo de c1lulas de macr*-agos en diluci*n con trpan "lue.
5!5106
!
"!"510 6 1!5106
"
1 1#
/R2 4
A
"0 16
!,u,as/m,
$AT-N
Peso vs tiempo
1"
7i8ido peritonea /eda 7i8ido peritonea
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0
"
#
6
10
1"
1#
6000000 #000000
Numero de macroa+os "000000
&abla 6. Conteo de esplenocito por c1lulas7ml !,u,as/m,
$AT-N
$ATN'S
'4P7'N+ T4
'
0
1106 $!5105
0r
0r
4pervivencia de ratones (%) vs. Tiempo.
1000000 500000 Numero de esp,enocitos 0
,
6
$atones
# " 0
0
"
#
6
10
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0r
1#
0r
/igura ;. "servaci*n de macr*-agos alveolares en el microscopio invetido +
/igura 9. "servaci*n de macr*-agos m1dula *sea +(lamuca0 %#&',. (as c1lulas m)s oscuras representan a2uellas 2ue no son via"les.
/igura =. "servaci*n de esplenocitos en el microscopio invertido +!uerraHSevillano0 %#&',.
6. -+S'S+!
/igura :. "servaci*n del conteo de esplenocitos con trpan "lue en el microscopio *ptico realizada en la c)mara de 6eu"auer +(lamuca0 %#&',. (as c1lulas m)s oscuras representan a2uellas 2ue no son via"les.
(a variaci*n del porcenta5e en peso de cada rat*n en los &% días es evidente0 la tendencia de todos los ratones en transcurso de este tiempo -ue de disminuir de peso0 o"teni1ndose un porcenta5e promedio de disminuci*n de &' esto se de"e al cam"io de alimentaci*n a los 4)"itos alimenticios a la -alta de lí2uidos. Seg?n Juezada +%##9,0 el alimento para los ratones destinados a la e/perimentaci*n0 de"e ser colocado en cantidad calidad su-icientes para sus necesidades para conservar su saludB adem)s0 el acceso al alimento de"e ser li"re dosi-icado en "ase con los re2uerimientos0 minimizando la competencia por el alimento en caso de tener grupos de ratones por 5aula. (os ratones so"revivieron durante el transcurso de la investigaci*n. Seg?n roc>mann +%#&#,0 los ratones tienen un tipo
generacional mu corto0 son mu prolí-icos se adaptan -)cilmente a la vida en los "ioterios0 me5orando su capacidad de supervivencia0 adem)s de esta manera se pueden controlar las varia"les am"ientales en las e/perimentaciones. Se o"serv* 2ue los ratones al día &: presentaron in-lamaci*n del intestino delgado a nivel del Nleon0 adem)s de 4eces de color ro5izo. Seg?n Velasco0 +%#&%,0 la in-lamaci*n causada en el intestino delgado0 impide la a"sorci*n de componentes importantes de los alimentos0 raz*n por la cual se produ5o la perdida e/cesiva de peso. El da3o a la mucosa del intestino proviene de una reacci*n a la ingesti*n de gluten0 2ue se encuentra en el trigo0 la ce"ada0 el centeno0 posi"lemente la avena0 en alimentos ela"orados con estos ingredientes. Esto adem)s ocasiona la -alta de a"sorci*n de nutrientes de"ido a un da3o en las vellosidades intestinales. Por lo tanto0 los animales resultan desnutrida sin importar cu)nto alimento consuma. Este trastorno es m)s com?n en los organismos de raza "lanca. El -enotipo es un componente esencial para el desarrollo de modelos animales se determina por la interacci*n entre los -actores gen1ticos am"ientales0 de esta manera el peso corporal el desarrollo de los *rganos en ratones de la"oratorio presentan di-erencias signi-icativas cuando los animales son producidos en condiciones distintas +Fuentes0 %#&%,. En la
(a inoculaci*n con caldo mann +%#&#, dice 2ue la o"servaci*n de macr*-agos de"e realizarse despu1s de 4oras de incu"aci*n para visualizarlos de me5or manera se puede realizar tinci*n con guiensa. Al realizar el recuento de macr*-agos o"tenidos de la m1dula *sea se o"tuvo %0%'/&# $ macr*-agos7ml0 seg?n (am"rec4t0 +%##$,0 los macr*-agos tiene su origen en las c1lulas germinales pluripotenciales +C!p!;, de la m1dula *sea0 por esta raz*n se los pudo visualizar en la c)mara de 6eu"uer. El aislamiento de esplenocitos se lo realiz* del "azo del rat*n0 puesto 2ue este *rgano es en donde encontramos gran cantidad de este tipo de c1lulas0 seg?n ;artínez +%##9,0 los esplenocitos totales aislados mediante la misma t1cnica de esta pr)ctica0 da como resultado %'/&# $ esplenocitos7ml0 cuando se correlacion* este par)metro con los resultados o"tenidos en la pr)ctica0 el promedio de esplenocitos es de 90:'/&# ' esplenocitos7ml0 se o"serv* una gran di-erencia con los resultados de ;artínez +%##9,. Se de"e tomar en cuenta0 2ue el n?mero de esplenocitos por mililitro puede variar o ser a5ustado a una densidad celular especí-ica +Sierra0 %#&%,.
9. '!'2S+!ES
(os ratones -ueron mane5ados e inoculados de manera correcta0 evitando da3os tanto al operario como al rat*n el mínimo dolor. (a variaci*n de peso entre los di-erentes ratones0 se relaciona a la disponi"ilidad dosi-icaci*n del alimento0 adem)s de -actores am"ientales gen1ticos. (as longitudes de los di-erentes *rganos est)n relacionadas directamente al peso desarrollo del animal0 se de"e en gran parte0 a los -actores e/ternos introducidos por el 4om"re para estudios cientí-icos. El tioglicolato inoculado produce una in-lamaci*n dentro de la cavidad del peritoneo 2ue estimula aumenta la cantidad de macr*-agos del rat*n. El conteo de esplenocitos0 presenta un amplio margen de variaci*n0 la media de esplenocitos por mililitro es mu alta en relaci*n a la re-erencia de la cantidad e/traí"le con una misma t1cnica. (os macr*-agos se pueden encontrar tanto en el lí2uido intraperitoneales0 alveolos pulmonares m1dula *sea. Encontr)ndose 2ue e/iste una maor cantidad en las encontradas en los alveolos pulmonares.
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