UNAM Facultad de Estudios Superiores ZARAGOZA Análisis de Fármacos y Materiales Primas II Quinina materia prima, comparación con un estándar por fluorometría. Semestre: 5° Grupo: 2551 N° de Equipo: 1 Fecha: 13-Febrero-18 Elaboro informe:
Revisó informe
Villanueva Rosas Jesús Amauri
Olivares Mendoza Sigrid Z.
Aprobó informe
Calificaciones: Nombre Alumno Baños Grande Mariel Fabiola Olivares Mendoza Sigrid Z. Villanueva Rosas Jesús Amauri Villafuerte Jerónimo Aldo David
Evaluación
Experimental
Informe
Bitácora
1
I.
Antecedentes:
La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción. Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorímetros. TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA,
Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración. En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de onda. INSTRUMENTOS:
En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos: * Fluorímetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. * Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° 2
con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector. Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiación en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación o el filtro. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm. En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o filtro. Como se mencionó antes, la fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de 90° en relación a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitirá la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal sólo transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relación señal-ruido, y reduce el límite de detección a un factor de aproximadamente 10000, si se compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la fluorescencia también puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias. El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas. El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación va escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción.
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ANÁLISIS DE LOS DATOS:
A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la concentración del fluoróforo. A diferencia de la espectrometría visible o ultravioleta 'estándar', los espectros independientes del dispositivo no son fáciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la máquina. Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relación al instrumento o a la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador después del filtro o monocromador de excitación, para dirigir una porción de luz a un detector de referencia. Además, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisión de los monocromadores y los filtros, ya que también puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisión del monocromador varía dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razón por la que debe colocarse un detector de referencia después del filtro o monocromador de excitación. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector también depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre los diferentes detectores, según la longitud de onda y el tiempo. La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estándar" del espectro es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión, por ejemplo. Como se mencionó anteriormente, también surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta también. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersión de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos más importantes de dispersión en este contexto son la dispersión de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz cambia a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. A partir de este estado virtual, las moléculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de número de onda constante en relación con la excitación; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un número de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitación. Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorción, que ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorción de las moléculas, incluyendo el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de excitación de la luz no es constante a lo largo de la solución. Como resultado, 4
sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisión de luz fluorescente. APLICACIONES:
La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de compuestos orgánicos. También se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos. La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los fotones. II.
Objetivo:
Determinar el porciento de pureza del clorhidrato de quinina por fluorometría. III.
Hipótesis:
Contiene no menos al 99.0% y no más del 101.0% de la cantidad de Sulfato de quinina calculado como alcaloides totales y en relación con la sustancia seca, indicada en el marbete, según la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM). 11 Ed. p. 1297. ᵛᵃ
IV.
Procedimiento Experimental:
Preparación del ácido sulfúrico 0.1N: Se midió con una pipeta graduada de 3mL (compañero Aldo) ácido sulfúrico concentrado y se vertió en un vaso de precipitado con agua inyectable, este último se vertió en una matraz volumétrico de 1000mL y se aforo a marca (compañera Sigrid) con agua inyectable. Preparación de las disoluciones: Para el estándar: Se pesó (compañera Mariel, balanza #4, N° de inv. 002224878) 10.1mg de la muestra estándar con una pureza de 90%, se aforo con HSO 0.1N hasta la marca. Se tomó una alícuota de 1mLy se aforo con HSO hasta la marca de 100mL, de esta última se tomó una alícuota de 3mL y se aforo a 10mL con HSO. (Disoluciones compañera Sigrid). Problema: (Compañera Mariel) se pesó por triplicado, una muestra del sulfato de quinina problema de 9.8mg, 9.7mg, 9.7mg, se aforaron a marca con ácido sulfúrico hasta la marca de 100mL, se tomó una alícuota de 1mL y se aforo en 100mL con HSO. De esta última se tomó una alícuota de 3mL y se aforo con H2SO4 a la marca de 100mL.
V.
Propiedades e insumos
Sulfato de quinina Formula molecular: (CHNO) HSO Peso Molecular: 746.93 5
Aspecto: cristales finos Color: blanco bajo la luz se oscurece Solubilidad: fácilmente soluble en mezcla (1:2) cloroformo- etanol Ácido Sulfúrico Formula molecular: H2SO4 Concentración: 0.1N Peso Molecular: 98.07g/mol Densidad: 1.86g/mL Pureza: 95.98% VI.
Insumos:
Material:
8 matraces aforados de 100mL 1 Matraz aforado de 1000mL 4 matraces aforados de 10mL 2 pipetas volumétrica de 1mL 2 pipetas volumétrica de 3mL
Equipo:
VII.
Fluorímetro Celdas para fluorímetro Balanza analítica
Sustancias Agua inyectable 1L Ácido Sulfúrico 0.1N Sulfato de quinina estándar y muestra problema.
Resultados: Fluorómetro Turner Modelo 450 Lectura 360nm excitable/415 nm fluorescencia Matraz Mg
Estándar 1 2 3
Sensibilidad 10 Lectura fluorímetro nm
10.1 9.8 9.7 9.7
543 NO LEIBLE 500 883
10.1mg------ 100% 9.01mg=X ----90% Ce= (9.01mg/100mL)(1mL/100)(3mL/10mL)(1000Mg/1mg)=0.2703g/mL Concentración del problema: Cp1=no calculable CP2 6
0.2703microgramos/ml--------------------543 Abs 0.2488950276microgramos/ml=x-------500Abs CP3= 0.2703micrigramos/ml------------------------------ 543Abs 0.4395486188microgramos/ml=x-----------------883Abs Concentracion. Por el Fac. dilic. Cp2= 0.2488950276(1/1000)(10/3)(10/1)(100/10)=0.0829650092mg/mL Cp3 = 0.4395486188(1/1000)(10/3)(10/1)(100/10)=0.1465162063mg/ml Contenido real en % Cp1= no calculable Cp2= 9.7mg------ 100% 0.0829650092-----------x=0.8553093732% CP3= 9.7mg-------100% 0.1465162063mg/ml----------1.510476354% VIII.
Critica de la técnica usada:
Es importante saber las dos longitudes de onda para la lectura en fluorometría pues sin ellas se estaría en un problema ya que se tendría que hacer un barrido, lo que quitaría mucho tiempo. Para tener una lectura correcta es recomendable tener el aparato en buenas condiciones y no como el del laboratorio el cual su lámpara le falla; así como hacer las pesadas correctas dado que las nuestras estuvieron debajo de la sensibilidad de la balanza analítica y por eso se tuvieron errores en las lecturas. IX.
Análisis de resultados:
X.
Conclusión:
7
XI.
Grupo funcional cuantificado:
Anillos aromáticos, el doble enlace del etileno, la piridina
XII.
Referencias bibliográficas:
Secretaria de salud. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM). 11 Ed. Vol. 1. Ciudad de México. p. 1297 - 1298 Merck & Co; The Index Merck; An Encyclopedia of Chemical, Drugs and Biological; 9th Edition; New Jersey: Ralway; 1976. Perez G. ESPECTROMETRIA.COM Internet . Citado: 24/02/2018. Disponible en: https://www.espectrometria.com/espectrometra_de_fluorescencia ᵛᵃ
Glucosa 681,1079 liquida 681 soluci6n inyeetable 1925 y clorhidrato de lidocaina, soluci6n inyectable y cloruro de sodio, soluci6n inyectable 1924
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