PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS 1
Bryan Duque Á, 1328214; 2 Danila Díaz, 1330589; 3Roger Mina 1
[email protected],2
[email protected], 3
[email protected], Escuela de Ingeniería de Alimentos. Tecnología en Alimentos - Universidad del Valle, 4 octubre del 2014.
RESUMEN En la práctica se realizó una experimentación donde se tomaron varias muestras de colonia, se utilizó diferentes técnicas de tinción como; tinción de endosporas ( Bacillus aureus), tinción de capsula ( Klebsiella ), tinción de Gram ( Escherichia coli ) (Klebsiella ) (Staphylococcus aureus ). Se enfocó en la forma celular de las bacterias, su coloración si es gran negativa <
> Gram positiva >.Como se visualiza las esporas, y la capsula dependiendo de la técnica.
PALABRAS CLAVES. Colonia bacteriana, esporas, capsula, membrana celular, morfología.
OBJETIVOS: - Identificar las técnicas de coloración más utilizadas en el laboratorio para el estudio de la morfología bacteriana. -Visualizar las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas soportándose en las técnicas de tinción.
1. INTRODUCCIÓN En el año 1884, Christian Gram descubrió empíricamente una tinción diferencial de gran valor práctico, que con posterioridad se denominó tinción de Gram y se realizan los siguientes pasos esenciales: la extensión de células, fijadas por calor sobre un porta, se tiñe de modo sucesivo con un colorante básico, cristal violeta, y con una disolución diluida de yodo. La preparación se trata luego brevemente con un disolvente orgánico (alcohol o acetona). Las bacterias Gram-positivas resisten la decoloración y permanecen teñidas de un color azul obscuro-negro; las bacterias Gram-negativas son completamente decoloradas. El resultado de la tinción de Gram está condicionado en cierta medida al estado fisiológico de la célula, pero también se corresponde con diferencias fundamentales en la composición química de las paredes celulares de las bacterias. Los análisis químicos muestran que las paredes de las bacterias Grampositivas contienen peptidoglicano como componente mayoritario junto a polisacáridos asociados y una clase especial de polímeros, los ácidos teicoicos. La capa más interna de las paredes de las bacterias Gram-negativas es una capa muy fina de peptidoglicano y la capa es una membrana, denominada membrana externa. [1] La mayoría de las observaciones iniciales de los microorganismos se hacen con el fin estudiar su morfología y se realiza con preparados teñidos. El termino tinción significa
simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras. Sin embargo antes de teñir los microorganismos se deben fijar (adherir) al porta objetos. El proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos, también preserva diversas partes de los microbios en su estado natural con una distorsión mínima, después se extiende una película delgada de material que contiene los microorganismos. [2]
2. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Preparación del extendido: Se realizó con tres muestras de colonias bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus Aureus, Klebsiella pneumoniae) . En una lámina porta-objetos se colocó una pequeña gota de agua, con el asa esterilizada se tomó una pequeña muestra el cultivo sólido, esta muestra se mezcló en la gota de agua y luego se extendió por todo el porta-objetos, se dejó secar la lámina a temperatura ambiente, a continuación se fijó la muestra extendida utilizando calor pasando el revés de la lámina por la llama del mechero 3 veces verif icando que la lámina no se calentara demasiado. (Flamear el portaobjetos).
Coloración de Gram: El colorante primario (cristal violeta) se aplica al frotis y luego se trata con reactivos y se hace una tinción de contraste con safranina. Caracteriza las bacterias incluyéndolas en uno de dos grupos. [3] 1 Gram-positivas: se tiñen de violeta oscuro. 2 Gram-negativas: se tiñen de rojo o rosado.
Procedimiento: Luego de la Preparación del extendido; la lámina con la muestra se cubrió con cristal violeta y se dejó “teñir” por un minuto, luego se lavó el excedente del reactivo con agua destilada, después se cubrió la superficie de la lámina con solución de lugol (que actúa como mordiente) y se dejó actuar por un minuto, se lavó con agua destilada y se retiró el excedente del lugol y agua. . A continuación la lámina se puso en posición inclinada y se procedió a lavar con alcohol (decolorante) durante ± 15 segundos y luego con agua destilada hasta que el color del cristal violeta terminara de salir, por ultimo; se cubrió la lámina con safranina por ± 30 segundos, se lavó y escurrió con agua destilada.
Coloración de Cápsula: Se tiñe el frotis después de un tratamiento con sulfato de cobre. La cápsula aparece como una zona clara que rodea a los organismos que la poseen [3] Luego de la preparación del extendido; en este caso la muestra de cultivo sólido fue de klebsiella pneumoniae la muestra se dejó secar al aire libre, no se fijó al calor, se procedió a colorear la muestra en la lámina con una solución de cristal violeta al 1% durante 2 minutos, se lavó con una solución de sulfato de cobre al 20%, luego se dejó secar al aire libre en posición vertical y se procedió a observar en el microscopio.
Coloración de Esporas: El colorante primario (verde de malaquita) se aplica calentando para que penetre en las esporas; las células vegetativas reciben coloración de contraste con safranina. Pueden verse endosporas de especies de Bacillus y
Clostridium [3]
En este caso la muestra del cultivo fue de Bacillus cereus, después de haber preparado el extendido, la lámina con la muestra se cubrió con una tira de papel filtro, luego todo
el porta-objetos se bañó con una solución acuosa de verde de malaquita al 5%, éste se calentó al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar que se secaran, se enjuagó con agua destilada y se contra-coloreó con una solución de safranina al 0.5% durante ± 30 segundos y se procedió a lavar. , por último la muestra se observó en el microscopio de luz.
El la observación bajo el microscopio de luz: Se colocó una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas, y se examinaron con el microscopio de luz con el objetivo de inmersión 100x. Luego se observaron varios campos hasta encontrar donde las células estaban adecuadamente separadas y así; permitir la observación de su morfología y el resultado de la coloración de Gram En una lámina porta-objetos se colocó una pequeña gota de agua, con el asa esterilizada se tomó una pequeña muestra el cultivo sólido, esta muestra se mezcló en la gota de agua y luego se extendió por todo el porta-objetos, se dejó secar la lámina a temperatura ambiente, a continuación se fijó la muestra extendida utilizando calor pasando el revés de la lámina por la llama del mechero 3 veces verific ando que la lámina no se calentara demasiado. (Flamear el portaobjetos).
3. RESULTADOS Tabla Nº 1 Algunas características de las bacterias, Gram negativa y Gram positiva. Característica
Gram Positivo
Gram Negativo
Reacción de Gram
Retiene el color violeta, se tiñe de color violeta oscuro.
Pueden perder el color y aceptar el colorante contrasté la safranina
Capa de peptidoglucano
Gruesas (capas múltiples)
Delgada (una sola capa)
Ácidos teicoicos
Presente
Ausente
Espacio periplasmático
Ausente
Presente
Membrana externa
Ausente
Presente
Contenido de lipopolisacáridos
Prácticamente nulo
Elevado
Tabla Nº2 Bacterias según la tinción de Gram, morfología. Bacteria
Morfología
Gram negativa
Gram positiva
Escherichia coli
Estreptococos, cocos
Si, color rosado
No
Staphylococcus aureus
Staphylococcus, diplococos
No
Si, color violeta
klebsiella pneumoniae
Staphylococcus Estreptococos, cocos.
Si, color rosado
No
Tabla Nº3 Bacterias según la tinción de capsula. Bacteria
morfología
Presencia de capsula
klebsiella pneum oniae
Staphylococcus Estreptococos, Capsula roja
Capsula roja cocos.
Tabla Nº4 Bacterias según la tinción de endosporas. Bacteria
morfología
Presencia de esporas
Bacillus cereus
Staphylococcus, diplococos
Esporas, bacilos verdes.
4. DISCUSION DE RESULTADOS Tinción de Gram Esta técnica se emplea para determinar la estructura de la membrana de la célula bacteriana, cuando se adiciono el cristal violeta, tiñe de color violeta, tanto las células <> porque ingresa en el citoplasma de ambas tipo de células, la aplicación de yodo (el mordiente) establece la formación de cristales con el colorante que no puede atravesar la pared celular debido a su gran tamaño, la aplicación de alcohol deshidrata el peptidoglucano de las células <> y torna aún más impermeables a los cristales violetas. En el caso de la <> el efecto es muy diferente dado que el alcohol disuelve la membrana externa de la célula incluso crea en la capa delgada de peptidoglucano pequeños orificios a través de los cuales se difunde los cristales del colorante yodo o lugol, como las Gram negativas se tornan incoloras después del lavado con alcohol, cuando se adiciono la safranina crean un contraste de color principal, es absorbida tanto como por las células Gram positivas, como por las células Gram negativas, el color rosado este colorante enmascarado con el colorante violeta más intenso que absorbieron antes la célula Gram positiva. [4]
Tinción de Gram Negativa (Escherichia co li) Se observó que la tinción de Gram en esta bacteria, se tiñe de color rosado <>, esto es debido a la estructura de la bacteria está compuesta por una capa o por muy poca capas de peptidoglucano y una membrana externa, cuando se adiciono el cristal violeta, tiñe de color violeta, Gram negativas ingresa en el citoplasma, el peptidoglucano está unido a lipoproteínas de la membrana externa y la membrana
plasmática. La pared celular de las bacterias Gram negativas no contiene ácidos teicoicos y el hecho de que contenga una escasa cantidad de peptidoglucano aumenta la susceptibilidad de la ruptura mecánica. Para tener presente la tinción de las bacterias Gram negativas se tiene en cuenta que la membrana externa está compuesta por polisacáridos, lipoproteínas y fosfolípidos, con esta técnica se observó la coloración de la bacteria escherichia coli, es un agente patógeno trasmitido por los alimentos, debido a su composición de la membrana plasmática, el espacio perisplasmático, la membrana externa. También se identificó la forma de Estreptococos. [4]
Tinción de Gram Negativa (S t ap h y l o c o c c u s
Aureus)
En este caso se logró identificar Staphylococcus de color morado, esto quiere decir que es un <> se debe a que tiene un pared que está compuesta por varias capas de peptidoglucano que forma una estructura gruesa y más rígida, además la pared de las bacterias Gram positivas contienen ácidos teicoicos esta formados principalmente de alcohol, existen dos clases ácido lipoteicoico que abarca toda la capa de peptidoglucano y esa unido a la membrana plasmática y el ácido teicoicos está unido a la capa peptidoglicano. [5]
Tinción de Gram Negativa (Klebsiella Pheumoniae ) Klebsiella bacteria fue identificada en el microscopio al ser una bacteria Gran Negativa no retiene el color cristal violeta entonces con el colorante de contrast e se tiñe de rosado, la pared celular de las bacterias Gram negativas es más delgada que las de las gram positivas, y la de las gram negativas contiene además peptidoglicano, el cual es una capa externa con un porcentaje alto de lípidos. [6] Por lo que al contacto con el cristal violeta y en el enjuague con el disolvente orgánico se solubiliza en este y no se colora.
Tinción de Cápsula (klebsiella pneum oniae) Debido a que la cápsula posee poca afinidad a los colorantes, entonces lo que sucede es que el cristal violeta se precipita hasta el centro de la célula y “tiñe” la pared celular debido a que ésta posee una afinidad al colorante mucho mayor que la cápsula. Una de las razones del cómo se forman estas capsulas: es que este material es segregado por la célula y que debido a su viscosidad (que es la resistencia de una sustancia a fluir) se queda alrededor te toda la pared celular de la bacteria ocasionando así un aumento notable en la viscosidad del medio en el que se desarrolla. [7]
Tinción de Esporas (Bacillus Cereus ) El Bacillus Cereus es un bacilo Gram positivo aerobio- anaerobio facultativo. Produce en su interior formas de resistencia denominada endoesporas. [8] Estas estructuras de resistencia, entre otras características, son tres gruesas cubiertas protectoras, las cuales las hacen impermeables a los colorantes. Debido a esto, para teñir una endoespora es necesario aplicar el colorante con calor para “ablandar” sus capas protectoras. Además, el colorante vaporizado penetra, los microporos que se forman con el calor, más fácilmente que en estado líquido. Al enfriar y lavar el portaobjeto con agua, los microporos se cierran quedando el colorante (verde malaquita), atrapado dentro de la endoespora. Finalmente, en esta tinción se usa un colorante de contraste, la safranina, que tiñe la célula vegetativa de color rojo, contrastando con las endoesporas que se observan de color verde. [9] La producción de esporas en presencia de oxigeno es un rasgo que define la morfología. Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo tipo,
y puede ser encontrado en el polvo el aire, por lo tanto tiene considerable oportunidad para estar en o sobre son alimentos. [10]
5. PREGUNTAS. 1. ¿Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetativas, por qué? Esto se debe a que las esporas son muy resistentes a métodos físicos y químicos, lo que impide el correcto funcionamiento de los colorantes como por ejemplo: a no poder retenerlos; en cambio la fase vegetativa tiene las propiedades de una célula en cuanto a pared celular que le permite retener el colorante (safranina).
2. ¿En su preparación se observan esporas libres y en el interior de células vegetativas. Como puede incrementarse el contenido del material capsular? Debido a que las endosporas son producidas en la fase terminal de las células vegetativas (lisis celular), se puede decir que la cantidad de endosporas “aumentaría si muere más cantidad de células vegetativas” “el incremento del material capsular es proporcional a la muerte de las células vegetativas” esto se debe a que cada célula vegetativa produce una endospora.
3. ¿Los frotis de bacterias encapsuladas no se lavan con agua ni se calientan? ¿Por qué? Porque debido a la composición química capsular “polisacáridos y polímeros”, es posible que al lavar el material viscoso se disuelva en el agua; y si se fijan al calor es posible que pierda sus propiedades al entrar en contacto con éste. [10]
4. ¿Cómo se correlaciona la presencia de cápsula con la virulencia de una bacteria patógena? La presencia de cápsula en bacterias está proporcionalmente relacionada con la virulencia, “la presencia de cápsula en algunas bacterias patógenas aumenta su capacidad infecciosa. Y que la perdida completa de la cápsula redunda en la pérdida de la invasividad o de la capacidad infecciosa (virulencia).” [10]
6. CONCLUSIONES
Con este informe se concluyó las paredes celulares que brinda rigidez estructural, confiere la forma y barra física contra el ambiente. Las bacterias según la coloración de Gram en la cual encontramos dos características < Gram negativa> la variedad de la morfología, el color y en la agrupación. La tinción simple de las baterías procedentes de distintas muestras de colonias bacterianas se conoció cuatro tipos de fijación bacteriana, También logro observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones, el color, practicar el manejo del microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo de aceite de inmersión, se realizó también la tinción de esporas y capsula. La tinción de esporas es un método útil para bacillus que producen endoesporas ya que al usar el método de calor puede penetrar el colorante y estudiar su morfología.
7. BIBLIOGRAFÍA [1] TORTORA, FUNKE, “Introducción a la Microbiología”. Editorial Panamericana. 2007, p.p 69, 70 [2] STANIER, Y. Roger. INGRAHAM, L. John. WHEELIS, L. Mark. PAINTER, R. “Microbiología”, 2da edición. Editorial Reverte S. A., 1992. Pág. 414. [3] PELCZAR, M. J.Elementos de microbiologia. 6ª Edic. España.Editroial McGRAWHILL. 1984. p.p 36. [4] Tortora j. Gerald. Berdell R. Funke. Case L. Christine. Introducción a la microbiología. 9ª Edic. Buenos Aires. Argentina. Benjamín Cummings.2007. Editorial Médica Panamericana. Pág.85. [5] Vera García. “Introducción a la Microbiología” editorial universidad estatal, 1995, PP. 46, 47. [6] Tortora j. Gerald. Berdell R. Funke. Case L. Christine. Introducción a la microbiología. 9ª Edic. Buenos Aires. Argentina. Benjamín Cummings.2007. Editorial Médica Panamericana. Pag.86. [7] Michael J. Pelczar, J. R. Microbiología.5ª Edic.Mexico; D.F. Editorial Mcgraw-Hill. 1982.Pag.46 [8] Procedimiento de recuento de placa en Bacillus Cereus en alimentos http://www.ispch.cl/lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-035.pdf fecha de consulta 30-9-14 [9]Bacteriological Analytical Manual capitulo 14 Bacillus cereus January 2001,http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html fecha de consulta 31-09-14 [10]Microbiología general http://www.unavarra.es/genmic/microgral/manual%20practicas%20micagral.pdf fecha de consulta 30-09-14
8. ANEXOS Tinción de Gram 1ª Escherichia
coli
2ª S t ap h y l o c o c c u s
a u r eu s
3ª klebsiella pneumon iae
Tinción de esporas. 1ªBac illu s aureu s.
Tinción de capsula. 1ªklebsi ella p neum on iae
