INFORME DE MICROBIOLOGÍA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS ACÉTICAS A PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA NARANJA VALENCIA (Citrus sinensis)
Yesicka F. Sanabria
INFORME DE MICROBIOLOGÍA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS Y BACTERIAS ACÉTICAS A PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA NARANJA VALENCIA (CITRUS SINENSIS)
INTEGRANTES: YESICKA F. SANABRIA
GRUPO: 48TGQID
INSTRUCTORA: MAGALY SÁNCHEZ BENAVIDEZ
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA QUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIA CENTRO DE GESTIÓN INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2015
INFORME DE MICROBIOLOGÍA
TABLA DE CONTENIDO Pág.
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 4 1.
OBJETIVOS ..................................................................................................... 5
Objetivo General ..................................................................................................... 5 Objetivos Específicos ............................................................................................. 5 3.
MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 6
2.1 Medios de Cultivo ............................................................................................. 7 2.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés ...................................................... 7 2.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram ............................................................ 8 2.4 Aislamiento por Estrías ..................................................................................... 9 2.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 10 3.
PROCEDIMIENTOS ...................................................................................... 11
3.1 Preparación de Medios de Cultivo................................................................... 11 3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés .................................................... 13 3.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram .......................................................... 15 3.4 Aislamiento por Estrías ................................................................................... 17 3.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 18 3.5.1 Fermentación de azúcares........................................................................... 19 3.5.2 Tolerancia de Etanol .................................................................................... 21 4. RESULTADOS ................................................................................................ 22 4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo ............................................ 22 4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés ............................. 23 4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos ........................................ 24 4.4 Conteo de colonias ......................................................................................... 26 4.5 Identificación de Gram+ y Gram- ..................................................................... 26 4.6 Resultados de Aislamiento por Estrías ........................................................... 29 4.7 Coloración de Gram para Verificación de Pureza de Levaduras ..................... 30
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4.8 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas ............... 31 4.8.1 Cálculos de Fermentación de azúcares ...................................................... 31 4.8.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol ................................................................. 32 4.8.3 Resultados de Fermentación de Azúcares ................................................... 33 4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol.............................................................. 35 5.
ANÁLISIS DE RESULTADOS....................................................................... 36
6.
CONCLUSIONES .......................................................................................... 37
7.
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 38
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INTRODUCCIÓN En este informe se abordará el aislamiento e identificación de las bacterias adecuadas para la obtención de ácido acético a partir del jugo fermentado de naranja valencia (Citrus sinensis), al cual se le realizaron varios cultivos de colonias microbianas en varios niveles de disolución. Con este fin se cultivaron los microrganismos en medios Agar-Agar GYC y AgarAgar YGC, además de determinar la UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de cada uno de los cultivos obtenidos, posteriormente se identificaron los microrganismos de algunas de las colonias a partir de tinción o coloración de Gram, a cada una de las disoluciones trabajadas. Para esto último se examinaron las colonias por medio de microscopio electrónico y se tomaron fotografías como evidencia del trabajo realizado obteniendo así Gram positivas y Gram negativas. Como último procedimiento se realizaron pruebas bioquímicas: prueba de azúcares y tolerancia de etanol las cuales permitirán conocer los microorganismos obtenidos. Todo este trabajo con las colonias de microorganismos cultivadas se realiza con el fin de aislar los microrganismos de utilidad para el proyecto de formación y bajo qué condiciones se deben mantener para una mayor eficiencia y calidad en nuestro producto final.
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1. OBJETIVOS Objetivo General Conocer los procedimientos adecuados para el aislamiento e identificación de levaduras y bacterias acéticas a partir de jugo fermentado de la naranja valencia (Citrus sinensis). Objetivos Específicos
Preparar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de microorganismos de interés (levaduras y bacterias acéticas).
Realizar aislamiento a partir de la caracterización macroscópica de los microrganismos recuperados del fermento analizado.
Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de cultivo y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades halladas en la caja de Petri.
Efectuar coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
Aislar los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por estrías.
Hacer pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba de fermentación de azúcares y tolerancia de etanol.
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3. MARCO TEÓRICO Los microorganismos como las Levaduras son organismos vivos microscópicos unicelulares pertenecientes al reino de los hongos y al dominio eucariota, se alimentan principalmente de azúcar produciendo fundamentalmente dióxido de carbono y alcohol; su forma puede ser desde esférica, ovoide o alargada. Las dimensiones varían entre 2 y 4 µm de ancho y 2 a 8 µm de largo, se encuentran levaduras alargadas de 10, 15 o 25 µm de longitud. Poseen pared celular, membrana fundamental, citoplasma y núcleo.
Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces cerevisiae. Tomada de google imágenes
Las levaduras son muy importantes debido a que contribuyen en la elaboración de procesos fermentativos, Un ejemplo claro es la Saccharomyces cerevisiae que es empleada industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. Se forma de nutrición varía desde los carbohidratos hasta los aminoácidos. Entre los azúcares que pueden utilizar están los monosacáridos como la glucosa, fructuosa y galactosa, también puede emplear disacáridos como la maltosa y la sacarosa. Para identificar una levadura se parte de cultivos puros, y se tienen en cuenta ciertas características
Morfológicas: Forma, medida, reproducción asexual Características de reproducción sexual Características fisiológicas y bioquímicas
Con lo anterior ya mencionado es necesario que los microorganismos para reproducirse necesitan de medios de cultivo, ser aislados y a su vez identificados por medio de pruebas de coloración como la Gram y pruebas bioquímicas como se mencionarán a continuación.
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2.1 Medios de Cultivo Los medios de cultivo son soluciones compuestas por nutrientes específicos para que así los microorganismos puedan desarrollarse en un laboratorio. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, ya que las necesidades nutricionales varían considerablemente. Se pueden clasificar de acuerdo a su estado, complejidad, y aplicaciones. En cuanto al estado se encuentran medios sólidos, semisólidos y líquidos, los sólidos contienen una sustancia gelificante conocida como agar-agar, los semisólidos contienen una menor concentración de agar-agar (0.5 a 0.7%) y los líquidos no contienen agar-agar, debido a su naturaleza los medios sólidos o agares se sirven en cajas de Petri mientras que los medios líquidos o caldos de cultivo y los semisólidos se sirven en tubos de ensayo. Según las aplicaciones de los medios de se clasifican en enriquecidos, selectivos, diferenciales. 1
Imagen 1. Medios de cultivo sólido (Agar), tomada de google imágenes
Para la preparación de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales tales como la disponibilidad de nutrientes adecuados, la consistencia adecuada del medio, presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio. 2.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa una gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podrían ser útiles al hombre, mientras que otros podrían ser patógenos. La separación de cada una de estas variedades es lo que se conoce como aislamiento de microorganismos.
1Instructivo
para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
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Los microorganismos son ubicuos (pueden estar en cualquier lugar), gracias a esta característica pueden colonizar cualquier ambiente, desde un rio hasta una escultura de hierro, esa habilidad es debido a sus procesos metabólicos y sistemas enzimáticos. Para aprovechar esas características de los microorganismos, en beneficio de la industria y el medio ambiente, es de vital importancia poder aislarlos de su medio natural y llevarlos a medios sintéticos para poder manipularlos en el laboratorio.2 2.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram La coloración de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología que permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas aquellas que se visualizan en morado y las Gram negativas aquellas que se visualizan de color rosa, rojo o grosella según se comporten ante su tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: la Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano mientras que las bacterias Gram negativas poseen una capa peptidoglicano más fina y una capa de lipopolisacarídica externa. Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor facilidad que las Gram positiva debido al grosor de la pared celular.
Imagen 2. Imagen de bacterias Gram positivas (color morado) y bacterias Gram negativas (color rosa). Tomada de google imágenes
Para realizar la coloración de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y colorantes tales como: el cristal violeta, lugol, etanol y fucsina. Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloración de Gram que se adhiere a la pared de todas las células bacterianas, las Gram positivas absorben este colorante debido al grosor de su pared celular y al porcentaje mayor de ácido teicoico.
2Instructivo
para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés práctica 2. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
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Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y SI (siulterio), Cumple la función de fijar el colorante primario (cristal violeta) en la preparación. Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloración en este paso los microrganismos Gram positivos no se decoloran mientras los Gram negativos si lo hacen. Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el último compuesto que se le adiciona a la coloración en Gram y en el cual se puede determinar las Gram positivas y las Gram negativas de acuerdo al color y al contraste. 2.4 Aislamiento por Estrías Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de interés, es necesario realizar aislamientos que permitan obtener cultivos puros de los microorganismos objeto de estudio. La técnica de aislamiento por estría o técnica de siembra por agotamiento de colonias y la obtención de cultivos axénicos (una sola especie microbiana proveniente de una sola célula) a partir de cultivos mixtos; esta técnica diluye la muestra de microorganismos a partir del trazo de estrías sucesivas sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de colonias totalmente aisladas. 3 Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa; se quema el asa, se enfría, se gira la placa a 90°c y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie sin sembrar (Ver imagen 3).
Imagen 3. Imagen de procedimiento de aislamiento de microorganismos por estrías. Tomada de google imágenes
3
Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio práctica 4. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
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2.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas La identificación microscópica y macroscópica de los microorganismos proporciona una idea general acerca de la identificación de microorganismo, de hecho estas son técnicas preliminares que permiten seleccionar pruebas de mayor especificad como la realización de pruebas bioquímicas que dejan ver las características metabólicas de los microorganismos frente a un compuesto específico; así como por ejemplo el caso del género Saccharomyces, es necesario determinar las características de asimilación y fermentación de diversos azúcares, así como la capacidad de tolerancia al etanol y su reacción frente a la urea. 4
Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones que determinan la actividad de una vía metabólica de la bacteria a partir de un sustrato de que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Para ello, hay que partir de un cultivo obtenido en el aislamiento, subcultivando de una colonia bien aislada. La identificación de una especie requiere de estas pruebas. Es aconsejable tener en cuenta:
Cambios que se producen Reacciones químicas que se producen Enzimas que intervienen Productos intermedios Secuencia de las reacciones bioquímicas
Prueba de Fermentación de azúcares: En esta prueba se determina si la bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular (producción de ácidos acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias con metabolismo fermentador, ensayándose por separado con diferentes carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, entre otras). Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los microorganismos obtenidos son resistentes al etanol y si son capaces de presentar mayor rendimiento de este, ya que es una característica de las levaduras.
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Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas bioquímicas práctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
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3. PROCEDIMIENTOS 3.1 Preparación de Medios de Cultivo Observar la etiqueta de cultivo deshidratado.
Realizar los cálculos de acuerdo a las indicaciones de la etiqueta.
Para caldos de cultivo son necesarios 10mL por tubo.
Para medio sólido (agar) se necesitan 20mL del medio de cultivo.
Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de medio requerida de acuerdo a los cálculos realizados.
Medir con una probeta agua desionizada para disolver el medio.
Disolver con agua el medio de cultivo previamente pesado para lograr una disolución eficaz.
Verter la mitad de agua desionizada en el frasco de disolución y adicionar el cultivo, agitar y terminar de adicionar el agua.
Consultar en la etiqueta del medio deshidratado si es necesario calentar
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Rotular frascos
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Si el medio que se prepara es un caldo de cultivo antes de llevarlo al autoclave de servir en tapas-rosca
Con ayuda del Beaker transferir 10mL aprox. para cada tubo de ensayo.
Llevar el medio disuelto al autoclave y esterilizar durante 15min a 15psi y 120°c
Una vez esterilizado el agar, sacar el frasco y cerrar la tapa
Rotular cajas de Petri: nombre del medio, fecha y grupo responsable
Servir en cajas de Petri estériles acercando al mechero
Dejar solidificar el agar llevar a una incubadora (37°- 48 horas)
Almacenar en refrigeración, las cajas de Petri se deben agrupar y envolver en papel vinipel
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3.2 Aislamiento de Microorganismos de Interés
Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a partir de la cual se aislaran los microorganismos de interés
Adicionar los 10g de la muestra al frasco con los 90mL de agua peptonada al 0.1% p/v
Homogenizar durante 5min, obteniendo la dilución de 10-1
Realizar disoluciones seriadas a partir de la disolución de 10-1 (ver imagen 4)
Tomar 1mL de la disolución de 10-1 y suspender en 1 de los tubos con 9mL de agua
Agitar hasta homogenizar obteniendo la disolución 10-2
A partir de la disolución 10-2 realizar la disolución 10-3 y así sucesivamente hasta llegar a la disolución 10-7
Sembrar 0.1mL de las disoluciones 10-4 a 10-7 sobre la superficie del agar específico
Homogenizar los 0.1mL sobre la superficie del agar, empleando el asa de vidrio estéril
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Homogenizar empezando por la caja donde se sembró la mayor disolución
Dejar secar las cajas de Petri y llevar a la incubadora
Seleccionar las cajas que tengan entre 30 y 300 colonias y realizar el recuento de todas las colonias
Identificar las características morfológicas de las colonias
Seleccionar aquellas colonias que correspondan a las reportadas para el microrganismo de interés
A las colonias seleccionadas realizar identificación microscópica o enzimática
Imagen 4. Procedimiento de disoluciones. Imagen obtenida de google imágenes
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3.3 Tinción de Gram o Coloración de Gram Tomar una lámina limpia, seca y estéril, adicionar una gota de agua sobre esta
Con un asa esterilizada tomar un poco del cultivo, colocarla sobre la lámina y hacer un extendido sobre esta
Esperar a que seque a temperatura ambiente y fijar pasando 5 veces la llama del mechero
Adicionar 3-4 gotas de cristal violeta sobre la lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 gotas de lugol sobre la lámina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y esperar 30 segundos
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lámina y esperar 30 segundos
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Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de fucsina sobre la lámina y esperar 1 minuto
Enjugar con agua
Esperar a que seque a temperatura ambiente
Llevar al microscopio óptico y enfocar primero en 4X
Adicionar una gota de aceite de inmersión
Enfocar en 100X e identificar si son Gram+ (moradas) o Gram-(rosa)
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3.4 Aislamiento por Estrías Tomar los cultivos mixtos donde se encuentran los microorganismos de interés
Ubicar las colonias previamente identificadas de acuerdos a identificación microscópica y macroscópica realizada
Rotular base de la caja de Petri donde se encuentra el medio de cultivo apto para el crecimiento de microorganismo a aislar
Señalar el número de la colonia, la muestra de donde proviene y la fecha
Esterilizar el asa recta hasta que tome un color rojo incandescente y dejarla enfriar
Tomar una muestra de la colonia con el asa estéril y fría al lado del mechero
Colocar la muestra en un extremo de la superficie del agar estéril
Esterilizar el asa y dejarla enfriar
Realizar de 5 a 6 con el asa redonda estéril estrías paralelas, consecutivas y juntas no superpuestas
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Realizar un primer grupo de estrías en el cuadrante 1 de la caja (ver imagen 2) Cerrar la caja Petri y girarla 90°, destapar y empezar un segundo grupo de estrías aprox. 4 a partir de la última realizada
Cerrar la caja Petri y girarla 90°, destapar y empezar un tercer grupo de estrías aprox. 4 a partir de la última realizada
Cerrar la caja Petri y girarla 90°, destapar y empezar un cuarto grupo de estrías aprox. 4 estrías realizando una especie de espiral
Llevar caja de Petri a incubar, después de ello realizar identificación macro y microscópica de las colonias aisladas
Imagen 5. Caja de Petri, aislamiento por estrías tomada de guía de práctica de laboratorio, aislamiento por estrías
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3.5 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas 3.5.1 Fermentación de azúcares Tubo1: Caldo Glucosa Tubo2: Caldo Sacarosa Tubo3: Caldo Maltosa Tubo4: Caldo Ribosa Tubo5: Caldo Xilosa Tubo6: Caldo Lactosa Para preparación de medios ver Tabla 1.
Elaborar una batería compuesta para cada microorganismo a probar por 6 tubos de 5 mL Rotular los tubos de ensayo con la identificación de la colonia a probar, azúcar, número de grupo y fecha Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del mechero Tomar una muestra de la colonia del microorganismo seleccionado y sembrar en el caldo de glucosa Suspender la colonia agitando el asa dentro del medio, tapar el tubo y agitar Esterilizar el asa, volver a tomar de la muestra de la misma colonia y sembrar en el caldo de sacarosa Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar de sembrar en cada uno de los azúcares a probar
Llevar a incubar los tubos a 30°C, revisándolos a las 24, 48 y 72 horas y reportando como fermentación o asimilación Reportar las reacciones bioquímicas como asimilación: si hay presencia de CO2, turbidez y cambio de pH. Comparar resultados con Tabla 2.
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Tabla 1. Preparación de Medio para fermentación de azúcares (Tomada de guía de laboratorio práctica N° 4) COMPONENTE
g/L
NaCl
8.5
Peptona
5
Carbohidrato a probar
10
Rojo de fenol
1 mL
Agua destilada
1000 mL
Tabla 2. Fermentación de azúcares para Saccharomyces cerevisiae (Tomada de guía de laboratorio práctica N° 4) Saccharomyces cerevisiae Glucosa Galactosa Ribosa Arabinosa Sacarosa Maltosa Celobiosa Trehalosa Lactosa Xilosa Rafinosa Ramnosa
+ + + + + + +
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3.5.2 Tolerancia de Etanol Para cada microorganismo a identificar elaborar 4 tubos en calo OGY Tubo1: 2% de etanol Tubo2: 4% de etanol Tubo3: 6% de etanol Tubo4: 8% de etanol
Después de esterilizado el medio OGY adicionar etanol en cada uno de los 4 tubos Rotular los tubos de ensayo con la identificación de la colonia a probar, concentración de etanol, número de grupo y fecha Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del mechero Tomar una muestra de la colonia del microorganismo seleccionado y sembrar en tubo de ensayo con concentración de etanol mayor
Suspender la colonia agitando el asa dentro del medio, tape el tubo y homogenizar
Esterilizar el asa, volver a tomar una muestra de la misma colonia y sembrar en tubo de 8%
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar de sembrar en cada una de las concentraciones de etanol a probar
Llevar tubos de ensayo a la incubadora a 30°C durante 5 días Terminar el tiempo de incubación, realizar lectura del crecimiento en el medio de cultivo (verificar por turbidez)
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4. RESULTADOS 4.1 Cálculos para Elaboración de Medios de Cultivo Agar YGC Hongos y levaduras 10 cajas de Petri Preparar 200mL 200𝑚𝐿 ∗ (
38,1𝑔 ) = 7,62𝑔 1000𝑚𝐿
Agar GYC Bacterias acéticas 10 cajas de Petri A diferencia del agar YGC que ya viene preparado, el agar GYC necesita ser adecuado agregando así diferentes componentes para que los microrganismos se desarrollen, a continuación se observan cada uno de ellos con sus correspondientes cálculos: Glucosa 50𝑔/ 1𝐿 200𝑚𝐿 ∗ (
50𝑔 ) = 10𝑔 1000𝑚𝐿
𝐶𝑎𝐶𝑂3 5𝑔/ 1𝐿 200𝑚𝐿 ∗ (
5𝑔 ) = 1𝑔 1000𝑚𝐿
200𝑚𝐿 ∗ (
20𝑔 ) = 4𝑔 1000𝑚𝐿
Agar-agar 20𝑔/ 1𝐿
Cabe aclarar que el esterilización.
etanol se adiciona después de realizar el proceso de
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Etanol70𝑚𝐿/ 1𝐿 200𝑚𝐿 ∗ (
70𝑚𝐿 ) = 14𝑚𝐿 1000𝑚𝐿
4.2 Cálculos para Aislamiento de Microorganismos de Interés Extracto: 200𝑚𝐿 ∗ (
10𝑔 ) = 2𝑔 1000𝑚𝐿
Adicionar en agua destilada y seguir procedimiento imagen 6:
Imagen 6. Disoluciones para aislamiento de microorganismos de interés, agua peptonada con jugo de fermento de naranja valencia
En la preparación para el aislamiento de los microorganismos de interés se disuelven 10mL del jugo fermentado de naranja valencia en 90mL de agua peptonada, luego se toma 1mL de esta disolución y se agregan en los 9mL de gua peptonada en cada tubo de ensayo, se realiza procedimiento consecutivamente hasta llegar a la disolución de 10-6 como se observa en la imagen 6. Se emplean las diluciones de 10-4 ,10-5 y 10-6 para la obtención de los microorganismos de interés debido a que las demás poseen gran cantidad de carga microbiana.
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4.3 Caracterización de los medios de cultivo obtenidos AGAR YGC Tabla 1. Agar YGC 10-4 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Redonda
Beige
2 mm
Cremosa
Levaduras
B
Circular
Beige
5 mm
Cremosa
Levaduras
C
Borde irregular
Beige
4 mm
Cremosa
No se realiza
D
Redonda
Beige
1.5 mm
Cremosa
No se realiza
E
Borde irregular
Beige
6 mm
Cremosa
No se realiza
Tabla 2. Agar YGC 10-5 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Forma irregular
Beige
5 mm
Brillante, cremosa
Levaduras ovaladas
B
Redonda
Beige
3 mm
Lisa, brillante
Levaduras
C
Circular
Beige
3 mm
Cremosa
No se realiza
D
Redonda
Beige
2 mm
Cremosa
No se realiza
E
Redonda
Beige
4 mm
Cremosa
No se realiza
Tabla 3. Agar YGC 10-6 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Redonda
Beige
1 mm
Cremosa, hueca
No se realiza
B
Redonda
Beige
0.5 mm
Cremosa, hueca
Levaduras
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C
Redonda
Beige
1 mm
Cremosa
No se realiza
D
Redonda
Beige
0.5 mm
Cremosa, lisa
Levaduras
AGAR GYC Tabla 4. Agar GYC 10-4 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Redonda
Crema
1 mm
Cremosa, lisa
No se realiza
B
Redonda
Crema
3 mm
Cremosa, rugosa
Levaduras
C
Redonda
Crema
1.5 mm
Cremosa, rugosa
Levaduras
D
Redonda
Crema
1 mm
Cremosa, brillante
No se realiza
E
Redonda
Crema
1.5 mm
Cremosa, opaca
No se realiza
Tabla 5. Agar GYC 10-5 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Redonda
Crema
4 mm
Cremosa, opaca
Levaduras ovaladas
B
Redonda
Crema
3.5 mm
Cremosa, opaca
No se realiza
C
Redonda
Crema
3 mm
Cremosa, opaca
No se realiza
D
Redonda
Crema
4 mm
Cremosa, opaca
No se realiza
E
Redonda
Crema
4 mm
Cremosa, opaca
Levaduras ovaladas
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Tabla 6. Agar GYC 10-6 COLONIA
FORMA
COLOR
TAMAÑO
APARIENCIA
MICROSCOPÍA
A
Redonda
Amarilla
2 mm
Cremosa, opaca
Cocos Gram+
B
Redonda
crema
1 mm
Cremosa, opaca
Levaduras
C
Redonda
crema
4 mm
Cremosa, opaca
No se realiza
4.4 Conteo de colonias AGAR YGC 10-4 = 6560000 = 6,56 x 106 UFC/mL 10-5 = 2000000 = 2 x 106 UFC/mL 10-6 = 500000= 5 x 105 UFC/mL2 AGAR GYC 10-4 =
Imagen 7. Colonias en caja de Petri ubicado en un contador de colonias. Imagen tomada en laboratorio de microbiología, SENA
106
6960000 = 6,96 x UFC/mL 7 10 = 22600000= 2,26 x 10 UFC/mL 10-6 = 25000000= 2,5 x 107 UFC/mL -5
4.5 Identificación de Gram+ y GramA – GYC 10-5 B – GYC 10-4 C – YGC 10-6 D – YGC 10-4 E – YGC 10-5 F – GYC 10-6
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IMAGEN OBSERVADA EN EL MICROSCOPIO ÓPTICO
DESCRIPCIÓN DE LAS COLONIAS OBSERBADAS 100X
-
Gram positivas (color morado intenso) Levaduras Ovaladas En gran cantidad dilución de GYC 10-5
-
Gram positivas (color morado no tan intenso) Levaduras Ovaladas Un poco menos que la cantidad de la A dilución de GYC 10-4
-
-
Gram positivas (color morado intenso) Levaduras Ovaladas Un poco menos que la cantidad de la B dilución de YGC 10-6
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-
Gram positivas (color morado intenso) Levaduras Ovaladas Dilución de YGC 10-4
-
Gram positivas (color morado intenso) Levaduras Ovaladas Dilución de YGC 10-5
-
Gram positivas (color morado intenso) Cocos Forma redonda bien definidas En gran cantidad dilución GYC 10-6
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4.6 Resultados de Aislamiento por Estrías A continuación se observan los resultados de aislamiento por estrías que se le realizaron a los medios seleccionados en donde se encontraban los microorganismos de interés:
A
B
D
C
Las anteriores imágenes son el resultado del método de aislamiento por estrías que se le realizaron a las diluciones de 10-4 y 10-5. Como se puede observar solo A y B cumplen con los requerimientos adecuados para poder realizar pruebas bioquímicas, ya que C y D no fueron aisladas correctamente y por ende no se toman en cuenta para poder seleccionar el microorganismo de interés. 29
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4.7 Coloración de Gram para Verificación de Pureza de Levaduras Para confirmar la pureza de las levaduras encontradas se toma una de las colonias de los cada medio en este caso de A y B, los cuales fueron aislado correctamente y por ende se procede a realizar coloración de Gram para poder realizar pruebas bioquímicas y confirmar la pureza de los microorganismos de interés: COLONIA SELECCIONADA
COLORACIÓN DE GRAM
OBSERVACIONES
Según los resultados de coloración de Gram que se realiza al medio A, se observa que los microorganismos obtenidos son levaduras y por tanto se puede realizar pruebas biomequimicas esta. Se verifica que no están contaminadas.
A Según los resultados de coloración de Gram que se realiza al medio B, se observa que los microorganismos obtenidos son levaduras y por tanto se puede realizar pruebas biomequimicas esta. Se verifica que no están contaminadas.
B
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4.8 Identificación de Microorganismos a partir de Pruebas Bioquímicas A continuación se realizan las pruebas bioquímicas de fermentación de azúcares y tolerancia de etanol para el microorganismo de interés en este caso las levaduras obtenidas según la coloración de Gram y los medios empleados que se utilizaron para elaborar estas pruebas. 4.8.1 Cálculos de Fermentación de azúcares Se preparan 30mL para cada uno de los medios en 6 tubos de ensayo para cada carbohidrato a probar: NaCl 8.5 g/L 30𝑚𝐿 ∗ (
8,5𝑔 ) = 0,25𝑔 1000𝑚𝐿
30𝑚𝐿 ∗ (
5𝑔 ) = 0,15𝑔 1000𝑚𝐿
Peptona 5 g/L
Carbohidrato a probar: (Glucosa, sacarosa, maltosa, ribosa, xilosa y latosa) 10 g/L 30𝑚𝐿 ∗ (
10𝑔 ) = 0,3𝑔 1000𝑚𝐿
El rojo de fenol es aplicado después de haber diluido cada uno de los componentes en la preparación del medio. Rojo de fenol 1mL 30𝑚𝐿 ∗ (
10𝑔 ) = 0,3𝑔 1000𝑚𝐿
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Se toma muestra de A y B y se homogeniza en cada uno de los medios como se ve en la figura 8.
Imagen 8. Procedimiento de fermentación de azúcares
4.8.2 Cálculos de Tolerancia al Etanol Etanol al 2% 5𝑚𝐿 ∗ (
2𝑚𝐿 100𝑚𝐿 )( ) = 0,104𝑚𝐿 1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
5𝑚𝐿 ∗ (
4𝑚𝐿 100𝑚𝐿 )( ) = 0,208𝑚𝐿 1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
5𝑚𝐿 ∗ (
6𝑚𝐿 100𝑚𝐿 )( ) = 0,313𝑚𝐿 1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Etanol al 4%
Etanol al 6%
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Etanol al 8% 5𝑚𝐿 ∗ (
8𝑚𝐿 100𝑚𝐿 )( ) = 0,417𝑚𝐿 1000𝑚𝐿 96𝑚𝐿
Se homogeniza la muestra en cada una de las concentraciones del etanol como se visualiza en la figura 9.
Imagen 9. Procedimiento de tolerancia al etanol
4.8.3 Resultados de Fermentación de Azúcares
Maltosa
Sacarosa
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Glucosa
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Lactosa
Xilosa
Ribosa
Imagen 10. Fotos de resultados de prueba de azúcares, realizada en laboratorio de Microbiología
Positiva + Negativa Tipo de azúcar
Muestra A YGC 10
Maltosa Sacarosa Glucosa Lactosa Xilosa Ribosa
-5
Muestra B YGC 10-4
+ + +
+ + +
-
-
Se observa que en esta prueba solo dan positivas la maltosa, la sacarosa y la glucosa y las demás son negativas, estos resultado indican la posible presencia del microorganismo de interés que en este caso es la Saccharomyces cerevisiae según el marco teórico.
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4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol La siguiente prueba de tolerancia de etanol se le realiza solo a la muestra A (dilución YGC 10-5) la cual muestra los siguientes resultados:
Imagen 11. Imagen de resultados de prueba de etanol
En la anterior imagen se observa que solo el tubo ensayo que contiene un 6% de estanol dio positiva que a diferencia de las otra dieron negativa la siguiente foto es evidencia de ello:
Imagen 12. Foto de resultados de prueba de tolerancia de etanol realizada en laboratorio de Microbiología
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5. ANÁLISIS DE RESULTADOS Al desarrollar la práctica de laboratorio se prepararon varios medios de cultivo para el crecimiento de los microorganismos de interés en este caso levaduras y bacterias acéticas a partir del jugo obtenido de naranjas de la variedad “valencia” o citrus sinensis. Se encontraron en las diferentes colonias observadas, las cuales fueron clasificadas a partir de las disoluciones obtenidas que por medio de método de tinción de Gram, todas dieron gram positivas. Además se encontró que al efectuar el conteo de unidades formadoras de colonias existentes en cada una de las muestras realizadas, estas presentan un mayor valor en las colonias preparadas en el Agar – agar GYC que en las colonias preparadas en el agar – agar YGC. El conteo de la carga microbiana para cada una de las muestras trabajadas es el siguiente, varía de acuerdo a la disolución y el medio. Disolución al 10-4 en Agar YGC con carga microbiana de 6,56 x 106 UFC/mL. Disolución al 10-5 en Agar YGC con carga microbiana de 2 x 106 UFC/mL. Disolución al 10-6 en Agar YGC con carga microbiana de 5 x 105 UFC/mL. Disolución al 10-4 en Agar GYC con carga microbiana de 6,96 x 106 UFC/mL. Disolución al 10-5 en Agar GYC con carga microbiana de 2,26 x 107 UFC/mL. Disolución al 10-6 en Agar GYC con carga microbiana de 2,5 x 107 UFC/mL. El resultado de aislamiento por estrías es un método que fue realizado a las disoluciones 10-4 y 10-5 y como se observa, solo las muestras A y B cumplen con los requerimientos adecuados para realizar pruebas bioquímicas ya que fueron correctamente aislados los microorganismos de interés. Por ultimo en los resultados de pruebas bioquímicas, en la prueba de azúcares la maltosa, la sacarosa y la glucosa dieron positivas, mientras que la lactosa, la xilosa y la ribosa dieron negativas los cual de acuerdo a estos resultados, podemos dar posible certeza de la presencia del microorganismo de interés Saccharomyces cerevisiae, el cual esta bacteria acética ayudará a la elaboración de vinagre de Naranja Valencia. En la prueba de Tolerancia de Etanol se observan en los resultados que solo el que posee el 6% de etanol da positivo mientras que el de 2%, 4% y 8% dan negativos lo cual nos indica que se puede dar posible certeza de presencia del microorganismo de interés, ya que la tolerancia de etanol es una de las características de la levadura acética.
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6. CONCLUSIONES Se prepararon los respectivos medios de cultivo agar-agar YGC y GYC para el crecimiento y desarrollo del microorganismo de interés (levaduras y bacterias acéticas), realizando los respectivos cálculos y adecuándolos de acuerdos a lo requerido. Para lo anterior se tuvieron en cuenta diferentes tipos de disoluciones preparadas partiendo del agua peptonada y el fermento de la Naranja Valencia. Se realizó aislamiento microbiano a partir de la caracterización macroscópica de los cada uno de los microorganismos recuperados del fermento de Naranja valencia (Citrus sinensis). Se caracterizaron algunas colonias obtenidas en la preparación de medios de cultivo y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades halladas en la caja de Petri. Se efectuó coloración de Gram para identificación de Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas. Se aislaron los microorganismos de interés a partir del método de aislamiento por estrías. Se hicieron pruebas Bioquímicas a los microorganismos de interés como prueba de fermentación de azúcares y tolerancia de etanol, las cuales dieron positivas de acuerdo a lo esperado para evidenciar la presencia del microorganismo de interés.
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7. BIBLIOGRAFÍA Instructivo para la elaboración de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de interés biotecnológico práctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014. Instructivo para realizar la técnica de aislamiento por estrías práctica de laboratorio práctica 2 y 3. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014. Instructivo para la identificación de microorganismos mediante pruebas bioquímicas práctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014 HERNANDEZ, Alicia. Microbiología Industrial. [En línea]. http://books.google.com.co/books?id=KFq4oEQQjdEC&printsec=frontcover&sourc e=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false> [Citado el 23 de julio de 2014]
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