Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Facultad de ingeniería
Microbiología Dra. Yolanda Yolanda Jasso Pineda Tinción Tinción de células bacterianas González Pérez Esaú
Miércoles ! de "ebrero del !#$
%&T'(D)**%+& El ta,a-o de la ,aoría de las células bacterianas es tal /ue resultan di"íciles de 0er con el ,icrosco1io ó1tico. 2a 1rinci1al di3cultad es la "alta de contraste entre la célula el ,edio /ue la rodea4 el ,edio ,ás si,1le de au,entar el contraste es la utilización de colorantes. Estos 1ueden e,1learse 1ara distinguir entre ti1os di"erentes de células o 1ara re0elar la 1resencia de deter,inados constituentes celulares4 tales co,o 5agelos4 es1oras4 cá1sulas4 etc. 2as células general,ente son tratadas 1ara coagular el 1roto1las,a antes de te-irlas4 1roceso lla,ado 36ación. Para bacterias4 la 36ación 1or calor es lo ,ás co,ún4 aun/ue ta,bién 1ueden 36arse con sustancias /uí,icas co,o "or,alde7idos4 ácidos alco7oles. 2a 36ación 1roduce 7abitual,ente un encogi,iento de las células8 la tinción 1or el contrario 7ace /ue 1arezcan ,aores. Des1ués de la 36ación 0iene la tinción. 2os colorantes son general,ente co,1uestos orgánicos /ue tienen a3nidad es1ecí3ca 1or los ,ateriales celulares4 ,uc7os están cargados 1ositi0a,ente 9catiónicos8 azul de ,etileno4 cristal 0ioleta sa"ranina: se co,binan con intensidad a los constituentes celulares cargados negati0a,ente 9ác. nucleicos 1olisacáridos:. (tros colorantes son ,oléculas cargadas negati0a,ente 9aniones8 eosina4 ro6o *ongo4 etc.: /ue se co,binan con los constituentes celulares cargados 1ositi0a,ente 91roteínas:. 2a cantidad4 "uncionalidad es1eci3cidad de los colorantes es ,u a,1lia. ;i se desea au,entar el contraste4 son su3cientes ,étodos si,1les de tinción. El azul de ,etileno es un buen e6e,1lo de tinción si,1le 1ues no oscurece los detalles celulares. 2as tinciones son de gran utilidad 1ero 1ueden conducir a errores 1or la "or,ación de
(>JET%?(; •
@1render la técnica de 1re1aración de un "rotis4 36ación coloración ,ás utilizada en ,icrobiología
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*lasi3car algunas es1ecies bacterianas en Gra, 1ositi0as Gra, negati0as
M@TE'%@2E; Y MAT(D(; • • • • •
Muestras de bacterias Mec7ero >unsen *erillos Marcador indeleble Portaob6eto
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Juego
de
colorantes
1ara
tinción de Gra, Puente 1ara te-ir las la,inillas @ceite de in,ersión Pa1el es1ecial 1ara li,1iar lentes de ,icrosco1io
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. *olocar en el centro de un 1ortaob6etos li,1io sin grasa una gota de agua destilada si la ,uestra es sólida. To,ar una 1e/ue-a cantidad de culti0o con el asa o con un 7iso1o 1onerla sobre la gota de agua. Dis1ersar el sólido con ,o0i,ientos circulares 7asta /ue se obser0e una sus1ensión 7o,ogénea. !. EBtienda la ,uestra en el 1ortaob6etos 1ara "acilitar el secado. C. Para "acilitar la 36ación de la ,uestra al 0idrio4 1ase 0arias 0eces éste 1or la lla,a azul del ,ec7ero. $. *olocar las la,inillas en un 1uente4 cubrir la ,uestra co,1leta,ente con cristal 0ioleta de6ar re1osar 1or ,in. . . . H. •
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En6uagar con agua. @-adir solución de lugol 9odo: de6ar re1osar ,inutos. En6uagar. @gregar alco7olacetona 1or ! segundos. En6uagar. @-adir solución de sa"ranina 7asta cubrir la ,uestra de6ar re1osar 1or C# segundos. En6uagar. Des1ués de secar obser0ar al ,icrosco1io
>acterias e,1leadas en la 1rácticaI Pseudomona sp Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella typhi Citrobacter sp
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'E;)2T@D(; Y D%;*);%+& DE 'E;)2T@D(;
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>acteria
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Pseudomona sp
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E. coli S. typhi Citrobacter sp
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2a técnica de tinción de Gra, utilizada 1ara clasi3car las bacterias en Gra, 1ositi0as Gra, negati0as en "unción del grosor la co,1osición de la 1ared celular bacteriana4 tiene una utilidad indiscutible. 2a 1ared de la célula bacteriana sir0e 1ara dar su ta,a-o "or,a al organis,o así co,o 1ara 1re0enir la lisis os,ótica. 2a sustancia /ue "or,a la 1ared celular bacteriana /ue con3ere rigidez es el 1e1tidoglicano. 2a 1ared de la célula Gra,1ositi0a es gruesa consiste en 0arias ca1as interconectadas de 1e1tidoglicano así co,o algo de ácido teicoico. General,ente4 H#K L#K de la 1ared de la célula Gra,1ositi0a es 1e1tidoglicano. 2a 1ared de la célula Gra,negati0a4 1or otro lado4 contiene una ca1a ,uc7o ,ás delgada4 única,ente de 1e1tidoglicano está rodeada 1or una ,e,brana eBterior co,1uesta de "os"olí1idos4 li1o1olisacáridos4 li1o1roteínas. ;ólo #K !#K de la 1ared de la célula Gra,negati0a es 1e1tidoglicano.
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2os resultados de la tabla anterior "ueron eBtraídos de la literatura 1uesto /ue la 1re1aración de los "rotis 1robable,ente se lle0ó a cabo de ,anera incorrecta no se obser0ó ,icroorganis,os en los 1ortaob6etos. En este re1orte utiliza,os el ,étodo descrito en el ,anual de 1rácticas sin e,bargo en la literatura consultada se encontraron 1e/ue-as 0ariaciones en el 1rocedi,iento.
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El Frotis 36ado con calor se ti-e ,in con ?ioleta *ristal4 se la0a con agua4 se cubre con solución Yodada durante ,in se la0a de nue0o con agua4 decolorar con ,ezcla alco7ol etílicoacetona. Escurrir cubrir con ;a"ranina 9color de contraste: durante !# seg. 2a0ar secar. En el 1árra"o anterior se indica un re1oso de !# segundos única,ente des1ués de agregar la sa"ranina4 1udiendo esto a"ectar la tinción.
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2as células 36adas al calor sobre un 1ortaob6etos se ti-en4 1ri,ero con una solución de cristal 0ioleta son la0adas des1ués 1ara /uitar el eBceso de colorante. En este estado4 todas las células4 tanto las Gra,1ositi0as co,o las Gra,negati0as4 están te-idas de azul. El 1ortaob6etos se cubre entonces con una solución de odooduro 1otásico. El ingrediente acti0o es a/uí el %N8 el O% si,1le,ente 7ace soluble el %N en agua. El %N entra en las células "or,a un co,1le6o insoluble en agua con el cristal 0ioleta. De nue0o tanto las células Gra,1ositi0as co,o las Gra,negati0as se encuentran en la ,is,a situación. ;e lle0a a cabo des1ués la decoloración4 usando una ,ezcla de alco7olacetona4 sustancias en las /ue es soluble el co,1le6o %Ncristal 0ioleta. @lgunos organis,os 9Gra, 1ositi0os: no se decoloran4 ,ientras /ue otros 9Gra,negati0os: lo 7acen. 2a di"erencia esencial entre esos dos ti1os de células está 1or tanto en su resistencia a la decoloración8 esta resistencia se debe 1robable,ente al 7ec7o de /ue en el caso de bacterias Gra,negati0as4 la ,ezcla de alco7olacetona es un sol0ente li1ídico disuel0e la ,e,brana eBterior de la 1ared de la célula . 2a delgada ca1a de 1e1tidoglicano es inca1az de retener el de co,1le6o cristal 0ioletaodo la célula se decolora. 2as células Gra,1ositi0as4 a causa de sus 1aredes celulares ,ás es1esas 9tienen ,ás 1e1tidoglicano ,enos lí1ido:. Des1ués de la decoloración las células Gra,1ositi0as son toda0ía azules4 1ero las Gra,negati0as son incoloras. abitual,ente se usa un colorante de color ro6o4 co,o la sa"ranina 1ara contraste8 des1ués de la coloración de contraste las células Gra,negati0as son ro6as4 ,ientras /ue las Gra,1ositi0as 1er,anecen azules. Mu 1robable,ente la ,ala e6ecución de la tinción de Gra, 1ro0ocó /ue no se obser0aran bacterias en el ,icrosco1io a #Q4 $#Q ##Q.Esta ,ala e6ecución se re3ere a ineBactitud en los tie,1os de re1oso cantidad de agua 1ara la0ar el "rotis. )na eBcesi0a cantidad de agua 1uede arrastras los reacti0os. @unado a esto4 los ob6eti0os del ,icrosco1io se encontraban sin ,anteni,iento sucios. EB1licando así el 1or/ué de los resultados.
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2a tinción de Gra, es ,u útil en la ,icrosco1ía sie,1re cuando se lle0e a cabo res1etando los tie,1os de re1osos4 cantidad de agua con /ue se en6uaga el "rotis el e/ui1o de laboratorio se encuentre en buenas condiciones.
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7tt1ISSS.,icroin,uno./b."cen.uba.ar;e,inarioTinciones.7t,
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7tt1Ien.Sii1edia.orgSiiPseudo,onas
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7tt1Ien.Sii1edia.orgSiiEsc7eric7iaUcoli
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7tt1Ies.Sii1edia.orgSiiFiebreUti"oidea
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7tt1Ien.Sii1edia.orgSii;ta17lococcusUaureus
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7tt1Ien.Sii1edia.orgSii*itrobacter
