MACAM-MACAM TEKNIK IMUNOASSAY UJI PRESIPITASI
Teknik imunopresipitasi merupakan salah satu cara yang banyak dipakai untuk mengukur kadar antigen atau antibody. Antibody yang direaksikan dengan antigen spesifik membentuk kompleks yang tidak larut (presipitat) yang dapat diukur dengan berbagai cara. Reaksi presipitasi dapat dilangsungkan dalam media c air maupun media semisolid (gel). Dalam menerapkan teknik ini perlu dipertimbangkan beberapa keterbatasan. Hal yang paling menentukan m enentukan adalah spesifitas antiserum yang digunakan digun akan , dan larutan standar yang stabil dengan kadar yang pasti. Di samping itu, reaksi imunopresipitasi dipengaruhi oleh berbagai factor, diataranya aviditas antibody. Aviditas antibody menentukan derajat stabilitas kompleks antigen-antibodi pada tempat pengikatan (antigen binding site). Kompleks yang terbentuk cenderung berdisosiasi bila antibody mempunyai aviditas yang lemah, sebaliknya makin tinggi aviditas antibody makin stabil kompleks antigen-antibodi yang terbentuk. Selain itu, masih ada factor factor yang lain yang berpengaruh misalnya suhu, pH, dan molaritas larutan yang dipakai dan yang tidak boleh diabaikan adalah perbandingan antara konsentrasi antigen dengan antibody. 0 Beberapa jenis reaktan menghasilkan imunopresipitasi yang optimal baik pada suhu 0 C 0 maupun 37 C, sedangkan pH yang dianggap paling baik adalah pH yang netral, yaitu antara 6-7,5. Pakar lain menyatakan pH sebaiknya tidak kurang dari 6 dan tidak lebih dari 8,6. Pada pH kurang dari 6 dan lebih dari 8,6 kompleks antigen-antibodi mudah berdisosiasi sehingga tidak terjadi presipitasi. Larutan yang dipakai sebaiknya larutan dengan molaritas 0,15 M. larutan dengan molaritas 0,15 M mencegah terjadinya presipitasi. ZE sempit → Ag bersifat mudah larut ZE lebar → Ag bersifat tdk mudah larut, BM besar, & multikomponen Ag
Konsentrasi Ag berlebih → Komplek Ag-Ab Ag-Ab yg terbentuk larut kembali disebut postzone effect Konsentrasi Ab berlebih → Komplek Ag-Ab Ag-Ab yg terbentuk tetap larut disebut prozone effect Faktor yg mempengaruhi : Aviditas Ab → stabilitas komplek Ag-Ab Ag-Ab o Suhu (optimal 0-37 C) pH (netral = 6-7,5), 6-7,5), pH < 6 ; >7,5 → mudah disosiasi disosiasi Molaritas (molaritas < 0,15 M) ; >0,15 M → men-cegah men-cegah presipitasi
.
Terdapat beberapa cara pengujian pada metode presipitasi, yakni:
A. Uji Cincin
Uji cincin adalah uji presipitin yang paling sederhana. Kedalam sebuah tabung bermulut kecil diletakkan larutan antigen diatas larutan serum yang mengandung antibodi. Kedua larutan tersebut akan berdifusi sampai keduanya mencapai konsentrasi optimum untuk terjadinya presipitasi, pada titik tersebut muncullah suatu zona rapat atau cincin endapan diantara kedua larutan tersebut. B. M etod tode e Di fu si A ga garr
Ketepatan yang lebih tinggi dan pemisahan komponen di dalam campuran antigen dan antibodi dapat diperoleh dengan cara membiarkan reaktan-reaktan tersebut berdifusi bersama-sama dalam di dalam suatu gel agar. #Metode difusi tunggal. Dalam metode difusi tunggal yang dirancang Oudin, antigen ditaruh diatas gel agar yang mengandung antiserum di dalam suatu tabung reaksi bermulut sempit. Setelah dibiarkan selama beberapa jam atau beberapa hari, antigen itu merembes ke dalam gel membentuk pita-pita endapan pada berbagai taraf, bergantung kepada jumlah dan macam antigen-antibodi yang ada. Karena presipitasi terjadi ketika antigen menembus gel, maka cincin endapan mula-mula muncul di dekat puncak gel dan nampaknya bergerak perlahan ke arah bawah. Efek semacam ini mungkin sesungguhnya disebabkan karena adanya peningkatan jumlah antigen yang menyebabkan endapan itu melarut (karena reaksi antigenantigen antibodi itu dapat balik). Presipitasi terbentuk kembali pada posisi yang lebih kebawah dalam tabung tersebut, yaitu pada tempat konsentrasi antigen yang optimum. Faktor-faktor yang menentukan taraf untuk terjadinya reaksi ialah ukuran molekul dan konsentrasi nisbi reaktan. #Metode difusi ganda. Oakley dan Fulthorpe memodifikasi teknik Oudin dalam metode difusi tunggal dengan cara menaruh antiserum di dalam agar di dasar tabung reaksi dan melapisinya dengan gel agar lalu diatasnya ditaruh larutan antigen. Kedua reaktan itu berdifusi kearah masing-masing di dalam agar dan presipitasi terjadi pada titik terdapatnya konsentrasi optimum. Ini adalah difusi ganda satu dimensi. Metode difusi ganda dua dimensi yang dirancang oleh Ouchterlony mempunyai keuntungan dibandingkan dengan metode sebelumnya, bahwa berbagai antigen dan antiserum dapat dibandingkan secara langsung. Dalam uji ini, reaktan merembes dari sumursumur yang berisi antiserum dan antigen homolog dalam konsentrasi optimum. Bila pita endapan yang dibentuk kedua antigen dan antibodi itu melebur pada titik pertemuannya, maka berarti kedua antigen itu sama. Bila bersilangan, artinya kedua antigen itu berbeda.
# Imunodiffusi Tes imunodifusi didasarkan pada pembentukkan imunokompleks yang berdasarkan berat molekul yang tinggi, presipitat dan bentuk garis presipitasi dapat diamati secara makroskopik. Metode ini untuk mendapatkan hasil diperoleh kurang lebih satu minggu itupun hanya hasil kualitatif. Teknik imunodifusi dapat dilakukan pada cawan petri yang mengandung agar gelatin 1% dalam suasana buffer posfat atau tris buffer. Sumur-sumur dibuat menggunakan perforator, untuk menempatkan antigen di sumur dan serum-serum diletakkan mengeliligi antigen. Antigen dan antibodi dalam serum akan berdifusi dalam agar dan ketika bertemu akan membentuk garis agak kabur yang akan terlihat pada cahaya langsung dan dengan latar belakang gelap. Kontrol positif (standar serum) harus disertakan untuk panduan pembacaan hasil positif dan interpretasi. Teknik imunodifusi selain untuk serum juga dapat digunakan untuk LCS dan urine. Teknik imunodifusi biasa digunakan pula untuk deteksi antibodi terhadap jamur pathogen : Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Paracoccidioides, dan beberapa jamur opportunistic yang pemeriksaannya memerlukan waktu sekurang-kurangnya 48 jam bahkan lebih untuk mengembangkan pembentukan pita . #Imunodifusi ganda. Yang masih banyak dipakai adalah imunodifusi ganda menurut Ouchterlony. Teknik ini menggunakan lapisan agar sebagai media yang memisahkan antigen dari antibodi. Pada lapisan agar tersebut dibuat sumur-sumur, kemudian ke dalam dua sumur yang berhadapan masing -masing dimasukkan antigen dan antibodi. Setelah itu antigen dan antibodi dibiarkan mendifusi kedalam lapisan agar dan ditempat dimana keduanya bertemu dan mencapai keseimbangan akan terbentuk kompleks antigen -antibodi berupa gads presipitasi. Teknik ini dapat dipakai untuk menetapkan antigen atau antibodi secara semikuantitatif, yaitu dengan melakukan beberapa pengenceran dan melaporkan pengenceran tertinggi yang masih dapat membentuk presipitasi. # Elektroimunodifusi. Prinsip cara elektroimunodifusi ini sama dengan cara Ouchterlony, hanya saja di sini difusi dipercepat dengan meletakkan kedua reaktan di antara medan listrik. Juga di sini presipitasi kompleks antigen-antibodi terjadi pada titik keseimbangan kedua reaktan.
#Imunoelektroforesis Imunoelektroforesis merupakan gabungan antara teknik pemisahan fraksi-fraksi protein dengan cara elektroforesis dan teknik imunodifusi ganda. Setelah fraksi-fraksi protein dipisahkan
satu dari yang lain dengan elektroforesis, ke dalam parit yang dibuat sejajar dengan garis migrasi fraksi-fraksi protein, dimasukkan antiserum, kemudian dibiarkan berdifusi. Setiap fraksi protein akan beraksi dengan masing-masing antibodi spesifik yang terdapat di dalam antiserum, sehingga masing-masing fraksi kemudian dapat diidentifikasikan secara terpisah. Cara ini selain dapat dipakai menetapkan adanya antigen tertentu, juga dapat dipakai untuk menunjukkan kelainan pada salah satu fraksi, misalnya kelainan imunoglobulin yang disebut gamopati monoklonal atau paraprotein.9"0 Pada keadaan normal atau pada gamopati polildonal garis presipitasi berbentuk lengkung merata, sedangkan paraprotein atau gamopati monoklonal menunjukkan kelainan dalam bentuk garis presipitasi seperti scooping, bulging atau bifurkasi. #Imunodifusi radial Prinsip imunodifusi radial menurut Mancini,' adalah menggunakan lapisan agar yang telah mengandung antibodi monospesifik kemudian ke dalam sumur-sumur yang dibuat pada agar tersebut dimasukkan serum yang akan diperiksa. Setelah serum dibiarkan berdifusi, maka presipitasi kompleks antigen-antibodi yang terjadi tampak sebagai suatu cincin di sekitar sumur. Cara ini adalah cara kuantitatif; besarnya cincin merupakan parameter untuk kadar antigen yang ada dalam serum dan dapat ditentukan dengan menggunakan kurve standar. Aplikasi klinik yang terpenting dari cara ini adalah penetapan imunoglobulin di dalam serum. #"Rocket elektroimunodifusi". Cara ini dikembangk:an oleh Laurell dan menupakan variasi cara imunodifusi radial. Juga di sini digunakan lapisan agar yang telah mengandung antibodi, kemudian ke dalam sumur sumur yang dibuat pada agar tersebut dimasukkan serum yang ingin diperiksa atau larutan standar. Difusi dipercepat dengan meletakkan lempeng agar ini di antara medan listrik, sehingga presipitasi kompleks antigen-antibodi tampak sebagai kerucut. Tinggi kerucut dapat diukur dan merupakan parameter untuk kadar antigen dalam serum. #Imunonefelometri. Dalam dekade terakhir telah dikembangkan suatu cara yang menggunakan alat yang dapat mengukur cahaya yang dihamburkan oleh molekul-molekul kompleks antigen-antibodi. Dengan menggunakan sinar laser sebagai sumber cahaya yang mempunyai energi yang lebih kuat daripada lampu halogen biasa, sensitifitas tes dapat ditingkatkan. # VDRL (Veneral Disease Research Laboratory test) Merupakan metode yang menggunakan prinsip presipitasi dengan bentuk produk akhir presipitin berkumpul terlihat secara makroskopis dan mikroskopis. Pasien yang terinfeksi treponema, pada umumnya Treponema. pallidum, penyebab shypilis membentuk antibodi seperti protein dinamakan reagin yang akan berikatan dengan antigen cardiolipinlecithin-coated cholesterol partikel, menyebabkan partikel berflokulasi. Karena reagin bukan merupakan antibodi langsung yang spesifik terhadap antigen T. pallidum, tes ini kurang spesifik tetapi baik digunakan untuk skrining tes. VDRL merupakan satu-satunya tes yang paling berguna untuk mendeteksi cairan LCS pasien tersangka Neuroshypilis, meskipun
kemungkinan terjadi positif palsu. Pelaksanaan tes VDRL memerlukan ketelitian, alat gelas yang bersih, dan harus memperhatikan rincian secara tepat, termasuk kontrol kualitas rutin. Sebagai tambahan, reagen yang akan digunakan harus disiapkan baru setiap pelaksanaan tes, serum pasien harus diinaktivasi dengan pemanasan selama 30 menit pada 56⁰C sebelum tes, dan hasilnya dibaca menggunakan mikroskop. # Counterimmunoelectrophoresis Jenis tes lain yang menggunakan prinsip presipitasi dan penggunaannya secara luas digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam jumlah sedikit. Kelebihan tes ini menggunakan muatan listrik yang dialirkan pada antigen-antibodi yang dites pada sistem buffer tertentu. Karena antigen dan antibodi dipertemukan satu sama lainnya dengan bantuan arus listrik pada suatu matriks semisolid untuk bermigrasi sehingga metode ini disebut Counterimmunoelectrophoresis (CIE). CIE merupakan modifikasi metode Ouchterlony yang dipercepat migrasi antigen antibodinya oleh adanya aliran listrik. Dengan pengecualian bakteri Streptococcus pneumonia pn eumonia serotype 7 dan 14, antigen bakteri akan bermuatan negatif pada suasana sedikit basa, sedangkan antibodi bersifat netral. Sifat antigen bakteri inilah yang digunakan pada prinsip metode CIE, dimana larutan yang mengandung antibodi dan larutan sampel diletakkan pada lubang sumur agarosa yang diletakkan pada permukaan kaca. Kertas atau fiber bersumbu digunakan untuk menjembatani dua agarosa yang bersebrangan untuk dilalui buffer yang sedikit alkali. Ketika dialiri arus listrik maka akan terjadi migrasi dari Antigen yang bermuatan negatif akan bermigrasi ke elektoda positif. Antibodi yang bermuatan netral akan terbawa oleh elektroda negatif . pada perbatasan antara sumur akan terbentuk zona ekuivalen, dan komplek antigen-antibodi membentuk garis presipitasi yang nampak, proses migrasi ini memerlukan waktu satu jam. Banyak antigen yang dapat diperiksa oleh metode CIE, mendeteksi hampir 0,01 sampai 0,05 mg/ml antigen yang setara dengan 103 organisme/ml larutan. Perlu disertai control pada setiap pengerjaan, CIE merupakan metode yang berdasarkan reaksi presipitasi yang cukup mahal, sehingga tidak banyak digunakan lagi dalam imunodiagnostik. UJI AGLUTINASI
Teknik ini merupakan metoda klasik dalam penetapan antibody atau antigen
Ag bentuk partikel direaksikan dengan Ab spesifik spesifik membentuk Aglutinasi
Reaksi 2 tahap : Ab dgn salah satu antigen binding site (Fab) bereaksi dgn Ag o o Fab yg lainnya berikatan dgn Ag lain yg sudah berikatan dgn Ab gumpalan (lattice) Faktor yang mempengaruhi: Muatan listrik protein,molaritas medium,vaksositas media,dan fenomena prozone
Jumlah antigen & antibodi hrs seimbang
Penerapannya: o
Widal,
gol darah tes kehamilan o Macam-macam Aglutinasi a. Aglutinasi Direk Untuk menetapkan Ab terhadap Ag yang berupa partikel atau sel o
contoh pemerksaan: reaksi Widal(deteksi antibodi terhadap S.tiphy), penyakit penyakit hemolitik, tes rheumatoid faktor (IgM dan IgG), tes syphilis dan tes kehamilan.
Interpretasi: Gumpalan Positif Tidak ada gumpalan Negatif b. Aglutinasi Indirek Untuk menetapkan antibodi terhadap Ag yang larut dengan melekatkan dengan antigen ini terlebih dahulu pada suatu partikel yang di sebut ”carrier”.
Partikel yang digunakan dalam teknik ini adalah lateks, eritrosit, karbon dan lainlain Faktor yang mempengaruh: afinitas konjugat antigen terhadap carrier, waktu inkubasi dengan serum penderita dan interaksi yang terjadi pada lingkungan mikro (pH dan konsentrasi protein). Contoh pemeriksaan: tes streptococcus grup A,Treponema pallidum,hormon tiroid,dan deteksi anti-Hbs
Interpretasi: Tidak ada gumpalan positif Ada Gumpalan Negatif c. Hambatan aglutinasi (Aglutination Inhibition) Modifikasi teknik aglutinasi untuk mendeteksi antigen yang larut
Cara kerja: 1. serum atau cairan yang akan diperiksa direaksikan terlebih dahulu dengan antibodi spesifik. 2. direaksikan dengan Ag yang dilekatkan pada suatu partikel. 3. Dilihat ada tidaknya aglutinasi Interpretasi: 1. Ag yang ada pada serum atau cairan yang diperiksa, mengikat Ab spesifik sehingga Ab tidak mampu lagi bereaksi dengan Ag pada permukaan partikel Uji positif(+)/tidak terjadi terjadi aglutinasi 2. Apabila dalam serum atau cairan yang diperiksa tidak tedapat Ag, maka antibodi yang bebas dapat bereaksi dengan Ag melekat pada permukaan partikel Uji negatif(-)/terjadi aglutinasi Contoh Pemeriksaan: uji kehamilan,penetapan FDP,mendeteks berbagai seperti rubella, influenza ,parainfluenza, dan mumps
virus
d. Aglutinasi Pasif Terbalik
Untuk menyatakan Ag yang larut dalam serum atau partikel lain.
Ab spesifik terhadap Ag bersangkutan dilekatkan pada permukaan carrier,baik eritrosit maupun partikel lain. e. fiksasi komplemen
Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.
Melekat pada permukaan sel pathogen dan berperan dalam penghancuran dengan aktifitas lisis sistem komplemen
Tahap : 1. Pengikatan sejumlah komplemen oleh kompleks Ag – Ag – Ab Ab 2. Penghancuran Eritrosit yg telah dilapisi hemolisin(sebagai indicator) oleh komplemen yang tersisa
Contoh pemeriksaan : - Sifilis - Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma) - Virus Herpes - Virus Rubella - Tripanosoma - Schistisoma Direct Aglutinasi Indirect Aglutinasi
Fiksasi Komplement
Hambatan Aglutinasi
Aglutinasi Pasif terbalik
3. Fiksasi komplemen
TES FIKSASI KOMPLEMEN Tes fiksasi komplemen merupakan teknik imunologi yang digunakan untuk menentukan antigen spesifik atau antibody apabila ada dalam serum pasien. Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.
Metode ini sangat umum digunakan untuk membedakan dan menemukan penyebab infeksi. Pada umumnya digunakan untuk pemeriksaan mikroorganisme yang sulit di identifikasi melalui metode pembiakan. Akan tetapi metode ini telah tergantikan oleh metode serological lainnya dalam dignosa klinik seperti ELISA dan metoda identifikasi patogen yang didasarkan pada DNA khususnya polymerase chain reaction (PCR). Pada teknik fiksasi komplemen, komplemen digunakan ketika antigen bereaksi dengan antibodi. Komplemen dapat ditemukan pada serum babi Guinea. Ketika sel darah merah ditambahkan dengan anti-red-cell-antibody, sel darah merah akan lisis ketika ditambahkan komplemen (hasil tes negatif). Apabila dalam serum mengandung antibodi maka complemen akan menfiksasi ikatan antigen dan antibodi sehingga ketika ditambahkan anti-red-cell antibodi tidak menghasilkan hemolisis sehingga tes menunjukkan hasil positif. Aplikasi Fiksasi Komplemen, Misalnya pada deteksi : 1. Adenovirus 2. Trypanosoma 3. Jamur (Blastomyces, Coccicioides, & Histoplasma) 4. Virus Influenza A & B 5. Parainfluenza 1, 2, & 3 6. Poliovirus 1, 2, & 3 Respiratory Syncitial Virus (RSV) UJI MUNOFLOURESCENT
Merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet
Mereaksikan antibody dan antigen spesifik dan anti-antibodi yang dilabel dengan Fluoresence Isothiocyanat (FITC) sehingga terpancar sinar warna hijau atau label dengan Rodhamin menghasilkan Rodhamin menghasilkan warna merah Fluorescent Antibody Technique (FAT) untuk penggunaan didalam mikrobiologi telah diperlihatkan pertama kali oleh Coons, at all pada tahun 1942 dan mulai diperkenalkan sejak tahun 1962 dalam bidang pemeriksaan parasitologi dengan memakai tekhnik indirect fluorescent antibody test Jenis sampel: serum, cairan ludah, cairan otak, cairan mata , urine,mukosa usus, mukosa mulut, dan dalam jaringan. Penerapannya : 1. Deteksi Echerchia antibody, 2. Deteksi Fluorescent Treponemal antibody (FTA) 3. Deteksi Legionnella antibody 4. Deteksi Mumps IgM antibody 5. Deteksi Q Fever antibody 6. Deteksi Rocky Mountain Spotted Fever antibody 7. Deteksi Toxoplasma IgG antibody 8. Deteksi Typhus antibody
Jenis-jenis Imunoflourecent: 1. Direct immunoflourescent :
Untuk pemeriksaan antigen Ab dilabel dengan marker fluorescent fluorescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan Cara Pemeriksaan. o 1. Sel pada deck cover glass yang glass yang diinfeksi dengan virus difiksasi dengan aceton-20 C selama 15 menit. 2. Cuci dengan PBS dan keringkan pada temperature ruangan sampai kering. 3. Masukan deck cover glass glass pada PBS yang mengandung 1%FCS dan biarkan 15 menit. 4. Siapkan serum sampel dan encerkan dengan PBS sesuai keperluan. 5. Teteskan 20µl serum sampel di atas glass obyek. 6. Taruh deck cover glass glass di atas sampel dengan bagian sel di bawah dan letakkan dalam kotak dan kertas yang telah dibasahi dengan air. o 7. Inkubasi pada incubator denagan temperatur 37 C selama 45 menit. 8. Cuci dengan PBS 1%FCS selama 15 Menit. 9. Siapkan Konjugat fragmen Imunoglobulin dengan pengenceran 1:100µl. 10. Teteskan Konjugat 20µl di atas glas obyek dan letakkan deck cover glass di glass di atasnya. o 11. Inkubasi pada incubator dengan temperatur temperatur 37 C selama 15 menit 12. Cuci dengan PBS 1%FCS selama selama 15 menit dan selanjutnya selanjutnya angkat deck cover glass dan sentuhkan deck cpver glass pada kertas tissue agar airnya berkurang, sehingga kering tapi basa.
13. Teteskan Glycerin 50% 20µl di atas glass obyek dan selanjutnya deck cover glass di taruh diatasnya dan langsung dilihat hasilnya dengan mikroskop fluorescent pada o pembesaran 40x. catatan preparat ini dapat disimpan pada 4 C sampai 2-3 minggu. 2. In-direct immunoflourescent Untuk mendeteksi antibody terhadap jaringan atau komponen sel tertentu
Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama). Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyal floresen semakin meningkat
Cara pemeriksaan: 1. Antigen mikroba diletakkan dalam kaca objek dan diberi bahan fiksatif 2. Serum pasien yang telah diencerkan diinkubasi bersama antigen pada kaca objek, kemudian dicuci 3. Ditambahkan Antibodi berlabel flouresen (konjugat) 4. Kaca objek dicuci hemudian dikeringkan, kemudian dibaca dibawah mikroskop flouresen Preparat diamati adanya area terang berfloresensi warna hijau dan dibandingkan dengan control positif dan negatif. Adanya floresensi hijau menandakan adanya antibodi terhadap antigen Direct Flouresence Indirect Flouresence
RADIOIMMUNOASSAY
Prinsip dasar : Didasarkan pada reaksi antara antibodiDidasarkan pada reaksi an tara antibodi(dalam konsentrasi terbatas) dengan(dalam konsentrasi terbatas) denganberbagai konsentrasi antigenberbagai konsentrasi antigen. Kegunaan: * Digunakan untuk menemukan antigen * Digunakan untuk menemukan antigen tunggal/antibodi dalam cairan biologis tunggal/antibodi dalam cairan biologis
*Tehnik pemeriksaan untuk menentukanantibodi/antigen dengan reagen yangantibodi/antigen denga dengan n reag reagen en yang yang bertand ber tandaa zat radioak radi oaktif. tif. Ab + Ag berlabel + radioisotope
ikatan Ab-Ag berlabel -radioisotop
Jumlah Ag berlabel yg terikat pd Ab diukur dggamma counter Terdapat dua cara pemeriksaan RIA: A. Reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase )/Kompetitif 1. Antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padat misalnya dinding tabung plastic 2. Sampel pasien Ag ditambahkan bersama dengan sejumlah tertentu Ag berlabel radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi yang timbul. 3. Ag-Ag berlabel-Ab bereaksi kompetitf dan membentuk kompleks Ag-AbAg berlabel 4. Pemisahan kompleks Ag-Ab-Ag berlabel dengan mengendapkannya secara kimiawi menggunakan ammonium sulfat,asam trichlorasetat/polietilen glikol,maupun mereaksikannya dengan antibody kedua atau filtrasi dengan gel B. Reaksi pada zat padat atau ata u partikel (solid phase)/Non Kompetitif/Sandwich 1. Melekatkan Ag atau Ab pada suatu partikel 2. Mereaksikannya dengan specimen(Ag) yang akan di uji. 3. Ditambahkan Ab berlabel 4. Terbentuk kompleks Ab-Ag-Ab berlabel,lalu dipisahkan dan diukur radioaktivitasnya 5. Banyaknya Ab berlabel yang terikat pada kompleks merupakan kadar Ag dalam spesimen Keuntungan : Sensitivitas dan presisi yang tinggi ,Mudah dikerjakan, Pekerjaannya lebih cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar. Kerugian : Reagen kurang stabil, Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif (radioactive hazardous) Contoh pemriksaan : HBsAg,anti HBs,macam-macam hormone,macam-macam pertanda ganas,dan IgE spesifik
ENZYME IMMUNOASSAY (EIA)/ ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut „sandwich‟ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalamplate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh le bih sensitif. Aplikasi ELISA - ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen.
Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. - ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat. - Kegunaan lain dari ELISA meliputi: 1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB. 2. deteksi rotavirus dalam tinja. 3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum. 4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.
-
Tipe-tipe ELISA Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut: 1. Indirect ELISA 2. Sandwich ELISA 3. Competitive ELISA 1. Indirect ELISA
Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah: a) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. b) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, non -interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. mikrotiter. Tahap ini dikenal
sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi adsorpsi non-spesifik dari protein lain lain ke plate. c) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. d) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. e) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. f) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. g) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. h) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika ha nya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berba gai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus b erkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. 2.
Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: a) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi „penangkap‟ b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir c) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat e) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen f) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer g) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia i) Diukur absorbansinya absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini: 3.
Competitive ELISA
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu: a) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya b) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi d) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim e) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi. Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:
4. Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse dimakalah yang diterbitkan)
Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09; USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin 2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan mencelupka n ogives di microwells standar microplates pra-diisi dengan reagen. Kerugian ELISA: Reaksi enzim lebih kompleks dari pada label isotop Masih dipengaruhi faktor environment (plasma constituents) Keuntungan ELISA: Mudah dikerjakan Relatif murah, simultan dgn pemeriksaan yg lain Bahaya radioaktif (-)
IMMUNOBLOTING
Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut akan ditransfer ke nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi protein target Ditemukan oleh George stark pada Universitas Stanford. Nama western blot diberikan pada teknik tersebut oleh Neal Burnette and Sushant Bhat, merupakan nama yang dimiripkan dengan teknik deteksi DNA southern blot yang ditemukan Edwin southern dan Northern blot yang digunakan deteksi RNA. Penerapannya : Untuk konfirmasi serum HIV Tahapnya : 2.1 Persiapan Sampel Sampel bisa diambil dari kultur sel maupun bagian dari jaringan. Untuk jaringan yang solid bperlu dilakukan penghancuran menggunakna blender atau homogenizer. Detergen, garam dan buffer juga bisa digunakan untuk melisiskan membrane sel. Protease dan phospatase inhibitor diberikan untuk mencegah terjadinya pemecahan jaringan dengan enzimnya sendiri. Persiapan jaringan biasanya dilakukan apda suhu dingin untuk mencegah degradasi protein. Untuk memisahkan komponen sel dengan organel, dilakukan sentrifugasi. Protein dari sampel diseparasi mengunakan elektoforesis SDS page berdasarkan isoelektrik poin, berat molekul, kelistrikan atau kombinasinya SDS PAGE akan mempertahankan polipeptida dalam bentuk denaturasi setelah dibersihkan dari struktur sekunder dan tersier sehingga protein dapat dipisah berdasarkan berat molekul.
Gambar 1. Langkah dalam persiapan sampel western blot
2.2 Transfer Untuk membuat protein dari SDS page bisa dideteksi oleh antibody, protein tersebut perlu ditransfer dari gel ke membrane nitroselulosa atau polyindylidene difluoride (PVDF). Membrane tersbut diletakkan di atas gel dan ditambahkan buffer. Protein akan masuk pada membrane dan siap dideteksi dengan western blot Untuk mengecek keseragaman dari transfer protein dari gel ke membrane dapat dicek dengan pewarnaan commasie brilliant blue dan ponceau S
Gambar 2. Langkah dalam SDS PAGE 2.3 Blocking Blocking dilakukan untuk mencegah antibody sekunder bereaksi dengan protein non spesifik yang masuk pada sampel. Blocking biasanya menggunakan BSA atau susu skim tanpa lemak pada TBS. pemberian Tween 20 atau Tritonn X-100 dapat memperjelas hasil final dari western blot mengurangi false positif 2.4 Deteksi Dua Langkah Pada saat deteksi membran dengan antibody, untuk deteksi dua langkah dilakukan persiapan antibody primer yang dibentuk dari produksi mandiri. Antibody primer dengan antigen yang di inginkan diberikan sesuai dengan sampelnya. Antibody primer yang digunakan pada sampel ini ialah antibody poliklonal terhadap protein Shigella 49kDa. Solusi antibody dan membran dapat disimpan setelah itu diberikan antibody sekunder yang berikatan dengan antibody primer. Sehingga dengan bantuan horseradish peroxidase akan terjadi luminasi sesuai dengan jumlah protein.
Gambar 2. Langkah dalam Western blot
APLIKASI IMMUNOKROMATOGRAFI (ICA) Pemeriksaan HbsAg Immunochromatography test (ICT) test (ICT) HBsAg merupakan uji imunokromatografi yang dapat mendeteksi antigen yang terdapat pada serum atau plasma. Prinsip dasarnya adalah adanya pengikatan antara antigen (HBsAG) dengan antibody (anti-HBs) pada daerahtest daerah test line, line, selanjutnya antibody akan berikatan dengan colloidal gold -labeled conjugate. Komplek yang terbentuk akan bergerak pada membran nitroselulosa. Pemeriksaan Plano / HCG HCG sebagai antigen, akan berikatan dengan anti HCG. Gaya kapilaritas membawa senyawa ikatan HCG dan anti HCG-1 menuju daerah T. Di daerah T, anti HCG-2 akan berikatan dengan HCG yang telah berikatan dengan anti HCG-1 namun pada epitop yang berbeda. Terbentuklah kompleks anti HCG-1, HCG, dan anti HCG-2. Enzim menjadi aktif dan daerah T berwarna merah. Selanjutnya, sisa anti HCG-1 yang belum berikatan dengan HCG akan menuju daerah C dan berikatan dengan anti-anti HCG-1. Kompleks ini akan mengaktifkan enzin sehingga daerah T berwarna merah
Pemeriksaan Narkoba Pada strip mengandung konjungat drugs IgG anti narkoba, dimana subtrat urin yang mengandung drugs (AMP/THC/MOR) akan bereaksi dengan konjungat dimana hasil (+) ditandai dengan terbentuknya garis merah pada test, (-) pada control.
Pemeriksaan Dengue Pada bagian kertas terdapat reagen pelacak berupa antibody yang telah dilabel oleh zat warna (colloidal gold) yang akan berikatan dengan analit, selanjutnya ikatan ini akan ditangkap oleh reagen (antigen/ antibody spesifik) pada garis yang dalam keadaan terikat sehingga akan menghasilkan reaksi reagen pelacak-label zat warna-analit-reagen pelacak. Zat warna yang terperangkap pada garis tes (T) akan menghasilkan warna, menandakan bahwa hasil pemeriksaan
positif. Kelebihan reagen pelacak akan bereaksi dengan antigen/antibody atau anti-antibodi pada garis control, sehingga selalu menghasilkan warna pada garis control. Pemeriksaan TB xp Pemeriksaan Mycotec TB (Recombinant) metode imunokromatografi assay adalah menggunakan konjugat dengan gold dengan gold colloidal particle yang akan bergerak menuju area tes yang telah dilapisi dengan beberapa antigen TB recombinan yakni 38 kD, 16 kD dan 6 kD Early Secrefed Antigen Target (ESAT-6) begitu sampel pasien diteteskan ke dalam sumur sampel. Jika sampel pasien yang diperiksa mengandung antibodi terhadap TB, maka akan terbentuk garis berwarna merah muda atau ungu pada area tes (T). Sisa dari kompleks yang tidak berikatan dengan antibodi TB tersebut akan terus bergerak ke arah area kontrol (C) sehingga terbentuk garis berwarna merah muda atau ungu di area kontrol. Hal tersebut menandakan bahwa tes bereaksi dengan baik.
Pemeriksaan HIV Imunokromaografi dimana membran dilapisi oleh antogen HIV rekombinan pada garis tes.Pada saat serum diteteskan pada salah satu ruang membran,sampel akan bereaksi dengan partikel yang telah dilapisi dengan protein A yang terdapat pada bantalan specimen.Selanjutnya campuran akan bergerak secara kromatografi ke ujung membran dan beraksi dengan antigen HIV rekombinan yang terdapat pada garis tes.Jika serum/plasma mengandung antibodi HIV-1/HIV-2 maka akan timbul garis warna pada garis tes Pemeriksaan HCV Antigen HCV bergerak melalui membran immunofiltrasi. Sampel dan reagen bergerak kemembran dan diserap diserap masuk kedalam pada Sampel pasien bergerak bergerak ke membran, antibodi HCV dari serum / plasma, terikat pada antigen pergerakan. Pada tahap pencucian protein serum atau plasma yang tidak terikat dikeluarkan.Pada tahap selanjutnya, konjungat protein – A ditambahkan yang akan mengikat bagian FC dari antibodi FC dari antibodi HCV untuk memberikan warna “dot” pada area tes (T1/T2). Pada area control (“c”) terdapat dot kontrol kualitas yang berfungsi pada permukaan, reagen dan aplikasi prosedur yang benar.
