Izabela Jasicka-Misiak Piotr Młynarz Paweł Kafarski
Identyfikacja grzybów halucynogennych ze wskazaniem najpowszechniej stosowanych metod oznaczania substancji halucynogennych z grzybów we krwi
Opole i Wrocław, 2006
1. WSTĘP Nie wiadomo, kiedy człowiek po raz pierwszy sięgnął po środki odurzające. Zapewne wtedy, gdy uświadomił sobie ograniczenia i kruchość swej egzystencji, poczuł ból i odkrył, e niektóre rośliny potrafią go łagodzić. Archeolodzy odnaleźli ślady makówek i nasiona konopi w grobach z epoki neolitu. W trzecim tysiącleciu p.n.e., na Dalekim Wschodzie ludzie uli ju betel przygotowywany z orzechów palmy arekowej ( Areca catechu ), a w Mezopotamii wytwarzali alkohol. W V wieku p.n.e. Herodot pisał o Scytach odurzających się haszyszem. Ryty naskalne w grobowcu na bretońskiej wysepce Gawinis sprzed 8.000 lat wywołują takie wraenie, e wielu badaczy podejrzewa ich twórców o działanie pod wpływem substancji halucynogennych. Skomplikowane, powtarzające się wielokrotnie wzory geometryczne nie mają bowiem UDGLEY, 2000]. adnego odpowiednika w naturze [ R UDGLEY Naukowcom nie udało znaleźć się adnej cywilizacji pierwotnej, która obywałaby się bez środków odurzających. Ludzie wszędzie znajdowali substancje zmieniające świadomość, niezalenie od tego, gdzie przyszło im yć, w amazońskiej dungli, syberyjskiej tajdze, na stepie czy pustyni. Botanicy opisali ponad 200 roślin o właściwościach halucynogennych, do dziś odkryto w nich kilka tysięcy związków chemicznych. Największą grupę stanowią alkaloidy, czyli zasady zawierające atom azotu. Łączy je zdolność wpływania na funkcjonowanie układu nerwowego człowieka. Efekty mogą być róne - od uspokajania i znieczulenia, przez pobudzanie, po wywoływanie halucynacji. Alkaloidy w czystej postaci są toksyczne, przyjęte w duych dawkach powodują zatrucia, take śmiertelne. Dlatego od czasów prehistorycznych zaywanie zawierających je preparatów starano się kontrolować. Po środki odurzające dawniej nie sięgano dla przyjemności, lecz w ściśle określonych celach i czasie - dla nawiązania kontaktu z bogami i duchami, wprowadzenia się w trans podczas rytualnych obrzędów, wzmocnienia sił i odwagi przed wyruszeniem na łowy lub wojnę. Młodzie uzyskiwała prawo korzystania z uywek dopiero po inicjacji Dawniej o tym, co dozwolone, decydowała religia i tradycja, dziś - przepisy prawa. Środki dopuszczone do obrotu określa się zazwyczaj jako uywki, zakazane - jako narkotyki. Podstawą podziału jest ich szkodliwość, moc i właściwości uzaleniające. W wypadku roślin nieprzetworzonych nie jest to kryterium precyzyjne, o czym świadczy odmienne traktowanie tytoniu i marihuany. Wątpliwości nie wzbudzają wyizolowane i zsyntetyzowane środki psychotropowe. Przepisy regulujące dostęp do uywek i narkotyków wydają się stałe, ale w rzeczywistości ulegają zmianom. W XIX wieku w europejskich miastach działały palarnie opium i kluby miłośników haszyszu. W XX wieku do dobrego tonu naleało palenie tytoniu, dziś napiętnowane. Freud uwaał kokainę za cudowny lek, a zawierające ją napoje reklamowano tak, jak dziś kawę czy herbatę. W Holandii mona palić papierosy z marihuaną,
co w sąsiedniej Francji grozi ju konsekwencjami prawnymi. Dla Indian z Andów zakaz ucia liści koki jest równie absurdalny, jak dla Europejczyków alkoholowa prohibicja. Muzułmanie zdelegalizowali obie te uywki, ale nie mają nic przeciwko raczeniu się wywołującym UDGLEY, 2000]. podobne efekty ghatem [ R UDGLEY Od kilku lat obserwuje się stały wzrost liczby ujawnianych przestępstw ściganych na podstawie ustawy o przeciwdziałaniu narkomanii, w tym przemytu i nielegalnego wytwarzania narkotyków. Nagłaśniane przez media przykłady skutecznych działań odpowiedzialnych słub i stosunkowo wysokie kary nakładane na producentów środków odurzania czy kurierów narkotykowych, nie powstrzymują kolejnych sprawców. Na terenie spokojnych dotąd województw (w tym województw dolnośląskie i opolskie) dynamicznie wzrasta przestępczość narkotykowa, a proceder ten, z uwagi na ogromne zyski, podejmuje niemal kada grupa przestępcza, dąąc następnie do stworzenia własnych źródeł zaopatrzenia (kanału przemytu lub produkcji). Z danych statystycznych wynika, e na terenie całego kraju w dalszym ciągu utrzymuje się wzrost poday narkotyków i popytu na te środki, szczególnie wśród młodych ludzi. Narkotyki dostępne są ju praktycznie nie tylko w du duych ych miastach, ale take w mniejszych miejscowościach, a co najgorsze równie na terenie szkół. W ciągu jedenastu lat prawie pięciokrotnie powiększyła się grupa uczniów, którzy próbowali nielegalnych substancji odurzających. Po okresie stabilizacji, odnotowanej w latach 19941996, dwa kolejne badania ujawniły skokowy wzrost liczby uczniów eksperymentujących z narkotykami. Pochodne Pochodne konopi indyjskich indyjskich i ruteckich (marihuana i haszysz) to zdecydowanie zdecydowanie najbardziej powszechnie powszechnie stosowany stosowany nielegalny nielegalny narkotyk (w Polsce uywa uywa go stale 6,3% młodziey w ogóle, a w Czechach a 22,1%). Następnym narkotykiem najczęściej konsumowanym jest amfetamina i jej pochodne, w tym głównie Ecstasy (MDA, MDMA, MDEA, PMA, PMMA). Zaznacza się spadek zainteresowania LSD, który rekompensowany jest popytem na grzyby halucynogenne (np. łysiczka lancetowata) oraz inne halucynogeny pochodzenia roślinnego. Choć rozpowszechnienie stosowania „magicznych grzybków” jest stosunkowo niewielkie, są one najczęściej stosowanym środkiem halucynogennym w 12 Państwach Członkowskich UE (w Polsce ok. 20% oburzeń - według badań sieci „ Znaczenie i uytkowanie grzybów trujących w tym halucynogennych na terenie Polski i krajów ościennych ”).
Z ponad 5.000 odmian grzybów znanych przez człowieka około 80 posiada właściwości psychoaktywne. Dolny Śląsk, a szczególnie rejon Karkonoszy, to jeden z głównych regionów gdzie grzyby te są zbierane. Mona dokonać te ich zakupu (wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi hodowli) przez internet. Zjawisko narkotyzowania się grzybami halucynogennymi ma w Polsce coraz szerszy zasięg. Istnieje zatem potrzeba zdefiniowania tego typu grzybów ze wskazaniem najczęściej uywanych, opracowanie przewodnika dla potrzeb policji, identyfikacja głównych składników odpowiedzialnych za efekty narkotyczne, opracowanie metod standardowego oznaczania poziomu tych substancji
w materiale biologicznym, w osoczu i moczu (w tym i metod immunologicznych - tzw. testów paskowych). Pod względem prawnym aktualnie obowiązująca ustawa z dnia 29 lipca 2005 r. „ O przeciwdziałaniu narkomanii”
nie precyzuje dokładnie, które gatunki grzybów zaliczone są
do kategorii grzybów halucynogennych. Mówi ona jedynie, i „ grzyby halucynogenne, są to grzyby zawierające substancje psychotropowe”.
Taki stan prawny pozostawia wiele miejsca
do subiektywnej interpretacji zapisów tej ustawy. Przykładem takiej interpretacji moe być przypadek muchomora czerwonego, który posiada dobrze poznane właściwości halucynogenne. Substancje czynne tego grzyba – kwas ibotenowy i muscymol, nie zostały umieszczone w wykazie środków psychotropowych we wspomnianej ustawie. Brak jest jednoznacznych informacji, które precyzują sposoby określania zawartości substancji halucynogennych w grzybach oraz informacji, które gatunki naley bezsprzecznie zaliczyć do kategorii halucynogennych. halucynogennych.
2. GRZYBY HALUCYNOGENNE Grzyby halucynogenne („ magiczne grzyby ”, „ grzybki-halucynki ”), to grupa grzybów, które zawierają substancje psychoaktywne powodujące doznania narkotyczne. Grzyby te naleą do grupy trzeciego typu t ypu toksyczności toksyczności określanego neurologicznym oraz ze względu na działanie na człowieka sklasyfikowane są do szóstej grupy toksyczności (halucynogenne). Zazwyczaj spoywane są one w celach narkotycznych bądź w wyniku pomyłki grzybiarza. Obecnie znanych jest ok. 80 gatunków grzybów posiadających właściwości halucynogenne. halucynogenne. Grzyby halucynogenne naleą głównie do rodzaju Psilocybe , natomiast sporadycznie do NUGENT I SAVILLE, 2004]. Na świecie występuje rodzajów Gymnopilus i Panaeolus [ N w ystępuje około 140
gatunków łysiczek, z których około 80 zalicza się do halucynogennych. Grzyby te rosną niemale na wszystkich kontynentach, najwięcej jednak gatunków halucynogennych zidentyfikowanych zostało w Meksyku [ GUZMAN, 1983]. W Europie rośnie kilkanaście gatunków Psilocybe, jednake działanie halucynogenne wykazuje tylko kilka gatunków tych grzybów. Najczęściej wymienia się: Psilocybe semilanceata (Fr.) Quel., Psilocybe bohemica, , Psilocybe cyanescens Wakef. Psilocybe montana
Łysiczki rosną na ziemi, nawozie,
odchodach roślinoerców, roślinoerców, resztkach obumarłych roślin. Spotyka się je w trawie, tr awie, najczęściej w AFARSKI, 2006]. otwartym terenie, rzadziej rosną w lesie [ JANOSZKA, 2005; K AFARSKI
Łysiczka lancetowata (
Psilocybe
) semilanceata
– gatunek grzyba naleący do
pierścieniakowatych. pierścieniakowatych. Ze względu na wygląd i właściwości halucynogenne nazywany równie czapeczką wolności (Liberty Cap). Dość rzadko występujący w Polsce. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka lancetowata
Kapelusz higrofaniczny, 0,5-1,5 cm średnicy, zmienny w kształcie, stokowaty lub dzwonkowaty, dzwonkowaty, ze szpiczastym guzkiem w środku, ale równie bez guzka tylko z nieznacznym uwypukleniem, gładki. W czasie wilgotnej pogody nieco lepki i brązowy, suchy jest brudnoochrowy, ółtawy lub ółtawo-brązowy, czasami z odcieniem oliwkowozielonym. U starszych owocników brzeg trochę pomarszczony. Blaszki dość rzadkie, szerokie, przerośnięte, początkowo ochrowe, szybko stają się purpurowo-brązowe do prawie czarnych. Trzon wysmukły, elastyczny, cylindryczny, do 10 cm długi i do 2 mm gruby (przewanie 1 mm), zabarwiony kremowo, bladoółtawo lub ółtobrązowo, w podstawie moe mieć odcień niebieskawy, a czasami jest u dołu biało oprószony. Miąsz cienki, białawy, bez wyraźnego smaku. Zapach nieznaczny, grzybowy, nieco stęchły. Wysyp zarodników ciemnobrązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, grubościenne, gładkie, z wyraźną porą rostkową; 13-15 x 6.5-7.5 m, nieco spłaszczone. Występuje głównie na terenach o duej ilości opadów, w górach. Owocniki wyrastają od lata do jesieni, pojedynczo lub w grupach po kilka, w trawie i mchach, w miejscach podmokłych, na ściekach. Większość źródeł podaje, e występuje w miejscach bogatych w składniki odywcze. Zawiera psylocybinę [HTTP://WWW.GRZYBY.PL].
Łysiczka czeska (
) Psilocybe bohemica
– podobnie jak łysiczka lancetowata
grzyb ten naley do pierścieniakowatych. pierścieniakowatych. Bardzo rzadko występujący w Polsce. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka czeska Kapelusz higrofaniczny, wilgotny płowo do rdzawobrązowego, suchy jasnoochrowy, z wiekiem i w miejscach uszkodzonych przebarwia się ciemno sino-zielonkawo; 20-50 mm średnicy, początkowo tępostokowaty, potem wypukły do rozpostartego; brzeg podgięty, z wiekiem prosty lub odgięty, wilgotny słabo prąkowany; powierzchnia gładka, nie lepka; skórka nieściągalna. Blaszki początkowo jasnobrązowe, z czasem przyjmują barwę kremową. Wysyp zarodników brązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, nieco spłaszczone, grubościenne, z wyraźną porą rostkową; 10-12.5 × 6-7.5 m. Trzon wysmukły, elastyczny, cylindryczny, cylindryczny, do 12 cm długi i do 4 mm gruby. Zapach nieznaczny, nieznaczny, grzybowy. Owocniki wyrastają pojedynczo lub w grupach. Na silnie rozłoonym drewnie drzew liściastych i iglastych, gałązkach, kompoście, resztkach roślinnych, w ogrodach, parkach, na poboczach dróg, w miejscach yznych yznych,, ruderalnych [HTTP://WWW.GRZYBY.PL].
Łysiczka górska (
Psilocybe montana)
– jak większość łasiczek występuje dość rzadko. Owocniki wyrastają przez cały rok, poza zimą, w grupach, rzadziej pojedynczo, na ubogich terenach porośniętych mchem i trawą z mchami. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka czarnobrązowa
Kapelusz higrofaniczny, wilgotny ciemnobrązowy do ciemnoczerwonobrązowego, suchy jasny beowoochrowy do beowego; 5-15(20) mm średnicy; półkulisty z wiekiem wypukły, bez garbka lub nieznacznym garbkiem. Brzeg kapelusza ostry, gdy wilgotny to prąkowany, mogą być widoczne białe włókienka osłonki. Blaszki początkowo szare, szybko brązowe z purpurowym odcieniem. Trzon barwy kapelusza, u szczytu nieco jaśniejszy; 15-25(50) x 0.51(2) mm, równogruby, powierzchnia oprószona na szczycie, poza tym włókienkowata. Cechy wyróniające, to nie lepki kapelusz, dojrzałe blaszki posiadają purpurowy odcień [HTTP ://WWW.GRZYBY.PL].
Muchomor czerwony ( Amanita
muscaria),
to rozpowszechniony w Polsce grzyb
kapeluszowy z rodziny drobnołuszczakowatych. Jest to grzyb o słabych właściwościach trujących. Ze względu na swój charakterystyczny wygląd, do zatruć nim dochodzi dość rzadko. Najczęściej, są to zatrucia w przypadku nieodpowiedniego spreparowania grzyba w celach odurzających. Wedle statystyk śmiertelność przy zatruciu tym grzybem waha się w granicach 2-5%. Najbardziej trujące są świee osobniki ze względu na zwiększoną zawartość w swoim składzie kwasu ibotenowego. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce pieczarkowce Rodzina: drobnołuszczakowate drobnołuszczakowate Rodzaj: muchomor Gatunek: Muchomor czerwony Kapelusz grzyba jest ywo czerwony do ółtopomarańczowego, jego średnica wynosi od 50 do 150 (200) mm; początkowo półkulisty, potem wypukły, w końcu rozpostarty. Powierzchnia kapelusza pokryta jest dość regularnie rozmieszczonymi, białymi, luźno przylegającymi łatkami będącymi resztkami osłony, łatki te mogą być spłukiwane przez deszcze. Skórka błyszcząca, ściągalna, w czasie wilgotnej pogody lepka. Brzeg kapelusza długo gładki, u starych okazów prąkowany. Blaszki białe do kremowych; dość gęste, brzuchate, wolne. Trzon biały lub ółtawy; 60-150 (200) x 15-30 mm; cylindryczny; podstawa bulwiasta, kulista od jajowatej, z pochwą zredukowaną do kilku pierścieni kłaczkowato-wałeczkowatych brodawek, powyej pokryta nielicznymi kosmkami. Pierścień
wyraźny, biały lub białoółtawy, zwieszony, nieprąkowany; brzeg pierścienia biały lub ółtawo ząbkowany. Miąsz biały, pod skórką kapelusza ółty (ółtopomarańczowy); niezmienny, kruchy. Smak grzyba jest łagodny oraz bez zapachu [HTTP://WWW.GRZYBY.PL]. W celach halucynogennych często wykorzystywany jest take dość pospolity w Polsce
muchomor plamisty ( Amanita pantherina Amanita pantherina). Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce pieczarkowce Rodzina: drobnołuszczakowate drobnołuszczakowate Rodzaj: muchomor Gatunek: Muchomor plamisty Oprócz wymienionych wyej gatunków występujących w Polsce zawierających substancje psychoaktywne, istnieje take wiele gatunków grzybów podejrzewanych o zawartość w swym składzie substancji halucynogennych. Grzyby te są mniej poznane pod względem zawartości substancji toksycznych i halucynogennych, a niektóre z nich rzadziej występują w naszej strefie klimatycznej. Gatunki podejrzewane o zawartość substancji halucynogennych halucynogennych to między innymi: -
Pierścieniaki: pierścieniak wieńczony ( Stropharia coronilla ),
-
Czernidłaki: czernidłak narkotyczny (Corpinus narcoticus ), czernidłak pospolity (Corpinus atramentarius ),
-
Kołpaczki: kołpaczek motylkowaty ( Panaeolus sphinctrinus), kołpaczek motylkowaty ( Panaeolus papilonaceus)
- Niektóre gatunki z rodzaju Inocybe (strzępiaki), Conocybe (stokogłówka), Pluteus (drobnołuszczak), Gymnopilus (łysak). Do chwili obecnej przeprowadzono badania składu chemicznego niewielu spośród wyej wymienionych gatunków grzybów. Z dotychczas przeprowadzonych analiz wynika, e w grzybie Inocybe aeruginascens obecna jest psylocybina w ilości 0,3% suchej masy oraz baeocestyna w ilości 0,2% suchej masy. Dodatkowo odnotowano kilkanaście zatruć spowodowanych tym grzybem. Kolejnym gatunkiem zbadanym pod kątem obecności
substancji halucynogennych był grzyb z rodziny łysaków - Gymnopilus purpuratus . Zarówno psylocyna jak i baeocystyna znajdowały się w tym gatunku w ilości ok. 0,3% [ GARTZ, 1992]. Jak wynika z literatury, zawartość procentowa substancji halucynogennych w grzybach jest zmienna i zaley od gatunku, stadium rozwojowego, warunków klimatycznych oraz dostępności rozpuszczalnego rozpuszczalnego azotu i fosforu w glebie (Tabela 1). Tabela 1.
Przykładowe gatunki grzybów halucynogennych oraz zawartość psylocyny,
psylocybiny oraz baeocystyny w przeliczeniu na suchą masę grzyba.
%
%
%
Gatunek
Psylocybiny Psylocyny Baeocystyny Źródło
P. azurenscens
1,78
0,38
0,35
[ STAMETS I GARTZ, 1995]
P. bohemica
1,34
0,11
0,02
[ GARTZ I MUELLER , 1990]; [GARTZ, 1994]
P. semilanceata
0,98
0,02
0,36
[ GARTZ, 1994]
P. baeocystis
0,85
0,59
0,1
[ R EPKE EPKE, 1977; BEUG I BIGWOOD, 1982]
P. cyanescens
0,85
0,36
0,03
[ STIJVE I K UYPER UYPER , 1985; R EPKE EPKE
I
IN., 1977]
P. tampanensis
0,68
0,32
---
[GARTZ, 1994]
P. cubensis
0,63
0,60
0,25
[ GARTZ, 1994]
P. weilii
0,61
0,27
0,05
---
P. hoogshagenii hoogshagenii
0,60
0,10
---
[HEIM I HOFMANN,1958; HTTP://WWW.EROWID.ORG]
P. stuntzii
0,36
0,12
0,02
[ BEUG I BIGWOOD, 1982; R EPKE EPKE, 1977]
P. cyanofibrillosa
0,21
0,04
---
[STAMETS I GARTZ, 1995]
P. liniformans
0,16
---
0,005
[STIJVE I K UYPER UYPER , 1985]
Wydawać by się mogło, i z racji sezonowego występowania grzybów, dostęp do świeego materiału ogranicza się wyłącznie do późnego lata i jesieni. Istnieje jednak moliwość prowadzenia hodowli grzybów posiadających właściwości halucynogenne w warunkach domowych. Nielegalne sklepy internetowe oferują sprzeda zarodników takich grzybów, zarówno gatunków występujących w naszej strefie klimatycznej, jak i gatunków
spoza naszej strefy (na przykład Psilocybe cubensis ). Zarodniki, a take fragmenty owocników stanowią materiał wyjściowy do prowadzenia hodowli w warunkach domowych. Wraz z materiałem do hodowli grzybiarze ądni mocnych wraeń otrzymują dokładne wskazówki dotyczące warunków hodowli, których dotrzymanie gwarantuje wyhodowanie owocników w ciągu czterech do ośmiu miesięcy [ JANOSZKA
I IN.,
2005]. Poniej pokazano
zdjęcia z instrukcji dla hodowców takich grzybów – łysiczki kubańskiej, których zarodniki oferuje w internecie firma PF (1202 E. Pike #783, Seattle Wa. 98122, USA), oraz ofertę z witryny „ Buy magic mushrooms”. Warto zaznaczyć, e znalezienie tych ofert zajęło autorom raportu 5 minut.
Psilocybe Colombian #1 This one has a nice history in Colombia. Picked from the cowfields of the little village Villa de Leiva. Found to be very potent, giving a beautiful journey. From the same grower as the Normal Mexican. Fresh Colombian Magic Mushrooms available in 750g packs. Not recommended for use under 18. prescription drug, consult your health recommended dose. Consumption may heavy equipment. Not recommended beverages.
If pregnant, nursing or taking a care professional. Do not exceed impair ability to drive or operate for consumption with alcoholic
Opisano równie metodę, w której wykorzystanie zarodników prowadzi do otrzymania dikariotycznej grzybni. Grzybnię tę mona wykorzystać do dalszego jej namnaania lub do porcjowania i sprzedawania jako gotowego do spoycia materiału [JANOSZKA
I IN.,
2005].
Takie produkty, ze względu na swą bezpostaciową formę, są niemoliwe do identyfikacji za pomocą tradycyjnych metod makro- i mikroskopowych [ ADAMCZYK , 2006]. Dostęp do grzybków halucynogennych jest zatrwaająco łatwy, nie dziwi zatem ich rosnąca wcią popularność. Naley jednak wziąć pod uwagę fakt, i w naszej strefie klimatycznej oprócz osławionej przez zbieraczy łasiczki lancetowatej, na łąkach rośnie kilkadziesiąt podobnych gatunków grzybów, praktycznie nierozrónialnych dla laików.
Gatunki te stanowią powane zagroenie ycia dla amatorów odurzania, którzy przez niewiedzę konsumują silnie trujące grzyby, jak na przykład stoogłówki ( Conocybe ), czy hełmówki (Galerina ).
3. MORFOLOGICZNA IDENTYFIKACJI GRZYBÓW Oznaczanie grzybów do celów konsumpcyjnych jest zadaniem stosunkowo łatwym. Dla oznaczenia gatunku grzyba konieczne jest sprawdzenie cech, które odróniają ten gatunek od innych podobnych. Są to tak zwane cechy diagnostyczne. Jedną z takich cech jest barwa zarodników, dzięki której mona nieuzbrojonym okiem określić gatunek grzyba. Wysyp zarodników otrzymuje się układając dojrzały kapelusz hymenoforem do dołu na kartce białego papieru. Po kilku godzinach naley usunąć kapelusz, na kartce pozostają wówczas zarodniki o kolorze właściwym dla danego gatunku. Barwa wysypu zarodników jest cechą bardzo pomocną przy oznaczaniu grzybów, pozwala ona na szybkie przyporządkowanie znaleziska do rodziny w danej grupie grzybów. Warto podkreślić, e w przypadku grzybów blaszkowych zrobienie wysypu wysypu zarodników jest łatwe i szybkie i jest j est bardzo pomocne. W praktyce grzybiarza, umiejętność robienia wysypu w ysypu zarodników jest take bardzo przydatna. Określenie barwy wysypu zarodników umoliwia na przykład pewne odrónienie pieczarek (czekoladowobrązowy wysyp) od muchomorów (biały wysyp), opieniek (biały wysyp) od "fałszywych opieniek" (brązowy wysyp), itd. Wysyp zarodników bywa take potocznie nazywany "odciskiem kapelusza". W przypadku grzybów Psilocybe wysyp zarodników jest purpurowo-brązowy. purpurowo-brązowy. Często mona zauwayć, i kapelusze sąsiadujących ze sobą łysiczek są oprószone smugami ciemnego pyłu. Inną cechą, która ułatwia identyfikację gatunków grzybów Psilocybe jest niebieskie zabarwienie trzonka u nasady kapelusza. Po ścięciu lub uszkodzeniu trzonka barwa ta zmienia się na czerwoną w ciągu 30-60 min. Zjawisko to, nie jest cechą charakterystyczną gatunków grzybów zawierających psylocybinę, ale moe świadczyć o tym, i grzyb nie naley do gatunku trującego [ SCHWARZ I SMITH, 1988] Wysypu zarodników mona dokonać dysponując świeymi owocnikami, jednake najczęściej do identyfikacji i analizy otrzymywane są grzyby w postaci zasuszonej. Ze względu na trudności z makroskopowym określeniem gatunku grzyba w celu jego identyfikacji stosuje się często metody mikroskopowe.
Psilocybe semilanceata
(Łysiczka lancetowta)
Amanita muscaria
Psilocybe cubensis
(Łysiczka kubańska)
(Muchomor czerwony)
Aby przywrócić turgor tkanek często stosuje się roztwór 2,5% wodorotlenku potasu. Po potraktowaniu wodorotlenkiem tkanki grzyba powracają w pewnym stopniu do swojego pierwotnego stanu i moliwa staje się identyfikacja gatunku przy pomocy mikroskopu tradycyjnego bądź elektronowego. W przypadku analizy z uyciem mikroskopu tradycyjnego bierze się pod uwagę kształt oraz cechy charakterystyczne zarodników, cystyd oraz basyd umiejscowionych na grzybni. Dodatkowo, analiza za pomocą mikroskopu elektronowego moe ułatwić identyfikację grubszych i bezbarwnych tkanek. W przypadku zastosowania skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) otrzymuje się take zdjęcia trójwymiarowe [ TSUJIKAWA, I IN., 2003].
4. EFEKTY SPOYWANIA GRZYBÓW „Magiczne grzybki”, jak wynika z wielu doniesień [ MUSSHOFF I IN. 2000; PASSIE I IN ., 2002], konsumowane są zazwyczaj w postaci surowej, taka forma wywołuje, bowiem,
najsilniejsze doznania ju po 20-40 minut od spoycia. Opisywane są równie przykłady spoywania grzybków zmieszanych w napojach lub potrawach. Zbiory grzybków przechowywane są najczęściej w postaci suszonej bądź mroonej, często są trzymane w miodzie, co w znacznym stopniu pozwala zachować ich wysoką aktywność [ BOGUSZ
I IN.,
1998; MUSSHOFF I IN., 2000].
Doniesienia dotyczące formy oraz ilości spoywanych grzybków są bardzo zrónicowane. Jednake za ilość pozwalającą odczuć działanie przyjmuje się 20-30 sztuk świeych lub 30-40 suszonych grzybków. Badania kliniczne pozwoliły na oszacowanie, i konsumpcja 15-20 mg grzybków wpływała na rónorodne zachowanie psychiczne niektórych pacjentów. Notowano między innymi zaburzenia toku t oku myślenia, zaburzenia emocjonalne oraz zaburzenia spostrzegania rzeczywistości [ VOLLENWEIDER I IN ., 1997]. W literaturze naukowej oraz w doniesieniach internatów spotyka się opisy rónorodnych doznań po spoyciu grzybków. Spośród wielu efektów najczęściej jednak opisywane są: -
halucynacje, zmiany percepcyjne i zmiany sposobu postrzegania świata definiowane jako fałszywe spostrzeenia zmysłowe, patologiczne postrzeganie przedmiotów, które nie znajdują się w polu widzenia jednostki lub w ogóle nie istnieją; halucynacjom towarzyszy silne przekonanie o realności odbieranych bodźców,
-
uczucie błogostanu czyli przyjemne odpręenie, wraenie „odpływania”, przyjemne barwne wizje, ogólne pozytywne spostrzeganie stanu rzeczy, uczucie opuszczenia ELLER I IN., 1999]; ciała, brak koordynacji ruchowej [ K ELLER
-
stany psychotyczne w tym paranoidalne urojenia oraz obsesje, nagłe i gwałtowne zmiany osobowości oraz toku postępowania, moe wystąpić tzw. „bad trip” [JANOSZKA I IN., 2005]
-
nadmierne pobudzenie psychosomatyczne, huśtawka nastrojów,
-
rónorakiego rodzaju zaburzenia ze strony układu pokarmowego w tym wymioty, biegunki oraz bóle brzucha.
Badania dotyczące konsumpcji Psilocybe dowodzą, e nie istnieje moliwość fizycznego uzalenienia od tych grzybów, pomimo zwiększającej się tolerancji przy ich długotrwałym zaywaniu. Ich częste spoywanie stwarza moliwość uzalenienia psychicznego. Element oszołomienia, związany z ich spoywaniem, nie jest obojętny dla młodego organizmu.
Grzyby te powodują pobudzenie psychoruchowe, halucynacje, uczucie niepokoju. Przy niewłaściwym stosowaniu moe dojść nawet do ostrej psychozy. Człowiek w takim stanie traci świadomość i moe być bardzo niebezpieczny dla siebie i innych. Osoby często zaywające
substancje
halucynogenne
wykazują
podwyszony
poziom
agresji
[https://hyperreal.info/].
5. SUBSTANCJE AKTYWNE WYSTĘPUJĄCE W GRZYBACH Głównymi substancjami o właściwościach halucynogennych występującymi w grzybach są psylocybina (4-fosfonyloksy-N,N-dimetylotryptamina) i towarzyszący jej drugi alkaloid psylocyna (4-hydroksy-N,N-dimetylotryptamina). Oprócz tych związków, w grzybach stwierdzono równie obecność baeocystyny (4-fosforyloksy-N-metylotryptaminy) będącej pochodną psylocybiny, a róniąca się od niej jedynie brakiem podstawnika metylowego
przy
azocie
w
łańcuchu
bocznym,
norbaeocestyny
oraz
(4-
fosforyloksytryptaminy) fosforyloksytryptaminy) występujące w ystępującejj zazwyczaj w ilościach śladowych.
O CH3
OH
HO
P
OH O
N CH3
CH3 N CH3
N H
N H
Psylocyna
O HO
P
Psylocybina
OH
O H
O
HO
P
OH H
O
N CH3 N H
Baeocystyna
N H N H
Norbaeocystyna
Psylocybina jest jednym z nielicznych związków naturalnych, które zawierają w swej strukturze atom fosforu. Substancja ta dobrze wchłania się poprzez tkanki jamy ustnej i ulega w
organizmie
defosforylacji.
W
wyniku
tego
procesu
degradacji
powstaje
najprawdopodobniej najprawdopodobniej jej metabolit – psylocyna, która jest j est odpowiedzialna za ogół właściwości halucynogennych grzybów. Przyjęcie inhibitorów monoaminooksygenazy przed zayciem psylocybiny groźnie wzmacnia jej działanie. Farmakologicznie działanie psylocybiny jest charakterystyczne dla substancji halucynogennych i przypomina efekty wywoływane przez LSD, jednake około 100 razy słabsze. Przyjęta doustnie, działa około 5-6 godzin. Pierwsze efekty jej działania zauwaalne są po około 15-40 minutach od jej zaycia. Psylocybina pojawia się we krwi w oznaczalnych stęeniach w 20 - 40 minut po podaniu doustnym 0,2 AFARSKI, 2006]. mg/kg masy ciała [K AFARSKI
Z przeprowadzonych badań wynika, e ilość psylocybiny niezbędna do wywołania silnych halucynacji to około 10-18 mg [ HASLER I IN., 2002]. Jest to jednak ilość szacunkowa, gdy na efekty działania psylocybiny składa się wiele czynników, jak na przykład indywidualne cechy związane z metabolizmem osoby zaywającej oraz pokarm przyjęty przed spoyciem grzybów. Zarówno psylocybina, jak i psylocyna zostały sklasyfikowane jako substancje o duym potencjale naduywania. Substancje te znajdują się w wykazie środków odurzających w grupie I-P stanowiącym załącznik do ustawy „O przeciwdziałaniu narkomanii”. O
OH NH2
HO
N
NH2
O
Kwas ibotenowy
HO
N
O
Muscymol
Oprócz wyej wymienionych psylocyny i psylocybiny w wielu grzybach o właściwościach halucynogennych występują take kwas ibotenowy oraz muscymol (5(aminometylo)-3-izoksazolol), (aminometylo)-3-izoksazolol), pochodne izoksazoli [HALLEN I IN., 2002]. Związki te występują w znacznych ilościach w muchomorach ( Amanita muscaria, Amanita phalloides, Amanita pantherina),
i to właśnie one odpowiedzialne są za ich właściwości odurzające. W 100 g
suchej masy grzyba Amanita muscaria zawartych jest 180 mg wymienionych substancji, z których jedynie 25 mg, to kwas ibotenowy. W organizmie kwas ten metabolizowany jest właśnie do muscymolu, który wykazuje mniejszą toksyczność i wydalany jest z moczem w
postaci niezmienionej. Dawka niezbędna do wywołania doznań narkotycznych to 30-60 mg dla kwasu ibotenowego oraz 10-15 mg dla muscymolu [ HALPERN, 2004]. Aktualny pogląd głosi, e kwas ibotenowy nie przekracza bariery krew-mózg w formie zmienionej i jest częściowo metabolizowany metabolizowany do muscymolu muscymolu i muskazonu, a częściowo wydalany wydalany w niezmienionej formie. Z badań prowadzonych nad zwierzętami przy uyciu kwasu ibotenowego wynika, e jest potęną neurotoksyną (po wstrzyknięciu domózgowym). Jest strukturalnie podobny do glutaminy i aktywuje receptory NMDA, ale to prawdopodobnie nie włącza się to w ogół działania psychoaktywnego Amanita muscaria. Ma on działanie 5-8 razy słabsze ni muscymol (efektywna dawka to 50-100 mg). Muscymol odpowiada za większą część działania psychoaktywnego muchomorów. Główne działanie tego związku polega na blokowaniu receptora GABA-A. Związek ten uywany jest w badaniach nad GABA jako jego najskuteczniejszy broker [ LI I OBERLIES, 2005]. Dowiedziono, e muscymol działa na kilka obszarów mózgu - korę mózgową, hipokamp i módek. Związek ten wpływa take na poziom neuroprzekaźników: zwiększa ilość serotoniny i acetylocholiny w mózgu, a obnia ilość noradrenaliny. Działanie muscymolu znacznie róni się od działania pochodnych fenyloetyloaminy i indolu, co jest widoczne na wykresach badań EEG. Nie są to jednak naukowo potwierdzone badania, gdy muscymol nie jest metabolizowany przez organizm ludzki. Oznacza to, z czysto czysto teoretycznego punktu punktu widzenia, e nie ma on prawa oddziaływać w jakikolwiek sposób na ciało i umysł. Muscymol wydalany jest z organizmu w niezmienionej formie. Dawkowanie doustne substancji waha się w granicach 10-15 mg. W ustawie o przeciwdziałaniu narkomanii kwas ibotenowy oraz muscymol nie znajdują się w wykazie środków psychotropowych. psychotropowych. Kolejnym związkiem, który występuje w muchomorach w niewielkich ilościach jest
muskazon . Wykazuje on psychoaktywość i bardzo moliwe, e odpowiada za część ogólnego działania muchomorów czerwonych. W niewielkich ilościach (0,002% - 0,003% suchej masy grzyba), w Amanita muscaria występuję muskaryna. Alkaloid ten, charakterystyczny dla innych gatunków grzybów (min.: strzępiaka ceglastego Inocybe patouillardii patouillardii ) oddziaływuje na poziom acetylocholiny w mózgu i działa na receptory muskarynowe. Zawartość muskaryny w muchomorach jest dosyć niska, jednak moe być ona odpowiedzialna za cholinergiczne działanie muchomorów. Choć dowiedziono naukowo aktywność muskaryny, to jej wchłanianie przez ścianę ścianę jelita jest bardzo powolne i prawie nie przedostaje przedostaje się ona przez barierę krew-mózg (moliwe jest to w zasadzie tylko przy równoczesnym podaniu lecytyny). Ponadto efekt działania muskaryny znacznie róni się od działania Amanita
muscaria . Zatem muskaryna nie ma większego wpływu na charakter odurzenia muchomorem
czerwonym.
6. BADANIA FARMAKOKINETYCZNE FARMAKOKINETYCZNE Rosnąca liczba publikacji naukowych wskazuje na coraz to większe zainteresowanie zarówno środowisk medycznych jak i chemicznych tematem oddziaływania psylocybiny na organizm ludzki. Badania przeprowadzane na wolontariuszach oraz zwierzętach laboratoryjnych, przy uyciu 14C-znakowanej psylocybiny wykazały, i metabolitami tej substancji są 4-hydroksy N,N-dimetylotryptamina, aldehyd 4-hydroksy-indolo-3-octowy, kwas 4-hydroksy-indolo-3octowy oraz 4-hydroksytryptofanol. Produkty te powstają w procesie deaminacji oraz oksydacji psylocybiny [ HASLER I IN., 1997; HASLER I IN., 2002]. Dodatkowo postulowane jest tworzenie się w szlaku metabolizmu psylocybiny, psylocyno-O-glukuronidu (typowego produktu detoksykacji) na zasadzie analogii tworzenia się 5-hydroksytryptamin-Oglukuronidu w szlaku metabolizmu serotoniny. Jednake, przeprowadzone do tej pory badania nie pozwalają na jednoznaczną identyfikację tego metabolitu [ PASSIE I IN ., 2002]. Psylocyna pojawia się w surowicy po około 30 minutach. W tym czasie, w wątrobie zachodzi główny szlak przemiany metabolicznej tej substancji. Psylocybina ulega gwałtownej defosforylacji, defosforylacji, przy pomocy fosfatazy alkalicznej, do psylocyny, która jest j est główną substancją odpowiedzialną za właściwości halucynogenne grzybków. Ponadto stwierdzono równie, e czas półtrwania psylocybiny oraz długość jej działania jest zmienna i zaley od sposobu jej podania. I tak, doylne podanie psylocyny skraca czas do 74,1 ± 19,1 min. w porównaniu do czasu półtrwania psylocyny podanej doustnie – 163 ± 64 min. Z kolei czas działania tej substancji po doylnej aplikacji skraca się nawet do 15-30 minut [ HASLER I IN., 1997].
O
OH P O
CH3
HO
CH3
OH
N CH3
N CH3
N H
N H Psylocyna
Psylocybina
OH O H N H 4-hydroksyindoloacetaldehyd
OH
OH O
OH N H kwas 4-hydroksyindolo-3-octowy
OH N H 4-hydroksyindoloetanol
Postulowany szlak metabolizmu psylocybiny w organizmie ludzkim [HASLER I IN., 1997, HASLER I IN., 2002].
Budowa zarówno psylocybiny, jak i psylocyny wykazuje podobieństwo strukturalne do neuroprzekaźnika – serotoniny. Psylocyna jest substancją mniej hydrofilową ni jej prekursor, w związku z czym łatwiej przenika barierę krew-mózg. Psylocyna wykazuje właściwości antagonistyczne względem receptorów serotoniny oraz mimetyczne względem samej serotoniny. Dowiedziono, i za działanie halucynogenne, zarówno związków będących analogami strukturalnymi fenyloetyloaminy (amfetamina, meskalina) jak i indoloaminy (psylocyna) odpowiedzialne jest ich powinowactwo do receptorów serotoninowych typu 5HT2, a w szczególności 5-HT 2A i 5HT2C [AGHAJANIAN
I
MAREK , 1999]. Dzięki tym
właściwościom psylocybina zwiększa poziom serotoniny w mózgu oraz powoduje pobudzenie czynności sensoromotorycznych i percepcyjnych. Dlatego te charakterystyczne objawy zaywania grzybków halucynogennych, to niepokój oraz rónego rodzaju halucynacje.
CH3
OH
N CH3
NH2
HO N H
N H
Serotonina
Psylocyna
7.
MOLIWOŚCI
IDENTYFIKACJI
I
OZNACZANIA
SUBSTANCJI
HALUCYNOGENNYCH Z racji potencjalnego zagroenia związanego ze zbieractwem, hodowlą, dystrybucją i zaywaniem grzybków halucynogennych i realizacji załoeń Ustawy o zapobieganiu narkomanii, istnieje zwiększone zapotrzebowanie w zakresie określenia poziomu środków psychoaktywnych w płynach ustrojowych. Metody analizy jakościowej i ilościowej, przeznaczone do rutynowych oznaczeń wykorzystywanych przez właściwe instytucje, powinny być wystarczająco szybkie szybkie i wiarygodne. Zatem w tej części opracowania omówione zostaną aktualnie uywane metody izolacji, oraz analizy jakościowej i ilościowej substancji psychoaktywnych psychoaktywnych występujących w grzybach polskich. Izolacja psylocyny i psylocybiny z materiału biologicznego
Proces izolacji psylocybiny i psylocyny z materiału grzybowego jest prosty i dość szybki. Najczęściej izolacji tych alkaloidów dokonuje się na drodze ekstrakcji do rozpuszczalnika. Standardowo stosowane rozpuszczalniki to chloroform, metanol bądź woda YSILKA I WURST 1990, WURST I IN., 1992]. Izolacji substancji halucynogennych, jednym z [K YSILKA
wybranych rozpuszczalników, wykonuje się uywając ultrasonifikatora celem zniszczenia komórek grzyba, a tym samym zwiększenia stopnia ekstrakcji substancji halucynogennych z grzyba. Po oddzieleniu supernatantu od zawiesiny odparowuje się rozpuszczalnik, najlepiej w środowisku niereaktywnego gazu. Tak otrzymany ekstrakt poddaje się dalszym badaniom [MUSSHOFF I IN., 2000]. Inną metodą izolacji halucynogennych alkaloidów jest ekstrakcja materiału grzybowego rozcieńczonym wodnym roztworem kwasu octowego. W kolejnym etapie wyodrębniania otrzymany ekstrakt zakwasza się do pH=4 lodowatym kwasem octowym. Rozwór pozostawia się do odstania na okres jednej godziny, a następnie podgrzewa
do temperatury 70º C. Po tym czasie ekstrakt chłodzi się, filtruje, otrzymany filtrat doprowadza się do pH=8 przy uyciu stęonego wodorotlenku amonu. W ten sposób otrzymany roztwór poddaje się ekstrakcji eterem dietylowym. Otrzymany ekstrakt eterowy suszy się nad siarczanem sodu, filtruje i odparowuje w środowisku niereaktywnym [ CASALE, 1985].
W obu przypadkach otrzymuje się ekstrakty o wystarczającej czystości do przeprowadzenia przeprowadzenia dalszych badań. Wynikiem ekstrakcji metanolem jest mieszanina psylocyny oraz psylocybiny. Z kolei poprzez ekstrakcję, kolejno wodnym roztworem kwasu octowego i eterem dietylowym otrzymuje się ekstrakt zawierający niemal wyłącznie psylocynę. W zastosowanych warunkach, obecna w roztworze psylocybina ulega defosforylacji [ CASALE, 1985].
Najprostszą i najczęściej wykorzystywaną techniką rozdziału i identyfikacji pochodnych indolowych zawartych w grzybach jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC) [BEUG I BIGWOOD, 1981; GARTZ, 1987; GROSS, 2002; SEMERDZIEVA I IN., 1986; WURST I IN., 1992]. Rozdziału przy uyciu chromatografii cienkowarstwowej dokonuje się na płytkach pokrytych krzemionką. Najlepsze efekty rozdziału otrzymano przy uyciu eluentów: n-butanol, kwas octowy, woda (12:3:5 v/v/v), 1,5% rozwór amoniaku w metanolu, n-butanol, kwas octowy, woda (2:1:1 v/v/v) oraz amoniak, woda, n-propanol (12:188:500 v/v/v). Stosując pierwszy z opisanych eluentów otrzymano najlepszy rozdział i nie obserwowano rozmycia plamek na płytce [BEUG I BIGWOOD, 1981]. W celu wizualizacji rozdzielonych substancji standardowo uywa się odczynnika Ehrliha słuącego do wykrywania amin. Ponadto psylocyna jak i psylocybina są dobrze widoczne na płytce w niskim paśmie promieniowania UV. Metody immunochemiczne
Najbardziej przydatnymi metodami analizy jakościowej i ilościowej substancji o właściwościach narkotycznych, są te, które nie wymagają dodatkowych technik izolacji z materiału biologicznego (krew, mocz). Tego typu metody oparte są przede wszystkim o badania immunochemiczne. Moliwość wytwarzania przeciwciał dowolnych leków w organizmie ywym spowodowała istotny postęp w badaniach ilości i jakości środków psychoaktywnych. Standardowy proces otrzymywania trwałych połączeń chemicznych badana substancja-białko, opiera się na wykorzystaniu reaktywnych grup, które z tą substancją tworzą czynny związek immunologiczny - wysokocząsteczkowy hapten (immunogenic conjugate ). Stworzenie tego typu haptenu moe stymulować wytworzenie wysoce specyficznych specyficznych przeciwciał monoklonalnych, monoklonalnych, które mogą być wykorzystane w analizie
jakościowej oraz ilościowej wybranych substancji psychoaktywnych. W literaturze istnieje niewiele informacji dotyczących zastosowania tej metody do identyfikacji substancji halucynogennych. Jedyna informacja dotyczy prób syntezy koniugatów białkowych psylocyny [ ALBERS I IN., 2002]. Metody analizy instrumentalnej
Do najbardziej przydatnych i efektywnych metod zarówno ilościowej, jak i jakościowej analizy substancji psychoaktywnych naley obecnie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Zastosowanie tej metody do celów identyfikacyjnych wzrosło szczególnie po wprowadzeniu techniki detekcji typu diode-array . Ten typ detekcji pozwala uzyskać obok sygnału piku danego związku na chromatografie jego widmo UV (200-350 nm) w układzie trójwymiarowym, potwierdzające jego jednorodność. Ta właściwość detektora diode-array znacznie podnosi moliwości identyfikacji związków [BOGUSZ I WU, 1991; FERARA I IN., 1992; LOGAN I IN., 1990]. YSILKA I IN ., Wykorzystanie HPLC z moliwością uycia innych detektorów: UV [ K YSILKA
1985; TSUJIKAWA I IN., 2003], fluorescencyjnym [ SAITO I IN. 2004; SAITO I IN., 2005],
chemiluminescencyjnym [ A NASTOS
I IN.,
2005; A NASTOS I IN., 2006], elektrochemicznym
[CHRISTIANSEN
I
[BOGUSZ
1998; SAITO I IN. 2004], pozwala na uzyskanie wysokiego stopnia odzysku
I IN.,
ASMUSSEN, 1983], woltametrycznym [K YSILKA YSILKA I IN., 1985] i masowym R ASMUSSEN
substancji halucynogennych, wysoką selektywność pomiaru oraz niewielki nakład czasu niezbędny do wykonania pomiarów. Metoda ta została z powodzeniem uyta do badania obecności i stęenia psylocyny w próbkach krwi [ LINDENBLATT
I IN.,
1998], poziomu
psylocyny i psylocybiny w suszu grzybowym [THOMPSON, 1980], oraz poziomu kwasu ibotenowego w sporach i kapeluszach muchomora czerwonego czerwonego [ STROEMER I IN., 2004]. Kolejną metodą identyfikacji oraz analizy ilościowej związków o aktywności halucynogennej jest metoda chromatografii gazowej i spektrofotometrii masowej (GC-MS) z równoczesną moliwością moliwością korzystania z biblioteki widm masowych np. systemu HP 5997 OC MS/MD Chemistation. Wśród moliwych technik analitycznych w tym układzie, zastosowanie znalazła techniki SIR ( selected ion recording ) oraz SIM ( selected ion monitoring ) stosowane dla niszych stęeń związków
ÄFERSTEIN, halucynogennych halucynogennych [ STICHT I K ÄFERSTEIN
2000]. Techniki te pozwalają na monitorowanie zmian intensywności wybranych
specyficznych fragmentów cząsteczki tworzących widmo masowe. Dane uzyskane dla materiału badawczego, mogą znaleźć potwierdzenie w komputerowym układzie porównawczym z odpowiednim wzorcem wybranym z banku widm. Metoda GC-MS
znajduje równie zastosowanie w analizie ilościowej. Rutynowo, z uwagi na oznaczalność, stosuje się technikę SIM z równoczesnym uyciem wzorca wewnętrznego, którym jest pochodna deuterowana oznaczanego oznaczanego związku. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do identyfikacji psylocyny, zarówno w materiale grzybowym, jak równie w próbkach krwi i ELLER I IN., 1999; STICHT I K ÄFERSTEIN ÄFERSTEIN, 2000, SARWAR I MCDONALD, 2003; K IKURA IKURAmoczu [K ELLER
HANAJIRI, 2005].
W rutynowych badaniach toksykologicznych zastosowanie znajdują równie programy systematycznej analizy ksenobiotyków, wśród których wymienić mona system Remedi HS (Bio-Rad). Program Remedi HS oparty jest na zasadach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i detekcji UV. System ten, który umoliwia szybką analizę około 500 leków i ich metabolitów w układzie wielopunktowego pomiaru UV (multiwavelenght ultrafiolet detection ), znalazł równie zastosowanie analizie substancji psychotropowych zawartych w grzybach halucynogennych. Metodą tą zidentyfikowano ÄFERSTEIN, 2000]. psylocynę w moczu [ STICHT I K ÄFERSTEIN
Najnowszym rozwiązaniem analitycznym jest zastosowanie chromatografii cieczowej sprzęonej ze spektrometrią masową (LC-MS). Osiągane progi detekcji dla oznaczeń wielu związków w tym układzie są nisze anieli anieli uzyskane uzyskane w systemie systemie GC-MS i najczęściej najczęściej występują w zakresie od 10 ng/ml. Z zastosowaniem techniki chromatografii cieczowej sprzęonej ze spektrometrią mas z jonizacją przez rozpylanie w polu elektrycznym (LC/MSESI), opracowano szybką identyfikację wielu substancji o właściwościach narkotycznych, takich jak amfetamina, LSD oraz psylocybina. Czas analizy kadego ze związków jest był dłuszy ni 5 minut, a zastosowanie łagodnej metody jonizacji ESI miało due znaczenia dla analizy, substancji termolabilnych [ PIHLAINEN
I IN.,
2003]. Z kolei stosując technikę
chromatografii cieczowej sprzęonej ze spektrometrią mas z chemiczną jonizacją pod ciśnieniem atmosferycznym (LC/MS-APCI) wykryto i oznaczono psylocynę w zredukowanych zredukowanych do niewielkich objętości próbkach krwi [ LECHOWICZ, 2004]. Metodą słuącą najczęściej do rozdziału związków o niewielkich masach cząsteczkowych jest strefowa elektroforeza kapilarna (CZE). Znalazła ona równie zastosowanie w identyfikacji i określeniu zawartości substancji o właściwościach halucynogennych w grzybach. Pomiary psylocybiny zostały przeprowadzone w systemie P/ACE 5000 i pozwoliły na dokładne określenie zawartości psylocybiny oraz baeocestyny w próbkach grzybów. [ PEDERSEN-BJERGAARD I IN., 1997].
Inne metody
W ostatnich kilkudziesięciu latach nastąpił znaczny rozwój technik analitycznych opartych o zastosowanie metod biologii molekularnej. Metody te są coraz powszechniej wykorzystywane w wielu dziedzinach nauki, w tym równie do identyfikacji grzybów halucynogennych. Umoliwiają one identyfikację poszczególnych gatunków grzybów IMBERLY I SAVILLE, 2004; NUGENT halucynogennych [ K IMBERLY 2004; NUGENT I SAVILLE, 2004; LI I OBERLIES, 2005]
bez konieczności mikroskopowej analizy zarodników, czy te makroskopowego rozpoznania materiału w postaci zasuszonej. Jedną z takich metod jest PCR, która zrewolucjonizowała współczesną biologię molekularną umoliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentów DNA w zaledwie kilka godzin. Metoda ta jest doskonałym narzędziem do wykrywania ekstremalnie niskiego stęenia szukanego metabolitu z wysoką specyficznością. Niezwykła wybiórczość i wydajność amplifikacji metody PCR jest uzupełnieniem procedur analitycznych, które omówiono powyej. Połączenie tych metod umoliwia badanie pojedynczego genu lub krótkiego segmentu w jego obrębie, nawet jeśli cały dostępny do analiz DNA pochodzi z zaledwie jednej komórki. Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do wykrywania infekcji wirusowych, równie obecności wirusa HIV-1 we krwi pacjentów chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); do badania samoczynnie powstających nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących wzrost i podział komórek, oraz przed przeszczepami, do określania typu genów, od których zaley układ zgodności tkankowej. PCR okazuje się równie potęnym narzędziem do jednoznacznej
identyfikacji
grzybów
z
rodzaju Psilocybe
[ADAMCZYK ,
2006].
Przeprowadzenie testów przy uyciu tej metody moe zostać wykorzystane do odróniania bezpostaciowych bezpostaciowych grzybni, ujawniania ujawniania łysiczki łysiczki w mieszaninach mieszaninach suszu rónych gatunków gatunków grzybów.
8.
MOLIWOŚCI
IDENTYFIKACJI
I
OZNACZANIA
SUBSTANCJI
HALUCYNOGENNYCH W LABORATORIACH DOLNEGO ŚLĄSKA Badania strukturalne substancji halucynogennych za pomocą metody NMR: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Tel.: +713203458
Politechnika Wrocławska Wybrzee Wysińskiego 27 50-370 Wrocław
Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji wysokosprawnej chromatografii chromatografii cieczowej HPLC: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Politechnika Wrocławska Wybrzee Wysińskiego 27 50-370 Wrocław
halucynogennych
metodą
Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji halucynogennych chromatografii chromatografii gazowej, HPLC i elektroforezy elektroforezy kapilarnej: Zakład Chemii Ekologicznej Kierownik: dr hab. Piotr Wieczorek tel.: +774545841 w. 2545; 2550 Uniwersytet Opolski ul Oleska 48 45-052 Opole
metodą
Badania materiału biologicznego za pomocą PCR: Zakład Technik Molekularnych Kierownik: Dr hab. Tadeusz Dobosz Tel.: +717841588 Akademia Medyczna we Wrocławiu ul. M. Curie-Skłodowskiej 52 50-368 Wrocław Opracowanie metody immunologicznej oznaczania substancji halucynogennych: halucynogennych: Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Gamian Tel.: +71 370 99 86 Polska Akademia Nauk Instytut Immunologii i Terapii T erapii Doświadczalnej ul. Rudolfa Weigla 12 53-114 Wrocław
9. LITERATURA Adamczyk A., Identyfikacja grzybów gatunku Psilocybe semilanceata przy pomocy techniki PCR, Praca magisterska, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wrocław,
2006. Aghajanian G. K., Marek G. J., 1999, Serotonin and hallucinogens,
Neuropsychopharmacology,
21, 16-23.
Albers Ch., Lehr M., Beike J. Köhler H., Brinkmann B., 2002, Synthesis of a psilocyn hapten and a protein-hapten conjugate, J. Pharm. Pharmacol. 54, 12651267. Anastos N., Barnett N. W., Lewis S. W., Gathergood N., Scammells P. J.,. Sims D. N, 2005, Determination of psilocin and psilocybin using flow injection analysis with acidic potassium permanganate and tris(2,2 /-bipyridyl) ruthenium(II) chemiluminescence chemiluminescence detection respectively, Talanta, 67, 354-359. Anastos N., Lewis S. W., Barnett N. W., SimsD. N., 2006, The determination of psilocin and psilocybin in hallucinogenic mushrooms by HPLC utilizing a dual reagent acidic potassium permanganate and tris(2,20-bipyridyl)ruthenium(II) chemiluminescence detection system, J. Forensic Sci. 51, 45-51. Beug M., Bigwood J., 1981, Quantitative analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe baeocystis by High-Performance Liquid Chromatography and Thin-Layer Chromatography, J. Chromatogr. , 207, 379-385. Bogusz M., Wu M., 1991, Standarized HPLC-DAD systems based on retention for systematic toxicological screening, J. Anal. Toxicol. 15, 188-195. Bogusz M. J., Maier R. D., Schafer A. T., Erkens M., 1998, Honey with Psilocybe mushrooms: a revival of a very old preparation on the drug market, Int. J. Legal. Med. , 111, 147–50. Casale J. F., 1985, An aqueous-organic extraction method for the isolation i solation and identification of Psilocin from hallucinogenic mushrooms, J. Forensic Sci., 30, 247-250. Christiansen A., Rasmussen K.., 1983, Screening of hallucinogenic mushrooms with high performance liquid chromatography and multiple detection, J. Chromatogr. 270, 293– 299. Ferara S. D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F., 1992, Solid phase extraction and HPLC-UV HP LC-UV confirmation of drug of abuse in urine, J. Anal. Toxicol. 16, 217-221. Gartz J., 1987, Gartz J., 1992, New aspect of the occurrence, chemistry and cultivation of European hallucinogenic mushrooms, Storia e Scienze Naturali , 8. Gartz J., 1994, Extraction and analysis of indole derivatives from fungal biomass, J. Basic. Microbiol. 34, 17–22. Gartz J., Mueller G. K., 1990, Analysis and cultivation of fruit bodies and mycelia of Psilocybe bohemica, Biochem. Physiol. Pflanzen , 184, 337-341.
Gross S., 2002, Psychotropic drugs in developmental mushrooms: a case study review. J. Forensic Sci. 47, 1298–1302.
Guzman, G., The genus Psilocybe, 1983 , Beih. Nova Hedwigia 74. J. Cramer, Vaduz. Hallen H. E., Adams G.C., Eicer A., 2002, Amatoxins and phallotoxins in indigenous and introduced South African Amanita species, South African J. Botany 68, 322326. Halpern J. H., 2004, Hallucinogens and dissociative agents naturally growing in United States, Pharmacol. Ther., 102, 131-138. Hasler F., Bourquin D., Brenneisen R., Bar T., Vollenweider F. X., 1997, Determination of psilocin and 4-hydroxyindole-3-acetic acid in plasma by HPLC-ECD and pharmacokinetic pharmacokinetic profiles of oral and intravenous psilocybin in man, Pharm. Acta Helv., 72, 175-184.
Hasler F., Bourquin D., Brenneisen R., Vollenweider F. X., 2002, Renal excretion profiles of psilocin following oral administration of psilocybin: a controlled study in man, J. Pharm. Biomed. Anal.,
30, 331-339.
Heim R., Hofmann A., 1958, Isolement de la Psilocybine à partir du Stropharia cubensis Earle et d'autres espèces de champignons hallucinogènes hallucinogènes mexicains appartenant au genre Psilocybe, Compt. rend. Acad. sc., 247, 557-561. http://www.erowid.org/references http://www.grzyby.pl https://hyperreal.info/ Janoszka J., Rymkiewicz A., Dobosz T., 2005, Halucynogenne grzyby – Łysiczki ( Psilocybe Psilocybe ). Część I. Charakterystyka, skutki zaycia, rozpoznawanie, Arch. Med. Sąd. Krym. 55, 215-219.
Kafarski P., 2006, Rodzaje i zawartość związków halucynogennych halucynogennych w źródłach biologicznych z terenu Polski oraz moliwości ich identyfikacji we krwi, Referat na seminarium naukowym „ Biotechnologia w Strategii Rozwoju Województwa Dolnośląskiego”, Wrocław. Keller T., Schneider A., Regenscheit P., Dirnhofer R., Riicker T., Jaspers J., Kisser W., 1999, Analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe subcubensis GUZMAN by ion mobility spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry, Forensic Sci. Int., 99,
93-105.
Kikura-Hanajiri R., Hayashi M., Saisho K., Goda Y., 2005, Simultaneus determination of nineteen hallucinogenic tryptamines/ tr yptamines/β-calbolines and phenethylamines using gas
chromatography-mass chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-electrospray chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry, J. Chromatogr. B 825, 29-37. Kimberly G. N., Saville B. J., 2004, Forensic analysis of hallucinogenic fungi: a DNA-Based approach, Forensic Sci. Int. , 140, 147-157. Kysilka R., Wurst M., Pacakova V., Stulik K., Haskovec L., 1985, High-performance liquid chromatographic determination of hallucinogenic indoleamines with simultaneous UV photometric and voltametric detection, J. Chromatogr. 320, 414–20. Kysilka R., Wurst M., 1989, High performance liquid chromatographic determination of some psychotropic indole derivatives, J Chromatogr . 464, 434–437. Kysilka R., Wurst M., 1990, A novel extraction procedure for psilocybin and psilocin determination in mushroom samples, Planta Med .,., 56, 327-328. Lechowicz W., Metodyka identyfikacji i dentyfikacji i oznaczania wybranych substancji halucynogennych halucynogennych dla potrzeb opiniowania sądowego, Materiały konferencyjne, konferencyjne, Sympozjum Ślesin 2004. Li Ch., Oberlies N. H., 2005, The most widely recognized mushroom: Chemistry of the genus Amanita, Life Sci., 78, 532-538. Lindenblatt H., Kramer E., Holzmann-Erens P., Gouzoulis-Mayfrank Gouzoulis-Mayfrank E., Kovar K.A., 1998, Quantitation of psilocin in human plasma by high-performance liquid chromatography and electrochemical detection: comparison of liquid—liquid extraction with automated on-line solid-phase extraction, J. Chromatogr. B , 709, 255-263. Logan K. G., Stafford D. T., Tebbett J. R., Moore C. M., 1990, Rapid screening for 100 basic drugs and metabolites in urine using cation exchango solid phase extraction and high performance liquid chromatography with diode array detection, J. Anal. Toxicol., 14, 154-160. Musshoff F., Madea B., Beike J., Hallucinogenic mushrooms on the German market — simple instructions for examination and identification, 2000, Forensic Sci. Int., 113, 389-395. Nugent K. G., Saville B. J., 2004, Forensic analysis of hallucinogenic fungi: A DNA-based approach, Forensic Sci. Int. 140,147-153. Passie T., Seifert J., Schneider U., Emrich H. M., 2002, The pharmacology of psilocybin, Addiction Biology , 7, 357–364
Pedersen-Bjergaard Pedersen-Bjergaard S., Sannes E., Rasmussen K. E, Tonnesen F., 1997, Determination of psilocybin in Psilocybe semilanceata by capillary zone electrophoresis, J. Chromatogr. B, 694, 375-381.
Pihlainen K., Sippola E., Kostiainena R., 2003, Rapid identification and quantitation of
compounds with forensic interest using fast liquid chromatography-ion chromatography-ion trap mass spectrometry and library searching, J. Chromatogr. A , 994, 93-102. Repke D. B., Leslie D. T., Mandell D. M., Kish N.G., 1977, GLC-mass spectral analysis of psilocin and psilocybin, J. Pharm. Sci. 66, 743–744. Rudgley R., Alchemia kultury. Od opium do kawy, PIW, 2000 . Saito K., Toyo’oka T., Fukushima T., Kato M., Shirota O., Goda Y., 2004, Determination of psilocin in magic mushrooms and rat plasma by liquid chromatography with fluorimetry and electrospray ionization mass spectrometry, Anal. Chim. Acta. 527, 149–156. Saito K., Toyo’oka T., Kato M., Fukushima T., Shirota O., Goda Y., 2005, Determination of psilocybin in hallucinogenic mushrooms by reversed-phase liquid chromatography with fluorescence detection, Talanta 66, 562–568. Sarwar M., McDonald J. L., 2003, A rapid extraction and GC/MS methodology for the identification of psilocin in i n mushroom/chocolate concoctions, Microgram J. 1, 177–183. Schneider S., Donnelly M., Mushroom Toxicity, w: Auerbach PS, edytor:, Wilderness rd
Medicine 3 ed , St. Louis, Mosty,
1995.
Schwartz R. H., Smith D. E., 1988, Hallucinogenic mushrooms, Clin. Pediatr. 27, 70-73. Semerdzieva M., Wurst M., Koza T., Gartz J., 1986, Psilocybin in Fruchtkoerpern von Inocybe aeruginascens. aeruginascens. Planta Med .,., 47, 83-85. Shirota O., Hakamata W., Goda Y., 2003, Concise large-scale synthesis of psilocin and psilocibin, principal hallucinogenic constituents of „Magic Mushroom”, J. Nat. Prod.
, 66, 885-887.
Stamets P., Gartz J., 1995, A new caerulescent Psilocybe from the Pacific Coast of Northwestern America Integration, Bereich Biotechnologie 6, 21-28. Sticht G., Kaferstein H., 2000, Detection of psilocin in body fluids, Forensic Sci. Int., 113, 403-407. Stijve T., Kuyper T., 1985, Occurence of psylocybin in various higher fungi from several European countries, Planta Med. , 385-387. Stroemer F. C., Janak, K., Koller G. E. B. 2004, Ibotenic acod in Amanita muscaria spores and caps, Mycologist , 18, 114-117. Thompson B. M., 1980 , Analysis of psilocybin and psilocin in mushroom extracts by reversed-phase high performance liquid chromatography, J. Forensic. Sci, 25, 779785.
Tsujikawa K., Kanamori T., Iwata Y., Ohmae Y., Sugita R., Inoue H., Kishi T., 2003, Morphological and chemical analysis of magic mushrooms in Japan, Forensic Sci. Int., 138, 85-90.
Vollenweider F. X., Leenders K. L., Scharfetter C., Maguire P., Stadelamnn O., Angst J.,
1997, Positron emission tomography and fluorodeoxyglucose studies of metabolic met abolic hyperfrontality and psychopathology in the psilocybin model of psychosis, ps ychosis, Neuropsychopharmacology , 16, 357-372.
Wurst M., Kysilka R., Koza T., 1992, Analysis and isolation of indole alkaloids of fungi by high-performance liquid chromatography, chromatography, J. Chromatogr. 593, 201–208.
