HPLC.docx

TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

1. TUJUAN PERCOBAAN Setelah melakukan percobaan ini kami harapkan mampu: -

Menjelaskan Teori Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

-

Mengoperasikan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan baik dan benar.

-

Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kuantitatif dan kualitatif dengan menggunakan alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

2. ALAT YANG DIGUNAKAN -

Syiringe

-

Penyaring Milipone

-

Kolom Licosphere C-18

-

Perangkat HPLC + Injektor + Pencetak Kromatogram

3. BAHAN YANG DIGUNAKAN -

Cafein 15 ppm

-

Metanol

4. DASAR TEORI Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair. Pembahasan teknik kromatografi modern, modern, baru lengkap bila disebut disebut kromatografi cairan kinerja kinerja tinggi

LAPORAN TETAP TETAP KIMIA KIMIA ANALITIK INSTRUME INSTRUMENT NT


(HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm -2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organic Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industriindustri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral. Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi) Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan

LAPORAN TETAP KIMIA ANALITIK INSTRUMENT


fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. 3. Kromatografi penukar ion HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. 4. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. 6. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.



Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010). Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC adalah : a.

Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari

senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat pelrut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut b.

Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan kecepatan dan

tekanan yang tetap c.

Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak mengganggu

masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat menggunakan syringe. d.

Kolom krmatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 – 25 cm dan diameter 4,5 – 5 mm

yang diisi dengan fase stasioner beukuran 5-10 mikrometer dan terbuat dari logam atau stainlessteel. e.

Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk mempunyai

sinsitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi. Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industriindustri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010) Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida. Prinsip umum kromatografi: Keterangan :     

Fase gerak Fase diam Kolom Detektor Rekorder



HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Cupritabu, 2010). Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang dimilikinya mnyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik (Cu)



ANALISA PERCOBAAN

Pada percobaan kali ini,analisis “HPLC” didasarkan pada pengukuran luas atau area puncak dalam kromatogram.pada percobaan penentuan kadar caffeine dalam sampel dengan menggunakan metode HPLC, digunakan satu deret standar yang konsentrasinya yaitu 10 ppm. Hplc adalah suatu metode pemisahan dari analit berdasarkan perbedaan interaksi pada diam dan fase diamnya.sehingga didapatkan waktu retensi yang berbeda-beda antara komponen yang satu dengan komponen yang lainnya. Metode yang digunakan pada pengujian ini adalah analisis kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam.fase diamnya berupa cairan dan padatan fase gerak yang digunakan adalah air dan methanol dengan perbandingan 40:60. Air yang digunakan harus bersih dan tidak ada berupa padatan,bila kandungan tersebut berupa padatan yang kec il-kecil akan terjadi sumbatan dan susah untuk menghilangkannya.setiap percobaan disuntikan caffeine dan akan tertera konsentrasinya.setiap penyuntikan caffein terlebih dahulu dilakukan penghilangan gelembung udara yang ada dalam penyuntikan. Dalam preparasi larutan standard an sampel digunakan membrane (Poly Tetra Fluro Ethylene) untuk proses pemurnian larutan satndar maupun yang akan dipisahkan dari pengotornya.dari data kromatogram larutan standar dengan caffein waktu retensinya 3.94, sedangkan sampel 1, sampel 2 dan 3 sampel 2 waktu retensinya masing-masing 3.94 dan 3.97. Waktu retensi yang didapat pada larutan standar menjadi acuan dalam menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam sampel.



Kesimpulan - Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector, pengolahan data. - Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran. - HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas - Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detector disebut sebagai waktu retensinya. - Posisi injector yang ada pada posisi load casas akan menginjeksi sampel .



DAFTAR PUSTAKA Acun., Sodiyc. 2010. Kromatografi Gas. http://sodiycxacun.blogspot.com. 11 November 2010. Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi Offset. Yogyakarta. Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan HPLC.http://cuprittrappedonlab.blogspot.com. 11 November 2010. Khopkar, S.M., 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Riyadi, W. 2009. Identifikasi signal kromatogram HPLC.http://wahyuriyadi.blogspot.com. 11 November 2010


HPLC.docx

Recommend Documents