Hidrólisis de almidón: análisis enzimático de diastasa Hydrolysis of starch: diastase enzyme assay Casallas V.L,Gonzalez M.L Rodriguez S., Suta C.A. Corporación Tecnológica de Bogotá, Tecnología en Química Industrial Bogotá D.C, Colombia 05/10/2015
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RESUMEN En esta práctica se realiza la hidrólisis del almidón en donde se hace el análisis cinético de diastasa 1% en solución de NaCl 0.1%, en varios tubos de ensayo se prepararon diferentes soluciones (Tabla 1), luego se le adiciono 1 ml de tartrato de cobre y 1ml de Arsenomolibdato, Arsenomoli bdato, después se centrifug centrifugó ó por 3 minutos a 2000 revoluciones por min; se midió la absorbancia en un espectrofotómetro genesys a una longitud de onda de 620 nm, para así determinar la velocidad inicial y la concentración del sustrato para luego realizar la gráfica de Michaelis Menden y Lineweaver - Burk. Palabras claves: Hidrólisis, sustrato, velocidad, enzima, almidón, diastasa, concentración
ABSTRACT In practice starch hydrolysis is performed where the kinetic analysis of diastase 1% is NaCl 0.1% solution in several test tubes different solutions (Table 1) were prepared, then was added 1 ml of tartrate copper and 1mL Arsenomolybdate, Arsenomoly bdate, then centrifuged for 3 minutes at 2000 revolutions per min; the absorbance was measured in a spectrophotometer at genesys a wavelength of 620 nm, to determine the initial velocity and substrate concentration than in graphing of
Michaelis Menden and Lineweaver Burk. Keywords: hydrolysis, substrate, speed, enzyme, starch, diastase, concentration
INTRODUCCIÓN Los carbohidratos o polisacáridos son compuestos que tienen importantes funciones estructurales y de energía de los seres vivos. (Biblioteca Nacional de medicina de los EE.UU., 1997). El almidón es el carbohidrato de reserva más abundante en los tejidos vegetales. Se encuentra en grandes cantidades en tubérculos y semillas de cereales y leguminosas. El almidón puede ser hidrolizado por acción de amilasas o ácidos orgánicos. Este polisacárido contiene alrededor del 20% de una fracción insoluble en agua llamada amilosa y un 80% de una fracción soluble denominada amilopectina. Ambas fracciones fracciones están constituidas constituidas por unidades de α-D-glucosa. (Calvo, 2008) Las enzimas son generalmente, moléculas proteicas que tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas. Debido a la naturaleza proteica, son inestables y pueden ser desnaturalizadas por cambios en el medio. (Gonzalez, 1997) La diastasa es una enzima de origen vegetal que se encuentra en determinadas semillas germinadas y
otras plantas. Su función es la de catalizar la hidrólisis, primero del almidón en dextrina e inmediatamente después, en azúcar o glucosa. La alfaamilasa degrada el almidón en una mezcla de disacáridos: maltosa, maltotriosa trisacárido (la cual contiene dos α (1-4)-residuos de glucosa) y oligosacáridos conocidos como dextrinas, que contienen la α (1 -6)ramas de glucosa. (Cervera, 1994) Figura 1. Reacción de almidón para producir glucosa. Tomada de (Cervera, 1994)
MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES 2 Balón aforado 10 mL
10 Tubo de ensayo grande
1 churrusco
1 Pipeteador
2 Celdas de vidrio redondas
9 Tubo para centrifuga
1 Pinzas para tubo de ensayo
1 Trípode
1 Pipeta graduada de 10 mL
2 Vaso precipitado de 100 mL
1 Malla de cerámica
1 Gradilla para tubo de ensayo grande
3 Pipeta graduada de 5 mL
3 Vaso precipitado de 50 mL
1 Microespátula
1 Frasco lavador
1 Vaso precipitado 500 mL
1 Vidrio de reloj
1 Balón aforado de 20 mL
MÉTODOS 1. Michaelis y Menten propusieron un modelo simple para explicar la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo la enzima se
combina reversiblemente con su sustrato(ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que genera la enzima (Contretas, 2003),
RESULTADOS RESULTADOS
Figura 2. Comportamiento Comportamiento grafico de Michaelos y Menten. Menten. Tomada de (Contretas, 2003)
●
Representació n de los dobles inversos o Representación de LineweaverBurk: Es la representación gráfica de la ecuación de Michaelis y Menten inversa; siendo la más utilizada pero no es la más recomendable el resultado de esta es; pendiente= Km/ Vmax, corte en el eje x= -1/Km y corte en el eje y= 1/Vmax (Contretas, 2003)
Figura 3. Grafica de Lineweaver- Burk. Tomada de (Contretas, 2003)
Método De Somogyi- Nelson Los azucares con grupo aldehído o cetona libre son capaces de reducir los iones Cu + que al reaccionar con el ácido arseno-molibdico del Reactivo Nelson producen compuestos coloreados. (Biológia, 2010) 2.
Y
DISCUSIÓN
DE
Las diastasas son enzimas aportadas por las abejas con el objeto de hidrolizar azucares complejos en simples, las enzimas actúan sobre la velocidad de reacción pero no sobre el equilibrio de reacción por eso su actividad se pierde con el almacenamiento prolongado y son inactivadas por altas temperaturas. (Cervera, 1994). Durante el desarrollo experimental se desnaturalizo la enzima a la hora del calentamiento. La concentración del sustrato (almidón) determina la actividad enzimática medida con la velocidad de la catálisis enzimática. La velocidad de las reacciones enzimáticas es afectada por una serie de factores tales como el pH, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato y presencia de molécula afectadoras (activadores o inhibidores de enzima) (Olavide, 2015)
Grafica #1. Representación de Michaelis- Menten. Concentración de almidón/ tiempo vs Concentración de almidón. (Experimental). Datos Tabla #1 (Anexos)
De acuerdo con la gráfica No 1. Aplicando la constante Michaelis- Menten, se determina que no cumple con lo establecido por Michaelis debido a que da una línea recta y no una curva hipérbola como está establecido, esto puede ser causado por la concentración de sustrato
utilizada que actuó como factor afectante de la diastasa. Sin embargo la ecuación de Michaelis puede reformularse de modo que al graficar se obtenga una línea recta. En el diagrama de Lineweaver Burk en el punto de intersección con las rectas con cada eje define el valor como se muestra en la grafica N° 2. Lo gráficos de este tipo permiten visualizar los datos proporcionados en el desarrollo experimental. Determinando así los valores obtenidos y reportados en ta tabla N° 4. Determinando que la velocidad máxima alcanzada es en el que la enzima realiza su proceso de catálisis en reacción antes de que se saturar. Km experimental Vmax ½ Vmax
Grafica #2. Representación de los dobles inversos o de linenweaver- Burk. Datos tabla # 3 (Anexos)
4,6361 2,1927 1,09585
Tabla #4. Datos experimentales. Constante de MIchaelisMenten, VMax y ½ Vmax.
La constante de MichaelisMenten es característica de una enzima y particular para un substrato. Esta refleja la afinidad de la enzima por el substrato, Km es numéricamente igual a la concentración del substrato. Este parámetro Km no varia con la concentración de enzima. Durante el desarrollo experimental se observa que la Km es mayor a la concentración del sustrato refleja una baja afinidad de la enzima por su sustrato porque a una concentración mas elevada la enzima desarrolla la mitad de la velocidad máxima. Sin embargo se determinó que en la Constante de Michaelis cuando hay pequeñas variaciones en la concentración del sustrato pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una ruta metabólica además para que haya una eficiencia buena de la enzima debe encontrarse a una temperatura de 60°C. Con base en esto, diferentes perfiles de sacarificación generan composiciones distintas, sin embargo la diastasa determina el aumento de los grupos reductores, ya que es la acción colectiva de las amilasas. (Garabay, 1993)
Grafica #3. Absorbancia real/ tiempo vs Absorbancia real. Datos tabla #2 (Anexos)
El método Somogyi- Nelson es muy utilizado para determinar concentraciones de azucares reductores en muy bajas proporciones, se demostró que se cometieron errores experimentales los cuales llevaron a ser erróneos los datos proporcionados por la absorbancia de la muestra. Debido a que la reacción con el reactivo de Smogy- Nelson (Está compuesto por Molibdato de Amonio, Arsénico disódico 7 H 2O, äcido Sulfúrico y agua destilada. Los iones cuprosos, formados por la acción reductora de los glúcidos, al reaccionar con el reactivo Arsenomolibdico), da un color azul en la muestra control, lo que indica la reducción o en su defecto color rojo para la oxidación, (Montero, 2015) pero en las demás muestras no se presentó esta coloración.
COMPARACIÓN DE Km y Vmax
Km= 12,36 Vmax= 1,3042 ½ Vmax= 0,6521
Al comparar estos resultados teniendo en cuenta que se los dos procesos se realizaron a una concentración del 1%, los resultados no concuerdan lo cual puede ser causado por errores experimentales. De igual modo este resultado demuestra la baja afinidad que tiene la enzima con el sustrato. Km= 2,42 Vmax= , 2,17 ½ Vmax= 1,08
En comparación con los resultados que se obtuvieron anteriormente, teniendo en cuenta que este ensayo se realizó a una concentración del 2%, estos concuerdan con que la enzima y el sustrato tienen una afinidad alta y en este experimento el porcentaje de error es menor.
CONCLUSIONES
Las condiciones de operación de las enzimas en los procesos están limitadas por las propiedades específicas de cada una de ellas, como también por las propiedades físicas y químicas des sustrato sobre el cual va a actuar. La concentración del sustrato es un factor importante ya que de este depende la saturación de la enzima.
BIBLIOGRAFÍA Biblioteca Nacional de medicina de los EE.UU. (1997). Medline Plus . Obtenido de https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanis h/ency/article/002469.htm Biológia, M. t. (2010). Cap III. Consideraciones teóricas y practicas de Química Biológica . Calvo, M. (2008). Bioquímica de los alimentos . Obtenido de http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/az ucares/almidon.html Cervera, S. S. (1994). Indice de diastasas y contenido en hidroximetilfurfural en las mieles de la rioja. ZUBÍA, 181-191. Contretas, E. V. (01 de Octubre de 2003). Bioquímica y Biologia Molecular en Línea . Obtenido de http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0 403/ecuacion%20de%20michaelis.html Garabay, M. G. (1993). Biotecnologia Alimentaria . Limusa. Gonzalez, J. M. (1997). Curso de Biomoléculas . Obtenido de http://www.ehu.eus/biomoleculas/index.htm Montero, N. U. (2015). Determinación de la concentración de azúcares reductores en Malus domestica (Rosaceae) por un método fotométrico. Olavide, U. P. (2015). Cinetica enzimatica . Sevilla .
ANEXOS Tubo Almidon (mL) Agua (mL) Enzima (mL) Tiempo (min)
BB
BS
BE
1
2
3
4
5
6
-
1,5
-
0,25
0,5
0,75
1
2,5
1,5
0,5 -
0,25 -
0,25 0,25
2,0* 0,25
1,75* 0,25
1,5* 0,25
1,25* 0,25
2,0* 0,5
0,75* 0,25
-
-
-
10:00
9:45
9:40
9:35
9:25
9:20
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,01
0,02
0,032
0,043
0,054
0,065
Concentración de Sustrato Concentración de sustrato/ tiempo
Tabla #1:Disoluciones con diferentes volúmenes *Esta agua se agregó para aforar cada tubo a 2,5 mL menos el tubo 5, este se llevó a 5 mL como era originalmente.
ABS
ABS REAL
ABS REAL/t
BB 0 BS 0,003 BA 0,022 1 1,245 -1,22 -0,122 2 0,016 0,009 0,000952381 3 0,032 -0,007 -0,000744681 4 0,009 0,016 0,00171123 5 0,01 0,015 0,001621622 6 0,031 -0,006 -0,000652174 Tabla # 2: Absorbancia de las disoluciones 1/ [ ] 1/ V
10 100
5 47,25
3,3333333 31,3333333
2,5 23,375
2 18,5
ABS REAL Absoluta
1,22 0,009 0,00 9 0,007 0,016 0,015 0,006
1,66666667 15,33333333
Tabla # 3: Datos experimentales. Método de linealización Lineweaver- Burk
