PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS La purificación de una proteína a partir de cierto tejido de origen animal o vegetal se inicia moliendo el tejido en una juguera y centrifugando posteriormente. El sobrenadante de la centrifugación se llama “extracto crudo”. Posteriormente es necesario separar la proteína de interés de otros compuestos (ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, etc.) así como de otras proteínas que también están en el extracto crudo. Una purificación involucra varias etapas consecutivas. Normalmente se inicia la purificación con una precipitación selectiva de proteínas y posteriormente se realizan diferentes cromatografías en columna. El método de precipitación más comun es la precipitación (salazón) por sulfato de amonio. Las principales técnicas cromatográficas son la cromatografía de intercambio iónico, la filtración en gel y la cromatografía de afinidad. En el presente práctico se realizarán dos experimentos: una salazón de proteínas del suero sanguíneo y una cromatografía de intercambio iónico.
SEPARACIÓN POR SALAZÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO SANGUINEO OBJETIVO Estudiar la precipitabilidad de las proteínas del suero por sulfato de amonio. INTRODUCCION La precipitación de proteínas por sales neutras en alta concentración se llama salazón. Esta precipitación se explica como una deshidratación de las proteínas por la sal. Los iones de la sal interaccionan con las moléculas de agua, las que se agrupan a su alrededor, disminuyendo el agua disponible para solvatar a las moléculas de proteína. Por falta de solvente, se asocian entre si las moléculas de proteína formando un sólido. La concentración de cierta sal, a la cual precipita una proteína es característica para la proteína, para condiciones de temperatura y pH constantes. La precipitabilidad de las diferentes proteínas es variable, por lo cual la salazón permite separar mezclas de proteínas. La salazón ha sido especialmente útil en el estudio de las proteínas plasmáticas. La concentración del total de proteínas del plasma fluctúa normalmente entre 6,1 y 9,6 g por 100 ml, de los cuales 4,6 y 6,7 g corresponden a la seroalbúmina, 1,2 a 2,3 g a las seroglobulinas y 0,3 a 0,6 g al fibrinógeno. Si al suero se le agrega sulfato de amonio hasta media saturación (es decir, se llega a la mitad de la concentración que corresponde a una solución saturada) precipitan las seroglobulinas, mientras que a saturación precipita la seroalbúmina. Si en cambio al suero se le agrega sulfato de sodio hasta obtener una solución saturada, precipitan las seroglobulinas pero no la seroalbúmina, que queda en solución. METODO Precipitación de la seroglobulina del suero sanguíneo con sulfato de amonio. REACTIVOS Solución saturada de sulfato de amonio. Suero. Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 10% PROCEDIMIENTO - Coloque 1 ml de suero en un tubo plástico de centrífuga. Agregue lentamente lentamente y agitando agitando 1 ml de la solución saturada de sulfato de amonio (la mezcla estará por lo tanto a media saturación). Anote el cambio visible. 1
- Centrifugue y posteriormente deje escurrir el sobrenadante a un tubo de ensayos. - Al precipitado en el tubo plástico agregue agua por gotas, agitando, para disolverlo. - Estudie la presencia de proteínas en el sobrenadante y también en el precipitado disuelto, agregando TCA al 10% o calentando la solución en un baño de agua hirviendo. En ambos métodos se espera la aparición de turbidez o coágulos si hay proteínas. INFORME Describa el cambio que observó visualmente al precipitar las proteínas. Describa si la precipitación fue reversible o irreversible. Indique la presencia de proteína coagulable por calor o por ácido en las diferentes fracciones.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IÓNICO. INTRODUCCIÓN Un intercambiador de iones consiste en una matriz insoluble a la cual se han unido covalentemente grupos cargados. De acuerdo a la carga (a pH neutro) de estos grupos se distinguen: Intercambiadores de aniones:
Los grupos poseen carga positiva. Se usan principalmente los grupos DEAE (dietilaminoetilo) y QAE (un grupo de amina cuaternaria). Los grupos poseen carga negativa. Se usan principalmente los grupos CM (carboximetilo), fosfato y SP (sulfopropilo).
Intercambiadores de cationes:
Las matrices más comunes son los Sephadex, Sepharosas y resinas sintéticas (poliestirenos y polifenoles). En la tabla 1 se presentan algunos intercambiadores de iones comunes agrupados según el tipo de matriz. Tabla 1: Intercambiadores de iones
Nombre DEAE-Sepharosa CM-Sepharosa SP-Sepharosa DEAE-Celulosa Fosfo-Celulosa CM-Celulosa Bio-Rex 63 Dowex 50
Matriz Sepharosa Sepharosa Sepharosa Celulosa Celulosa Celulosa Poliestireno Poliestireno
Grupo cargado DEAE CM SP DEAE Fosfato CM Fosfato Acido sulfónico (-SO3H)
La interacción de proteinas con intercambiadores iónicos involucra la formación de uniones iónicas múltiples entre los grupos cargados de la proteína y los grupos de carga opuesta del intercambiador. La separación cromatográfica depende de la elución diferencial de las proteínas retenidas. Una cromatografía de intercambio iónico involucra dos etapas: 1. Aplicación de la muestra y lavado con tampón. Las proteínas de carga neta opuesta a la carga de los grupos del intercambiador se unen a este, las demás proteínas son eluídas.
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2. Elución de las proteínas retenidas: esto se logra aumentando la fuerza iónica del eluyente (agregando una sal al tampón) o cambiando su pH. (Observación: el eluyente es la solución que se hace pasar por la columna). En el primer caso se producirá un desplazamiento de las proteínas unidas por el correspondiente ión de la sal. Las proteínas de carga neta mayor están unidas más fuertemente y serán eluidas a una fuerza iónica mayor que otras de menor carga neta. En el segundo caso se produce un cambio de la carga de las proteínas retenidas que permite su elución. Durante la elución se logra la separación de las proteínas retenidas. Para la elución se utiliza un gradiente de varios pasos sucesivos (escalonado) o un gradiente continuo. PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES - Columna de plástico con DEAE Sepharosa equilibrada con tampón fosfato 20 mM pH 7,0. - Solución de albúmina (BSA), 10 mg/ml en tampón fosfato 20 mM pH 7,0 - Tampón fosfato 20 mM pH 7,0 - Soluciones de NaCl en tampón fosfato 20 mM pH 7,0 de concentración 0,05 M; 0,1 M y 0,2 M, respectivamente. - Cubetas de cuarzo PROCEDIMIENTO
ATENCIÓN: - durante la cromatografía no se debe secar la superficie del lecho de la columna; - no se debe usar un flujo demasiado rápido. COLOCACION DE LA MUESTRA Y LAVADO Deje escurrir el tampón, abriendo la llave de la columna, hasta que esté a punto de empezar a secarse la superficie del lecho de la columna. Cierre la llave. Coloque sobre la superficie del lecho 0,5 ml de la solución de albúmina y abra nuevamente la llave. Una vez que la muestra haya entrado en la columna agregue 9 ml de tampón y recolecte fracciones de aproximadamente 3 ml (abra o cierre la llave según sea necesario). ELUCION DE LA MUESTRA Agregue sucesivamente de 15 ml de cada una de las soluciones de NaCl en concentración creciente. Colecte el eluato de la columna en fracciones de 3 ml. CUANTIFICACION DE LA MUESTRA EN EL ELUATO Para determinar la concentración relativa de albúmina en las fracciones colectadas mida su absorbancia a 280 nm, calibrando el espectrofotómetro con el tampón (use cubetas de cuarzo). INFORME El resultado de una cromatografía en columna se presenta en forma de un perfil de elución, que consiste en un grafico de un parámetro que representa la concentración de los solutos en función del volumen de eluato o número de las fracciones recolectadas. El volumen se comienza a medir a partir de la aplicación de la muestra.
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Construya el perfil de elusión graficando la absorbancia de las fracciones (A280) en función del número de la fracción. Indique con una flecha los cambios de eluyente efectuados. Alternativamente, puede introducir una segunda ordenada para la concentración del cloruro de sodio en el lado derecho del gráfico y dibujar el gradiente salino escalonado.
CUESTIONARIO: 1. ¿Qué resultado esperaría, si la columna se equilibrara con tampón fosfato 20 mM pH 7,0 y NaCl 500 mM y la muestra aplicada estuviera disuelta en el mismo tampón? 2. ¿Qué resultado esperaría Ud. si la columna se equilibrara con tampón de pH 5,0? (el pI de la albúmina es 5). 3. Si realizara el mismo experimento utilizando suero como muestra, ¿qué resultados esperaría? ¿Podría identificar las fracciones que contienen albúmina? Discuta. 5. Se tienen 10 litros de una solución que contiene una enzima más hemoglobina. Suponiendo que Ud. estuviera interesado en la enzima, ¿como podría remover la hemoglobina de la solución, sin usar una columna? BIBLIOGRAFIA: -
Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry 2a. Edición. Editores Freeman & Company.
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