otEGlb'NAGí"tiiAroV QUIMICOS FARMACEUTICOS DIOLOGOS MEXlCO, A.C.
Con Registro ante la DGP F-032
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FE DE ERRATAS Guía de validación de métodos analíticos 1a. Edición Mayo de 2002 1.- Para informar que en la página 37 después del primer párrafo falto incluir la siguiente ecuación a la que se hace referencia
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bl 2.- El orden de las páginas 98 y 100 están invertidas, la página 98 debe ser la 100 Y la página 100 debe ser la página 98.
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Métodos
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Analíticos
V ALIDACION
COMISION DE VALIDACION DE MElODOS ANALITICOS
Ma. Araceli García Evelyn Soberón Myriam Cortés Ramón Rodríguez , José Luis Herrera Alej an dro Alcántara lAMBIEN COLABORARON: Amparo Chárvel Rosalinda Mota Alfredo Garzón
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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LA VALIDACiÓN DE MÉTODOS ANALíTICOS es parte fundamental del desarrollo de una nueva formulación y de la técnica de análisis de control de calidad de una forma farmacéutica, ya que es durante esta secuencia de pruebas y análisis, en donde el químico se da cuenta si el estudio, el cual esta siendo evaluado sistemáticamente, cumple con los propósitos para los cuales fue diseñado. De acuerdo a las Buenas Prácticas tanto de Fabricación como de Laboratorio, es necesario que todos los métodos analíticos que empleamos estén validados.
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Bajo este marco y considerando a la validación de métodos analíticos como el proceso por el cual queda establecido, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para las aplicaciones analíticas deseadas, el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México,. A.C. ve con agrado, como uno de sus primeros frutos editoriales, sigue siendo hoy una herramienta útil para el entorno laboral analítico en la industria farmacéutica. Sin embargo, considerando tanto el avance científico y tecnológico de los últimos años, como los valores que nos rigen y nuestra búsqueda constante de la excelencia, han hecho posible nuevamente que presentemos ante ustedes esta versión actualizada de la Guía de Validación de Métodos Analíticos, de manera tal, que satisfaga sus necesidades laborales presentes al día de hoy. El propósito principal es unificar criterios entre los profesionistas y hacer más fácil y productivo el trabajo de todos los que de alguna manera, estamos involucrados en este tipo de actividades. No me resta más que recomendarles ampliamente este trabajo, realizado por un grupo de expertos en el área, quienes de manera honorífica han decidido colaborar y retribuir a su gremio a través de esta publicación. Sin duda alguna, nuestra institución les esta enormemente agradecida por sus valiosas aportaciones. Al día de hoy y ante las perspectivas mundiales, las exigencias de competitividad son muchas, debemos estar preparados para ello, las cuestiones regulatorias y de armonización nos obligan a empatar nuestros conocimientos, en este caso, analíticos en pro de un resultado de calidad. Sirva pues, esta guía para tal objetivo. Atentamente, "Por la Unidad y la Excelencia"
Q.:J'B. José 9vfanuef Cárdenas Presidente Colegio Nacional de Ouimicos Farmacéuticos Biólogos México. A.C. PRÓLOGO
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
PRESEN-.:nCIDN
Colegas:
En el IX Congreso Nacionalde Educación Farmacéutica del año 2000 organizado por el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos AC en la Universidad de Colima, asistí a la ponencia de la colega Amparo Chárvel
Gaos que verso sobre Validación de Métodos Analíticos; donde se planteó la necesidad de revisar la Guía, debido entre otras, a la inquietud de muchos de nuestros colegas en su actualización y a las publicaciones de otros lineamientos y guías en años recientes. Debido a esta propuesta, José Manuel Cárdenas
presidente del colegio me invito a participar en la actualización de la guía y para ello, se formo una comisión especial de Validación de Métodos Analíticos. Gracias al trabajo de varios colegas y a los comentarios vertidos en diversos foros organizados por el colegio; se dio lugar a esta publicación, la cual presentamos
a nuestro gremio para facilitar esta actividad. Es importante resaltar el trabajo de los colegas que participaron en
la elaboración de la guía anterior, ya que no habría sido posible este hecho; así como agradecer a los colegas que colaboraron en la actualización de la guía, por su tiempo, conocimientos, experiencia, esfuerzo y trabajo orientado al beneficio de nuestra comunidad gremial.
Presidente de la Comisión Especial de Validación de .Métodos Analiticos
PRESENTACION
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
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1.
Prólogo (Introducción).
2
2.
Objetivo y campo de aplicación.
4
3.
Justificación.
4
4.
Definiciones.
8
5.
Símbolos y Abreviaturas.
5
6.
Clasificación de Métodos Analíticos
17
7.
Parámetros de Desempeño.
19
8.
Determinaciones, metodología y criterios de aceptación
20
9.
Sustancias de referencia.
40
10. Revalidación
44
11. Comparación de 2 Métodos Analíticos
44
12. Documentación
51
13. Concordancia con Guías Internacionales.
52
14. Bibliografía
53
15. Anexos
55
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GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
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EN MUCHAS SITUACIONES, cuando se tiene interés en medir un
componente en una muestra, es necesario contar con una metodología de medición (método analítico). Por ello, las empresas de transformación (principalmente farmacéuticas) requieren de este tipo de metodologías, pudiendo utilizar metodologías farmacopeicas o bien, dedicar tiempo para su desarrollo, partiendo del hecho de que deben cumplir el atributo de confiabilidad. Como en muchas de las actividades de la industria farmacéutica se hace uso del método científico para alcanzar este atributo, es necesario llevar a cabo en la mayoría de las ocasiones estudios experimentales que permitan demostrar la confiabilidad de lo que se está midiendo. Un proceso que permite cumplir este fin, es la validación. Como es bien sabido, todo producto farmacéutico debe reunir atributos de identidad, pureza, concentración, potencia, inocuidad y disponibilidad para cumplir con los aspectos normativos oficiales e internos y no menos importantes, los éticos, por lo que si un método analítico, que finalmente es el medidor de las
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características críticas de calidad del producto, no es confiable, se corre el grave riesgo de afectar al usuario final que es un paciente. Desde este enfoque, la validación de métodos analíticos es un sistema involucrado en los procesos de fabricación en el área de calidad de la empresa y bajo la filosofía de la Validación, las Autoridades Regulatorias verifican que las empresas sustenten estos sistemas con actividades documentadas, como se indica en la NOM-059 SSA1 numerales 5.6.3, 5.7.4, 9.11.3, 9.11.5 Y 9.12.3 Y en otros
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regulatorios internacionales.
El objetivo final de un dictamen de calidad, es la liberación o no liberación de un producto sobre la base de las especificaciones previamente establecidas. Esta decisión es tomada generalmente por el profesional farmacéutico, en gran medida está dada por los resultados obtenidos al aplicar uno o diversos métodos analíticos; si estos no son farmacopeicos y no están I
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validados, su decisión corre el riesgo de ser errónea y afectar al usuario del
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INTRODUCCiÓN
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GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
producto y por ende, a la misma empresa. La validación le proporciona, a quien aplica la metodología, una seguridad de la confiabilidad de dichos métodos y puede tomar la decisión final con certeza. La validación de métodos analíticos también impacta en otras áreas relacionadas a la' calidad de un producto (estabilidad, limpieza de equipos, entre otras). Hasta este momento, las empresas que han implantado esta actividad inicialmente se orientaron con la Guía de Validación de Métodos Analíticos publicada por el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos - México, A.C. y avalada por la Secretaría de Salud hace más de una década. En su momento, esta Guía cubrió las necesidades que por la corriente de Validación habían empezado a surgir en la mayoría de las empresas; con el tiempo, por necesidades propias de la validación de procesos, la validación de métodos se especializó al grado de convertirse en una actividad independientemente regulada. Con los avances tecnológicos, aplicaciones de nuevas técnicas, tratamiento diferente de las muestras, etc., el Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos - México, A.C., ha visualizado la necesidad de publicar una nueva edición de esta guía. No se puede pasar por alto el hecho de que el factor más importante durante la validación de todo método analítico es siempre el criterio del profesional, responsable de esta decisión, criterio que es necesario aplicar después de tomar en cuenta todos los factores relacionados con el, o los principios activos, concentraciones, forma farmacéutica, tipo de muestra, método,1e análisis, propósito de la técnica analítica, instrumentación, sustancias retaclonadas, etc., estos requisitos constituyen únicamente una guía para dar al químico un soporte técnico adecuado para resolver cada caso particular. Así mismo, no hay que perder de vista que ésta es únicamente una Guía donde se establecen los requisitos mínimos, que es necesario satisfacer con la Validación y que no limita de ninguna manera el interés que pudiera tener el profesionista para profundizar, de manera particular, en alguno o algunos de los temas involucrados. El C.N.Q.F.B. agradece de manera muy especial a todas las personas que colaboraron en la preparación, modificación y actualización de esta Guía y a la Secretaría de Salud por su apoyo y aceptación de estos Requisitos Mínimos para la Validación de Métodos Analíticos, ya que estamos seguros de que será en beneficio de la comunidad científica del país.
INTRODUCCiÓN
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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2. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACiÓN
Establecer lineamientos generales mínimos necesarios para llevar a cabo el proceso de validación de métodos analíticos en aquellos establecimientos dedicados a: a) Fábrica o laboratorio de materias primas para la elaboración de medicamentos o productos biológicos para uso humano, incluyendo fármacos; b) Fábrica o laboratorio de medicamentos o productos biológicos para uso humano; e) Laboratorio de control químico biológico, farmacéutico o de toxicología, para el estudio y experimentación de medicamentos y materias primas, con el objeto de establecer la validez de los métodos analíticos utilizados para el control analítico del producto. d) Laboratorio de control auxiliar de la regulación,
Un método analítico se define como la descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra. Un analito se define como un componente específico en una muestra a medir en un análisis; por lo que un método analítico mide un componente específico (analito) en una muestra y como todo proceso de medición, éste debe ser confiable para ser utilizado con un propósito definido. La validación de métodos analíticos es el proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad det método satisface los requisitos para la aplicacion analítica deseada; es decir cumple con su'propósito. Esta actividad puede ser justificada por los siguientes aspectos: OBJETIVO
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CAMPO
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APLICACiÓN
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GUíA
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VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
3.1. Moral y ética. El profesional farmacéutico es el responsable de los procesos farmacéuticos y por lo tanto de la calidad de estos. Todo producto farmacéutico (materias primas, producto intermedio, producto a granel y producto terminado) debe satisfacer requisitos y para ello se utilizan métodos para medir componentes específicos en el producto; lo cual es llevado a cabo con métodos analíticos.
3.2. Aseguramiento de Calidad. Los métodos analíticos están definidos como un sistema crítico en el Aseguramiento de Calidad en una empresa farmacéutica, ya que impactan de manera directa en la calidad de un producto.
3.3. Económica. La carrera de muchas empresas por alcanzar una productividad elevada a costos menores, está determinada, entre otros factores, al dictamen del producto en menor tiempo, utilizando métodos de prueba de menor costo, mantenimiento o tiempo de análisis entre otros.
3.4. Regulatoria. La presente guía está justificada con base en las siguientes referencias: Reglamento de Insumos para la Salud. Publicado en el Diario Oficial el4 de Febrero de 1998 referente a los establecimientos que se destinen a la fabricación de insumos (medicamentos, fármacos, materias primas y aditivos), establece lo siguiente.
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N T E N IDO
Los establecimientos que se destinen a la fabricación de insumas, llevarán el control analítico de estos. Dicho control deberá incluir: 111. La validación de las técnicas empleadas.
Norma Oficial Mexicana NOM-OS.9-SSA1-1993. Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos, establece los siguientes puntos referentes a la Validación de Métodos Analíticos. JUSTIFICACiÓN
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ANALíTICOS
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NUMERAL
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DE LA NORMA
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CONTENIDO
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El encargado del área de producción se encargará de realizar las
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siguientes funciones, sin perjuicio de las obligaciones y responsabilidades que correspondan al responsable sanitario, conforme a la Ley General de Salud y al Reglamento de lnsumos para la Salud:
S.6.3
Que se lleven a cabo estudios de validación de los procesos de fabricación y de los sistemas involucrados.
S.7
El encargado del área de calidad se encargará de realizar las siguientes funciones, sin perjuicio de las obligaciones y responsabilidades que correspondan al responsable sanitario, conforme a la Ley General de Salud y al Reglamento de Insumos para la Salud:
S.7.4
Que se lleven a cabo estudios de validación de los procesos de fabricación y de los sistemas involucrados.
9.11.3
Los métodos analíticos deben ser validados, de acuerdo con lo establecido en el apartado 9.12 "control del laboratorio analítico".
9.12.3
Se debe contar con métodos de análisis validados para producto a granel, producto terminado y materia prima en caso de no aparecer en cualquier farmacopea internacional ni en la FEUM.
NORMA Oficial Mexicana NOM-164-SSA1-1998, Buenas prácticas de fabricación para fármacos.
NUMERAL DE LA
C O N T E N I D O
NORMA
16.1
Los controles de laboratorio e inspecciones deben apoyarse en normas, PNO's o manuales que contengan las especificaciones para garantizar la confiabilidad de sus resultados. Tales controles deben
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incluir:
16.1.S
Validación de métodos analíticos utilizados por la farmacopeicos.o farmacopeicos que tengan la farmacopea de referencia.
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JUSTIFICACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
NORMA Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos.
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NUMERAL DE LA NORMA 5.5
O N T E N IDO
Cuando se cambie el método analítico durante el estudio de estabilidad, se debe demostrar que los dos métodos son equivalentes mediante el proceso de validación.
5.10.2 5.10.2.3
Información general, especificaciones y métodos analíticos: Información de la linealidad, precisión, exactitud, reproducibilidad, repetibilidad y especificidad del método analítico indicativo de estabilidad.
6.
Fármacos Para fines de registro de un medicamento con fármacos nuevos en México, el fabricante del medicamento debe presentar ante la Secretaría de Salud estudios de estabilidad acelerada y/o a largo plazo de tres lotes del (los) fármaco(s) efectuados por el fabricante de los mismos, utilizando métodos analíticos validados.
Las regulaciones anteriores, determinan la obligación de validar métodos analíticos. Estas regulaciones podrían ser modificadas, por lo que es importante estar actualizados.
JUSTIFICACiÓN
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GUíA
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VALIDACiÓN
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ANALíTICOS
4. D E F IN I e 1'0 N E S
4.1. Adecuabilidad del sistema.- Verificación de que el sistema (instrumento,
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analista, equipo, sustancia de referencia, entre otros) opera con base a criterios preestablecidos, que permitan asegurar la confiabilidad de los resultados de un método analítico.
4.2. Analito.- Componente específico de una muestra, a medir en un análisis. 4.3. Calibración.- Conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones especificadas, la relación entre los valores indicados por un instrumento o sistema de medición, o los valores representados por una medición material y los valores conocidos correspondientes a un patrón de referencia.
4.4. Documentación.- Conjunto de información que sustenta una actividad realizada.
4.5. Especificaciones.- Descripción del material, sustancia o producto, que incluye la definición de sus propiedades y características, con las tolerancias de variación de los parámetros de calidad.
4.6. Especificidad.- Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra.
4.7. Estudio colaborativo.- Reproducibilidad realizada en distintos laboratorios, por diferentes químicos.
4.8. Exactitud.- Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor de referencia.
4.9. Estabilidad analítica de la muestre» Propiedad de una muestra, preparada para su cuantificación, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración del analito, después de almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.
4.10.lntervalo.- Concentraciones incluidas entre la concentración superior einf~:;?,;'~fJ'S rior delanalito (incluyendo éstas), para las cuales se ha demostrado que el mét9ct~~~f~1~b~\{ analítico es preciso, exacto y lineal. . .
DEFINICIONES
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
4.11. Límite de cuantificación.- Concentración mínima del analito, que puede ser determinada con precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación establecidas.
4.12. Límite de detección.- Concentración mínima del analito en una muestra, que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de operación establecidas.
4.13. Línealidad.- Habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por medio de una transformación matemática definida. son proporcionales a la concentración del analito, dentro de un intervalo determinado.
4.14. Metodología de prueba.- Procedimiento o grupo de procedimientos, para determinar si un producto Ó materia prima cumple con las especificaciones establecidas.
4.15. Método analítico.- Descripción de la secuencia de actividades, recursos materiales y parámetros que se deben cumplir, para llevar a cabo el análisis de un componente específico de la muestra.
4.16. Método analítico desarrollado internamente.- Método desarrollado por el propio laboratorio.
4.17. Método analítico indicativo de estabilidad.- Método cuantitativo capaz de detectar variaciones en las propiedades del material evaluado, debidas a las condiciones de almacenaje.
4.18. Método analítico oficial.- Método que aparece en la literatura oficial reconocida. 4.19. Método analítico no oficial.- Método que no aparece en la literatura oficial reconocida.
4.20. Muestra.- Porción del material a evaluar. 4.21. Muestra analítica.- Porción del material a evaluar de acuerdo al método analítico.
4.22. Muestra adicionada.- Porción representativa del material a evaluar, a la que se le adicionan cantidades conocidas del analito.
4.23. Parámetros de desempeño.- Parámetro específico a estudiar en un protocolo de validación.
DEFINICIONES
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DE
VALIDACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
4.24. Placebo analítico.- Muestra que contiene todos los componentes de un producto a excepción del analito. 4.25. Placebo adicionadQ.- Muestra de un placebo analítico al cual se le adiciona una cantidad conocida del analito. 4.26. Precísión.-Grado de concordancia entre resultados analíticos individuales, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de una muestra homogénea del producto o de una referencia. 4.27. Precisión intermedia.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia relativa obtenida entre determinaciones independientes realizadas en un mismo laboratorio, por diferentes analistas, en distintos días. 4.28. Proporcionalidad.- Relación establecida por una ecuación matemática entre los resultados obtenidos por dos métodos analíticos. 4.29. Protocolo de validación.- Descripción de pruebas específicas para demostrar que un proceso da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistente. 4.30. Recobro.- Cantidad del analito determinada en el placebo adicionado o muestra adicionada, empleando el método analítico. 4.31. Repetibilidad.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia obtenida entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando los mismos instrumentos y método. 4.32. Reproducibilidad.- Precisión de un método analítico, expresada como la concordancia entre determinaciones independientes realizadas por diferentes laboratorios. 4.33. Revalidación.- Comprobación de que el método analítico mantiene su desempeño cuando existen cambios en la composición del producto, en el método analítico, o cambios críticos en los procesos de fabricación. 4.34. Robustez.- Capacidad del método analítico de mantener su desempeño al presentarse variaciones pequeñas pero deliberadas, en los parámetros normales de operación del método.
4.35. Sustancia de referencia.- Sustancia de uniformidad reconocida destinada a utilizarse en comprobaciones analíticas físicas, químicas o microbiológicas eR~1
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GUíA
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VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
transcurso de las cuales sus propiedades se comparan con la sustancia en evaluación.
4.36. Sustancia de referencia primaria.- Sustancia quees designada o reconocida por tener la más alta calidad metrológica, cuyas propiedades se aceptan sin referencia a otras sustancias.
4.37. Sustancia de referencia secundaria.- Sustancia cuyas propiedades se asignan por comparación con una sustancia de referencia primaria, o bien, cuando es certificada mediante un procedimiento científicamente reconocido.
4.38. To/erancia.- Reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos, por el análisis de la misma muestra bajo diferentes condiciones normales de operación como pueden ser: equipos, columnas. La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que el primero se refiere a la influencia de factores internos del método, mientras que la tolerancia, se refiere a factores externos al método.
4.39. Validación del método analítico.- Proceso por el cual se demuestra, por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para las aplicacion analítica deseada ..
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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Cuando en esta guía se haga referencia a los siguientes símbolos o abreviaturas. se entenderá:
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Authentic Substance Pendiente. Pendiente del método 1. Pendiente del método 2. Ordenada al origen. Ordenada al origen del método 1. Ordenada al origen del método 2.
BP
British Pharmacopoeia
BPF
Buenas prácticas de fabricación.
CLAR
Cromatografía de líquidos de alta resolución.
COSUFAR
Comité de Sustancias Farmacéuticas de Referencia.
CV
Coeficiente de variación o desviación estándar relativa. Coeficiente de variación de regresión.
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de almacenaje respecto de la me dia aritmética del análisis inicial. Valor de la distribución F de
F0.975,91
Fisher asociado a una confianza del 97.5% ya grados de libertad (gl) establecidos.
F0.05,g/
Valorde la distribución F de Fisher asociado a una confianza del 5% y a grados de libertad (gl) establecidos. Valor de la distribución F de Fisher
F0.025,91
asociado a una confianza del 2.5% y agrados de libertad (gl) establecidos. FCC
Food Chemical Codex
FDA
Food and Drug Administration
FEUM
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos.
g
Gramos.
gl
Grados de libertad. Intervalo de confianza para la pendiente poblacional. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 pendientes poblacionales. Intervalo de confianza para la
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ordenada al origen poblacional Intervalo de confianza para la diferencia de 2 ordenadas al origen poblacionales.
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MÉTODOS
ANALíTICOS
Intervalo de confianza para la media poblacional. Intervalo de confianza para la diferencia de 2 medias poblacionales.
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Factor capacidad.
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Límite de cuantificación.
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Límite de detección.
LGS
Ley General de Salud.
LNSP
Laboratorio Nacional de Salud Pública.
mg
miligramos.
n
Número de mediciones o recobros o blancos o muestras o determinaciones. Número de muestras del análisis inicial
n,
Número de mediciones del método 1. Número de mediciones del método 2.
N
Número de platos teóricos.
NF
National Formulary
NIST
National Institute of Standard and Technology
NOM
Norma Oficial Mexicana.
OMS
Organización Mundial de la Salud
PNO
Procedimiento Normalizado de Operación.
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
ppm
Partes por millón.
R
Resolución. Coeficiente de determinación.
Rr
Retención relativa.
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Desviación estándar. Desviación estándar de los blancos. Desviación estándar de la ordenada al origen. Desviación estándar para la diferencia de 2 ordenadas al origen. Desviación estándar de la pendiente. Desviación estándar para la diferencia de 2 pendientes. Varianza. Varianza del método 1 Varianza del método 2 Varianza poblacional. Razón de 2 varianzas poblacionales.
Sref
Sustancia de Referencia
SSA
Secretaría de Salud. Desviación estándar de regresión.
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Factor coleo.
t0.975,91
Valor de la distribución t de Student asociado a una confianza del 95% y
SíMBOLOS
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ABREVIATURAS
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GUíA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALfTICOS
a grados de libertad (gl) establecidos. USP
United States Pharmacopeia
USPC
United States Pharmacopoeia Committe
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Validación de métodos analíticos.
x
Media aritmética de x.
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Media aritmética de y. Media aritmética del método 1 Media aritmética del método 2 Media aritmética del análisis inicial. Media aritmética de cada condición
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de almacenaje. %
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Porcentaje o por ciento.
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MÉTODOS
ANALíTICOS
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Para fines de esta guía los métodos se clasifican bajo los siguientes criterios:
1). En función de su estado regulatorio en: a) Métodos farmacopeicos. Todos aquellos métodos que aparecen en cualquier farmacopea (FEUM, USP, SP, Europea, etc.). b) Métodos no farmacopeicos. Aquellos métodos no compendiados en una farmacopea.
2). En función de su apllcaclén (NOM 059 SSA1 y NOM-073-SSA1) en: a) Métodos para producto a granel. b) Métodos para producto terminado. e) Métodos para materia prima. d) Métodos indicadores de estabilidad.
3). En función de la naturaleza de la respuesta analítica en: a) Métodos físico-químicos. Cuando la respuesta es de carácter físico (absorción de luz, emisión de luz, voltaje, etc.) o químico (consumo de iones -OH, consumo de un acomplejante, etc.). b) Métodos biológicos. Cuando la respuesta es de carácter biológico (crecimiento de un microorganismo, protección, muerte, etc.).
4). En función de su propósito analítico en: a) Métodos para cuantificar el analito(contenido o potencia). b) Métodos para establecer la presencia del analito a un límite. e) Métodos para identificar el analito. C
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Esta última clasificación es la que se utiliza para establecer los parámetros de desempeño a estudiar en la validación del método analítico. En el Anexo 1 se presenta una matriz de equivalencia entre esta clasificación y otros métodos con aplicaciones analíticas definidas de otra manera. Cualquier método analítico puede estar constituido por técnicas de separación, extracción, etc., y por técnicas de medición (espectrofotometría, volumetría, colorimetría, potenciometría, etc.) que permiten medir la respuesta del analito en la muestra. A esta última técnica dentro de la guía, se le denomina Sistema de Medición. 5). En funpión de la naturaleza del sistema de medición se clasifican en:
a) Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta analítica, permite medir una señal de ruido (cromatógrafo de líquidos, cromatógrafo de gases, espectrofotómetros, etc.).
b) Métodos en los cuales el instrumento de medición no permite medir una señal de ruido (buretas, medidor de halos, potenciómetros. etc.).
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ANALíTICOS
7.PRRÁMETROS DE DESEMPEÑO
En función de la aplicación analítica de un método, la siguiente tabla indica los parámetros de desempeño a estudiar.
PARAMETRO DE DESEMPEÑO
CONTENIDO I POTENCIAl VALORACION
PRUEBAS DE IMPUREZAS IDENTIFICACION
CONTENIDO I VALORACION
LIMITE
SI
SI
SI'
SI
SI
NO
ESPECIFICIDAD'
SP
SI
SI
SI
EXACTITUD Y REPETIBILlDAD
SI
SI
NO
NO
LINEALIDAD DEL MÉTODO
SI
SI
NO
NO
SI
SI
NO
NO
.~
PRECISiÓN / ADECUABILlDAD
*
DEL SISTEMA
LINEALIDAD DEL SISTEMA
PRECISiÓN DEL MÉTODO O PRECISiÓN INTERMEDIN
\
NO
--
ESTABILIDAD ANALlTICN DE LA MUESTRA
*
*
NO
LíMITE DE DETECCiÓN
NO
NO
SI
NO
SI
NO
NO
ROBUSTEZ
*
*
*
NO
TOLERANCIA
*
*
*
NO
LíMITE DE CUANTIFICACiÓN
NO
NO
* PUEDE SER REQUERIDO DEPENDIENDO DE LA NATURALEZA DEL MÉTODO 1. La falta de especificidad de un método analítico, puede ser compensada por otra alternativa analítica de soporte, como por ejemplo cromatografía de capa fina. 2. También es definido como un estudio de tolerancia. 3. Un método que es exacto y lineal, por definición es específico al placebo analítico o a los otros componentes de la muestra.
PAR A
M E T
R
o
S
D E
D
E
S E M P
E
Ñ
o
19
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B.DETERMINRCIONES, METODOLOEiíR y CRITERIOS DE RCEPTRCIÓN
8.1. Precisión del Sistema.
8.1.1. Metodología.- Un analista debe preparar por lo menos un sextuplicado de soluciones a la concentración del analito que represente la concentración de la solución de referencia utilizada, o en ciertos casos, la concentración que represente el 100% de la muestra procesada para su medición; preparadas por dilución o por pesadas independientes. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones. Calcular, S Y CV de la respuesta analítica. Para los sistemas biológicos, se deben cumplir los criterios de validez inherentes al diseño del bioensayo.
8.1.2. Criterio de Aceptación: CV~ 1.5% para métodos físico - químicos.
CV ~ 3% para métodos biológicos. Valores superiores deben ser justificados. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, Se describen en el Anexo 2.
8.2. Adecuabilidad del Sistema (Métodos Cromatográficos)
8.2.1. Metodología.- Inyectar por quintuplicado la solución de adecuabilidad. Reportar la respuesta del analito, calcular el CV y para cada inyección informar cuando proceda:
DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
20
GUíA
[)E
VALI[)ACIÓN
[)E
MÉTO[)OS
ANALíTICOS
factor capacidad (K'). resolución (si procede, R). retención relativa (si procede, Rr). factor de coleo (T). número de platos teóricos (N). 8.2.2. Criterios de Aceptación.CV ~ 2% para la respuesta analítica. Valores superiores deben ser justificados. Para cada inyección se recomienda:
K'
>2.~
R> 2. T<2. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 3. La evaluación de la adecuabilidad del sistema se recomienda para todos los métodos analíticos, ya que permite verificar que el sistema de medición funciona apropiadamente, independientemente de las condiciones ambientales. Es conveniente que antes de llevar a cabo la validación del método analítico, se establezcan los criterios apropiados para la operación del sistema de medición, para ser evaluados en la validación y verificados de manera rutinaria al emplear el método analítico. Por ejemplo. en el caso de métodos volumétricos, el volumen .de la titulación de blancos y/o de un volumen específico de la solución de referencia; en el caso de métodos fotométricos la lectura de soluciones blanco; entre otros. 8.3. Linealidad del Sistema. 8.3.1. Metodología.- Un analista debe preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentración (intervalo) de la solución de
DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
referencia ya sea por dilución (a partir de una misma solución concentrada) o por pesadas independientes (cuando no sea posible prepararlas por dilución). La concentración central debe ser igual a la que se prepara la solución de referencia en el método o en ciertos casos, la concentración que represente el 100% en la muestra procesada para su medición. El intervalo debe incluir la especificación para el caso de aquellos métodos utilizados para contenido I potencia
I valoración. Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones de medición, reportarla relación concentración vs respuesta analítica. Calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (bo) ' el coeficiente de determinación (r2 ) y el intervalo de confianza para la
».
pendiente (1c(J31
El intervalo está en función del propósito del método, y por lo general se expresa como % de la concentración de la solución de referencia o en función del contenido de! analito en la muestra procesada para su medición. Para contenido I potencia I valoración se sugiere un mínimo de±20%. Para contenido I valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un 20% por arriba de la especificación. Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120% Es crítico que el intervalo no excluya valores de concentración que potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra. 8.3.2. Criterios de Aceptación:
IC(J31 ) , no debe incluir el cero. Cualquier otro criterio de aceptación debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 4: Es conveniente trazarla gráfica la concentración (x) vs la respuesta analítica (y), e incluir en ella la ecuación, la línea de ajuste y el coeficiente de determinación. n<=T<=I:HAfNArlnNI=~
MI=TODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8.4. Especificidad.
8.4.1. Metodología: Partiendo de la experiencia en el análisis de la muestra, se deben establecer las posibles sustancias interferentes, y adicionar cantidades conocidas de éstas, solas o combinadas a la muestra y evaluar su respuesta al método, bajo las mismas condiciones de análisis. Para métodos de identificación: Se deben seleccionar sustancias que potencialmente interfieran en la determinación con base en la estructura molecular del analito, precursores, sustancias relacionadas, vías degradativas, entre otros. Para métodos de contenido / potencia / valoración: Se deben analizar placebos del producto, como lo indica el método, muestras de producto, y cuando proceda: -sustancias relacionadas; -precursores;. -homólogos; y una mezcla del producto con ellos o cualquiera de ellos.
Para métodos de contenido / valoración de impurezas: Si se dispone de las impurezas se deben adicionar éstas al analito y/o a la muestra analítica en niveles que incluya la especificación. Analizar como lo Indica el método. Cuando no se dispone de éstas, la muestra que contiene el analito debe someterse a condiciones que generen su inestabilidad química (luz, calor, humedad, hidrólisis ácido-básica y oxidación) y aplicar el método a la muestra resultante. Para métodos de limite de impurezas: Proceder a analizar muestras individuales de la impureza (orgánicas, inorgánicas o solventes residuales), el producto (de pureza aceptable) y la mezcla de estos, como lo indica el método. Para métodos indicadores de estabilidad: En caso de contar con los productos de degradación, preparar muestras con placebo adicionado de éstos, el placebo adicionado de analito, el placebo adicionado de analito y de productos de degradación y analizar con el método. DETERMINACIONES, METODOLO~IA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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DE
MéTODOS
ANALíTICOS
Si no se cuenta con los posibles productos de degradación se pueden emplear, dependiendo de la naturaleza química del analito y si es posible, las siguientes condiciones para favorecer la inestabilidad del analito en la muestra:
1. Someter el analito, el placebo y la muestra en un horno a 70° - 120° C o a 20° C por debajo del punto de fusión del analito de 2 a 4 semanas. 2. Exponer el analito, placebo y muestra a luz UV, fluorescente y/o humedad relativa, por un tiempo apropiado. 3. Hacer soluciones del analito, ajustando el pH de 1 a 2 y/o de 10 a 12 y someterlas a 60° C - 80° C por un tiempo apropiado. 4: Para formas farmacéuticas líquidas o semisólidas, adicionar peróxido de hidrógeno para favorecer oxidación del analito.
Estos estudios no se deben de llevar a cabo para analitos que según la bibliografía, tengan propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las muestras a las condiciones antes mencionadas. El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a niveles de un 15 a 30%. En el caso de métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos que utilizan sistemas de medición volumétricos, la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada con los resultados de exactitud y linealidad del método, si el método cumple con los criterios de aceptación. Cuando haya duda en la demostración de la especificidad de un método analítico, se sugiere que sea investigada por otra metodología de soporte.
8.4.2. Criterios de Aceptación: La respuesta del método únicamente debe ser debida al analito.
DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
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VALIDACiÓN
DE
MéTODOS
ANAL[TICOS
8.5. Exactitud y Repetibilidad del Método.
8.5.1. Metodología.
A) Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico. Un analista debe preparar el placebo analítico con el tipo de componentes que generalmente están presentes en la muestra. A la cantidad de placebo analítico equivalente a una muestra analítica por sextuplicado,adicionarle la cantidad de analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) correspondiente al 100% de éste en la muestra. Los placebos adicionados deben ser analizados por un mismo analista bajo las mismas condiciones, utilizando como referencia, la sustancia empleada en la adición al placebo analítico. Determinar la cantidad recuperada del analito. ~.'
B) No se conocen los componentes de la muestra. Un analista debe analizar la muestra con el método, para determinar el contenido del analito. El mismo analista debe preparar por lo menos 6 muestras adicionadas del analito, por ejemplo utilizando la mitad de la muestra analítica que originalmente requiere el método y adicionar el analito (puede. ser una sustancia de referencia secundaria) hasta completar lo que represente el 100% de éste en la muestra. Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra. Determinar la cantidad recuperada del analito. Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adición puede ser llevada a cabo en alguna etapa del
método.Be recomienda que la adición se lleve a cabo en las primeras etapas, para poder asegurar que las etapas posteriores no den lugar a resultados incorrectos. Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adición se lleve a cabo antes de extraer, ya que si existiera algún problema con la extracción o con la filtración, y el analito se adiciona al placebo analítico o la muestra hasta antes de diluir, puede dar lugar a resultados incorrectos. Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo analítico o muestra
DETERMINACIONES, METODOLOG[A y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
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VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
adicionada, al obtener el cociente de la 'cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje. Calcular el promedio aritmético (y), la desviación estándar {S), el coeficiente de variación (CV) y el intervalo de confianza para la media poblacional 1C(1l) del porcentaje de recobro. 8.5.2. Criterios de Aceptación: El 1C(1l ) debe incluir el 100% o que el promedio aritmético del % de recobro se incluya en el intervalo: 98 - 102% si el método es cromatográfico,
98 - 102% si el método es volumétrico. 97 - 103% si el método es químico o espectrofotométrico, 95 - 105% si el método es microbiológico, El CV del porcentaje de recobro: no debe ser mayor de 2% si el método es cromatográfico. no mayor de 2% si el método es volumétrico, no mayor de 3% si es químico o espectrofotométrico, no mayor del 5% si es microbiológico, no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 5.
8.6. Linealidad del Método: 8.6.1. Metodolopía. A) Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico. DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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Un analista debe preparar el placebo analítico con el tipo de componentes que generalmente están presentes en la muestra. A la cantidad de placebo analítico equivalente a una muestra analítica por triplicado, adicionarle la cantidad de analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) correspondiente al 100% de éste en la muestra. Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y preparar el placebo adicionado al menos por triplicado a cada nivel, manteniendo constante la cantidad de placebo analitico en los tres niveles. Los placebos adicionados deben ser analizados por un mismo analista bajo las mismas condiciones, utilizando como referencia, la sustancia empleada en la adición al placebo analítico. Determinar la cantidad recuperada del analito. B) No se conocen los componentes de la muestra. Un analista debe analizar la muestra con el método, para determinar el contenido del analito. El mismo analista debe preparar por lo menos 3 muestras adicionadas, por ejemplo utilizando la mitad de la muestra analítica que originalmente requiere el método y adicionar el analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) hasta completar lo que represente el 100% de éste en la muestra. Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito (intervalo) y preparar la muestra adicionada al menos por triplicado a cada nivel, manteniendo constante la cantidad de muestra en los tres niveles. Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adición de la muestra. Determinar la cantidad recuperada del analito. Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adición puede ser llevada a cabo en alguna etapa del método. Se recomienda que la adición se lleve a cabo en las primeras etapas del método, para poder asegurar que las etapas posteriores, no den lugar a resultados incorrectos. Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adición se lleve a cabo antes de extraer; ya que si existiera algún problema con la extracción o con la filtración, y el analito se adiciona a la muestra o placebo analítico hasta antes de diluir, puede dar lugar a resultados incorrectos. El intervalo de la concentración del analito adicionado, depende del propósito del método y debe incluir la especificación. La siguiente tabla supiere intervalos para el estudio de linealidad, en la cual la especificación se maneja como porcentaje; como por ejemplo el 100% puede representar 100 mgl g de muestra, 10 ppm, 5 mg/mL, etc.
DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
PROPOSITO
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
ESPECIFICACION
CONTENIDO I POTENCIA I
LíMITE INFERIOR (L¡),
VALORACiÓN
LíMITE SUPERIOR (L s )
INTERVALO MINIMO L-10% a Ls +10% I
EJEMPLO VALORACiÓN
90% - 110%
80% a 120% Por lo tanto los niveles podrían ser 80%, 100% Y 120%
UNIFORMIDAD DE DOSIS
75% -125%
60% a 140% Por lo tanto los niveles podrían ser 60%, 100% Y 140%
Q'= 75%
40% a 130%
En el caso conservador, de llegar a tercera etapa, ninguna unidad es menor a Q - 25%
Por lo tanto los niveles podrían ser 40%, 100% Y 130%
. LíMITE SUPERIOR (Ls)
Ls -20% a Ls +20%
DISOLUCiÓN
CONTENIDO I VALORACiÓN PARA PRUEBAS DE IMPUREZAS EJEMPLO Sustancias relacionadas.
80% a 120% No debe contener más de 100%. Por lo tanto los niveles podrían ser 80%, 100% Y 120%
Reportar la relación cantidad adicionada vs cantidad recuperada. Utilizando el método de estimación por mínimos cuadrados, calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (b.), el coeficiente de determinación (r2),el intervalo de confianza para la pendiente (1c(f31», el intervalo de confianza para la ordenda al origen (1C(f3o» y el coeficiente de variación de regresión (CVyIJ Calcular el porcentaje de recobro de cada placebo adicionado o muestra adicionada, al obtener el cociente de la 'cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje. Calcular el promedio aritmético (Y'), la desviación estándar (S), el coeficiente de variación (CV) y el intervalo de confianza para la media poblacional IC(Il) del porcentaje de recobro. DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8.6.2. Criterios de Aceptación: 8.6.2.1. Cantidad adicionada vs cantidad recuperada:
EIIC( (31 ) debe incluir la unidad. El
1C(f3) debe incluir el cero.
El CV yxI del porcentaje de recobro, no debe ser mayor de 2% si el método es cromatográfico, no mayor de 2% si el método es volumétrico, no mayor de 3% si es químico o espectrofotométrico, no mayor del 5% si es microbiológico no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra.
8.6.2.2. Porcentaje de recobro: El IC(/-!) debe incluir el 100% o que el promedio aritmético del % de recobro se incluya en el intervalo: 98 - 102% si el método es cromatográfico, 98 - 102% si el método es volumétrico, 97 - 103% si el método es químico o espectrofotométrico, 95 - 105% si el método es microbiológico. El CV del porcentaje de recobro: no debe ser mayor de 2% si el método es cromafográfico, no mayor de 2% si el método es volumétrico, no mayor de 3% si es químico o espectrofotométrico no mayor del 5% si es microbiológico DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo.6. Es conveniente trazar la gráfica de la cantidad adicionada (x) vs la cantidad recuperada (y), e incluir la ecuación, su línea y el coeficiente de determinación.
8.7. Precisión del Método (Precisión Intermedia o Tolerancia interdía / analista).
8.7.1. Metodología: Analizar por triplicado una muestra homogénea del producto que tenga un nivel cercano o igual al 100 % (en el caso de contenidol potencial valoración) o una muestra homogénea cuyo contenido esté incluido en el intervalo lineal de concentración de linealidad de método (para el caso de impurezas), en dos días diferentes y por dos analistas diferentes. Utilizar de preferencia la misma sustancia de referencia y los mismos instrumentos y/o equipos. Reportar el contenido I potencia / valoración del analito de todas las muestras. Calcular la media aritmética (y), desviación estándar (8) y coeficiente de variación (CV) del contenido I potencia I valoración, empleando todos los resultados obtenidos.
8.7.2. Criterios de Aceptación: CV-< 2% para métodos cromatográficos y volumétricos. CV-< 3% para métodos químicos o espectrofotométricos. CV -< 5% para métodos biológicos. no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Valores superiores deben ser justificados. DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN.
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 7. Los resultados pueden ser analizados, utilizando otros métodos estadísticos apropiados, que permitan sustentar que la precisión del método es aceptable. Puede ser utilizado un modelo estadístico lineal de diseño experimental considerando como factores al analista y al día anidado en el analista o considerando al analista como un factor jerárquico respecto al día. Este modelo permite investigar el efecto del analista y del día, así como estimar la variabilidad entre analistas (reproducibilidad interanalistas), la variabilidad entre días (reproducibilidad interdías) y la variabilidad del método analítico (repetibilidad). Este análisis es de utilidad cuando se tiene interés en determinar el grado de tolerancia del método a estas fuentes de variación.
8.8. Estabilidad Analítica de la Muestra. 8.8.1. Metodología: El analista debe establecer la etapa de análisis en la cual se desea evaluar la estabilidad, además de determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras dependientes) o no (muestras independientes) y. las condiciones de almacenaje. Para determinar la estabilidad analítica para muestras dependientes, el analista debe procesar hasta la etapa preestablecida por lo menos por t1iplicado una muestra homogénea. Fraccionar cada una de las preparaciones de acuerdo a las condiciones de almacenaje de interés. Terminar el análisis de una de las fracciones de cada preparación (contenido I potencia I valoración inicial). Proseguir el análisis de cada una de las fracciones al término de cada condición de almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el método contempla el uso de una solución de referencia. Reportar el contenido I potencia I valoración de cada fracción. Para determinar la estabilidad analítica para muestras independientes, a partir de una muestra homogénea, el analista debe analizar por t1iplicado (contenido I potencia I valoración inicial). Simultáneamente y de la misma muestra, procesar el número de muestras necesarias para cada condición de almacenaje hasta la etapa preestablecida (preparaciones) al menos por triplicado. Proseguir el análisis de cada una de las preparaciones al término de cada condición de almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada; si el método contempla el úso de una solución de referencia. Reportar el contenido I potencia I valoración de cada preparación. DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUíA
DE
VALIDACiÓN
.
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Calcular la media aritmética del análisis inicial (Yo) y de cada condición
-
de almacenaje (y¡). Calcular la diferencia absoluta de la media aritmética
I 1).
de cada condición de almacenaje respecto del análisis inicial ( di
8.8.2. Criterios de Aceptación:
Idi I~ 2% para métodos cromatográficos y volumétricos. Idi I~ 3% para métodos químicos o espectrofotométricos. Idi I~ 5% para métodos biológicos. no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 8. Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos apropiados. Uno de ellos es la obtención de intervalos de confianza que describen la diferencia de los resultados de una condición específica respecto de los resultados iniciales, basados en la distribución t de Dunnett. 8.9. Límite de Detección. Para la estimación del límite de detección se sugieren los siguientes procedimientos: 8.9.1. LD con base en señal de Ruido.
8.9.1.1. Metodología: Este procedimiento aplica a métodos que utilizan instrumentos para medir la respuesta analítica y que presentan una señal de ruido basal. Un analista debe determinar la respuesta de muestras blanco (reactivos, placebos analíticos, etc., según proceda) y la respuesta de muestras analíticas (anal]to, placebos adicionados, según proceda) en un intervalo de concentraciones del ana lito que incluya la especificación de la prueba de impurezas límite. Determinar aquella cantidad del analito que genere una respuesta con respecto a la muestra blanco en una proporción de por lo menos de 3 a 1, lo que corresponde a la DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
32
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
concentración asociada al límite de detección. Este procedimiento se utiliza para verificar el límite de detección estimado por otros procedimientos.
8.9.1.2. Criterio de Aceptación: El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas límite. 8.9.2. LD con base en curva de calibración y desviación estándar de los blancos.
8.9.2.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un. analista debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (anal ita, placebos adicionados, etc.; según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas límite; ya sea' por dilución o por pesada independiente del analito. Simultáneamente, preparar por lo menos 5 blancos (reactivos, placebos analíticos, etc.; según proceda). Medir las respuestas analíticas. Para la curva de calibración, sin incluir los blancos, calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r2 ) y el intervalo de confianza para la pendiente (IC({31»' Para los blancos, calcular la desviación estándar (Sb)de los blancos. Calcular el límite de detección con la siguiente ecuación:
LO=
3.3 X Sb b1
El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido.
8.9.2.2. Criterio de Aceptación:
1C({31)' no debe incluir el cero. El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas límite. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado.
DETERMINACIONES, METODOLOGiA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
33
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8.9.3. LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de regresión. 8.9.3.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un analista debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (anal ita, placebos adicionados, etc.; según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas límite; ya sea por dilución o por pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r 2 ) , la desviación estándar de regresión (SY/X> y el intervalo de confianza para la pendiente (1C(¡3). Calcular el límite dedetección con la siguiente ecuación.
LD =
3.3 X Sy/x b1
El valor estimado LO debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido.
8.9.3.2. Criterio de Aceptación: r2 ~ 0.98
1C(¡31)' no debe incluir el cero. El LO debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas límite. Cualquier otro criterio ·de aceptación, debe ser justificado.
¡ 8.9.4. LD con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la ordenada al origen. 8.9.4.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un analista debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos adicionados, etc.; según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de la prueba de impurezas límite; ya sea por dilución o por pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r'). la desviación estándar ele la ordenada al origen (Sb. ) y el intervalo de confianza para la pendiente (IC(¡31». Calcular el límite de detección con la siguiente ecuación: DETERMINACIONES. METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
El valor estimado LD debe ser verificado utilizando el procedimiento de la señal de ruido.
8.9.4.2. Criterio de Aceptación:
r2 ~ 0.98 1C({31)' no debe incluir el cero. El LD debe ser menor a la especificación de la prueba de impurezas límite. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, considerando los distintos procedimientos, se describen en el Anexo 9.
8.10. Límite de Cuantificación. Para la estimación del límite de cuantificación se sugieren los siguientes procedimientos:
8.10.1. Señal de Ruido. 8.10.1.1. Metodología: Este procedimiento aplica a métodos que utilizan un instrumento para medir la respuesta analítica y que presentan una señal de ruido basal. Un analista debe determinar la señal de muestras blanco (reactivos, placebos, etc., según proceda) y la señal analítica de muestras (analito, placebos adicionados, según proceda) a concentraciones conocidas del analito, inferiores o que incluya la especiñcación del contenido I valoración de la prueba de impurezas. Determinar aquella cantidad del analito cuya señal sea similar o mayor a la de la muestra blanco en una proporción de 10 a 1, lo que corresponde a la cantidad asociada al límite de cuantificación. Es necesario verificar que dicha cantidad corresponda al límite de cuantificación, evaluando la exactitud y repetibilidad del valor estimado. .~
DETERMINACIONES,
~ODOLOGIA y
CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
35
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
METODOS
ANALíTICOS
8.10.1.2. Criterio de Aceptación: El LC debe ser menor a la especificación del contenido / valoración de la prueba de impurezas 8.10.2. LC con base en la curva de calibración y la desviación estándar de los blancos.
8.10.2.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un analista debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos adicionados, etc., según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de contenido / valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o por pesada independiente del analito. Simultáneamente, preparar por lo menos 5 blancos (reactivos, placebos, etc., según proceda). Medir las respuestas analíticas. Calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r2) y el intervalo de confianza para la pendiente 1c(f31) . Para los blancos, calcular la desviación estándar de los blancos. Calcular el límite de cuantificación con la siguiente ecuación:
LC=
1Dx Sb b1
Evaluar la exactitud y repetibilidad del valor estimado del límite de cuantificación.
8.10.2.2. Criterio de Aceptación:
IC(f31), no debe incluir el cero.' El LC debe ser menor a la especificación del contenido I valoración de la prueba de impurezas Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. 8.10.3. LC con base en la curva de calibración basado en la desviación estándar dereqreslón,
8.10.3.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un analista debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos DETERMINACIONES, METODOLOGiA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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ANALíTICOS
adicionados. etc.• según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de contenido I valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o por pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r2) , la desviación estándar de regresión (Sy,) y el intervalo de confianza para la pendiente (1C«(31))' Calcular el límite de cuantificación con la siguiente ecuación: Evaluar la exactitud y repetibilidad del valor estimado del límite de cuantificación. 8.10.3;2. Criterio de Aceptación:
r2 ;:::" O.98 1C«(31)' no debe incluir el cero. El LC debe ser menor a la especificación del contenido I valoración de la prueba de impurezas. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. 8.10.4. Le con base en la curva de calibración y la desviación estándar de la ordenada al origen. 8.10.4.1. Metodología: Este procedimiento aplica tanto a métodos instrumentales como a no instrumentales. Un analísta debe preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de interés (analito, placebos adicionados, etc., según proceda) a valores menores o que incluya la especificación de contenido I valoración de la prueba de impurezas, ya sea por dilución o por pesada independiente del analito. Medir las respuestas analíticas. Calcular el valor de la pendiente (b.), el coeficiente de determinación (r2 ) , la desviación estándar de la ordenada al origen
(Sbo ) y el intervalo de confianza para la pendiente (IC«(31))' Calcular el límite de cuantificación con la siguiente ecuación:
Le =
3.3 x Sbo b1
Evaluar la exactitud y repetibilidad del valor estimado del límite de cuantificación.
DETERMINACIONES, METODOLOGíA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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MÉTODOS
ANALíTICOS
8.10.4.2. Criterio de Aceptación:
r2 ~ 0.98 IC(,81)' no debe incluir el cero. El LC debe ser menor a la especificación del contenido / valoración de la prueba de impurezas. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, considerando los distintos procedimientos, se describen en el Anexo 10.
8.11. Robustez. Metodología: Se deben establecer aquellos factores instrumentales (temperatura de la columna, presión en la columna, velocidad de flujo, etc.) y/o factores no instrumentales (pH de fases, volúmenes de solventes orgánicos para una extracción, etc.), relacionados al propio método, que se considere críticos. En cada condición de operación distinta; asi como a la condición normal, analizar la misma muestra por lo menos por triplicado. Reportar el contenido / potencia / valoración del analito para las muestras de condición normal de operación y para la(s) muestra(s) de las otra(s) condicion(es) de operación, expresada(s) como %. Calcular la media aritmética de la condición normal de operación (Yo) y de cada condición de operación diferente a la condición normal ( Yi ). Calcular la diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición respecto a la condición normal (\ di [).
8.11.1. Criterios de Aceptación: \di I ~ 2% para métodos cromatográficos y volumétricos. I di 1 ~
3% para métodos químicos yespectrofotométricos.
Idi I ~ 5% para métodos biológicos. no mayor a una magnitud preestablecida. acorde a la especificación del analito en la muestra. DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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ANALíTICOS
Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 11. Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos apropiados. Uno de ellos es la obtención de intervalos de confianza que describen la diferencia de los resultados de una condición específica respecto a la condición normal de operación, basados en la distribución t de Student (para 2 condiciones) o t de Dunnett (para 3 o más condiciones), incluyendo la condición normal. 8.12. Tolerancia Metodología: Se deben establecer aquellos factores ajenos al método como diferentes equipos, lotes de reactivos, columnas, etc., que se puedan presentar al reproducir el método en otras condiciones de uso. Fijar por lo menos 2 condiciones de uso y analizar una misma muestra por lo menos por triplicado a cada condición. Reportar el contenido I potencia I valoración del analito de todas las muestras. Calcular la media aritmética ( ~ ). desviación estándar (S) y coeficiente de variación (CV) del contenido I potencia I valoración.
8.12.1. Criterio de Aceptación: CV ~ 2% para métodos cromatográficos y volumétricos. CV
~
3% para métodos químicos yespectrofotométricos.
CV ~ 5% para métodos biológicos. no mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la muestra. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 12. Los resultados pueden ser analizados utilizando otros métodos estadísticos apropiados. Uno de ellos es aplicar un análisis de la varianza DETERMINACIONES, METODOLOGIA y CRITERIOS DE ACEPTACiÓN
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con un criterio de clasificación para determinar si al menos una de las condiciones de uso es diferente. En caso de concluir que al menos una de las condiciones de uso es diferente: puede emplearse una prueba estadística de comparaciones múltiples para identificar aquellas condiciones que dan lugar a resultados diferentes.
S.SUSTANCIAS DE REFERENCIA
Las sustancias de referencia son importantes en la validación de métodos analíticos, ya que constituyen un componente propio del método y una herramienta en la evaluación de los parámetros de desempeño, lo que permite establecer la confiabilidad de la metodología. c.'i
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Para la selección y adquisición de las sustancias de referencia se debe contar con procedimientos acordes para su manejo y aplicación correctos dentro del laboratorio que va a llevar a cabo las actividades de validación de métodos. Así mismo, se debe contar con registros del uso y con la documentación que avale una buena práctica en el manejo de dichas sustancias.
9.1. Manejo. Para cumplir su propósito, cada sustancia de referencia debe almacenarse, manejarse y utilizarse de acuerdo con las especificaciones correspondientes. Generalmente deben almacenarse en su contenedor original, alejadas del calor y protegidas dela luz. Deben evitarse lugares húmedos. Cualquier indicación sobre condiciones especiales de almacenamiento deben incluirse en el marbete y (o) certificado analítico. Toda sustancia de referencia debe contar con su identificación y registro. La información mínima para identificar las sustancias de referencia es: Para sustancias de referencia primarias: a) Nombre de la sustancia de referencia b) Cantidad
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c) Lote del producto d) Clave (para uso interno en el laboratorio) e) Fecha de adquisición
f) Pureza (potencia) g) Fecha de caducidad h) Riesgo potencial de manejo i) Indicaciones especiales. Para sustancias de referencia secundarias:
.
a) Nombre de la sustancia de referencia
~
b) Cantidad certificada c) Lote interno d) Clave e) Fecha de certificación
f) Potencia en relación con la sustancia de referencia La información mínima de un registro de las sustancias de referencia es: a) Nombre b) Lote e) Clave de identificación interna d) Procedencia (USP, BP, COSUFAR, etc.) e) Fecha de adquisición
f) Fecha de empleo g) Para que se emplea (uso)
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h) Cantidad empleada i) Cantidad remanente
j) Analista que la utiliza k) Caducidad Para las sustancias de referencia secundaria, es conveniente contar además con registros adicionales como: a) Nombre b) Lote
e) Cálculos para obtener la potencia de la sustancia analizada (por ejemplo si se emplea para obtener una sustancia de referencia secundaria) d) Gráficas (espectros, cromatogramas, etc.) e) Certificado de análisis del material. En la validación de los métodos analíticos, estos registros son criticas. Se debe contar con lineamientos que aseguren la no utilización de sustancias de referencia caducas.
9.2. Tratamiento.
Cualquier tratamiento previo al que deba someterse la sustancia de referencia lo debe contemplar la propia metodología, o en su caso, debe especificarse en su marbete. Si la sustancia de referencia debe secarse antes de ser utilizada, es necesario seguir las instrucciones que aparecen en su etiqueta o certificado de análisis. La operación de secado no se debe llevar a cabo en el envase original; es conveniente transferir una cantidad suficiente a otro envase, para llevar a cabo dicha operación. Si queda un excedente, se debe desechar.
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9.3. Procedencia. A continuación se mencionan algunos centros especializados que proveen sustancias de referencia: • Btitish Pharmacopoeia (BP) (Farmacopea Británica). European Pharmacopoeia (EP) (Farmacopea Europea). La SP ofrece sustancias de referencia, las cuales están disponibles en la Agencia de Laboratorios de Control de Medicamentos (Inglaterra). • European Pharmacopoeia Chemical Reference Substances, EPCRS (sustancias químicas de referencia de la Farmacopea Europea). Estos materiales se obtienen por medio de la Comisión Secretarial de la Farmacopea Europea, Consejo de Europa . • Comité de Sustancias Farmacéuticas de Referencia (COSUFAR). • Organización Mundial de la Salud (OMS). La OMS clasifica las sustancias de referencia en: Sustancias químicas internacionales de referencia, que son las establecidas por la OMS. Sustancias nacionales de referencia o sustancias regionales de referencia, las cuales se producen en cada país y se certifican mediante las sustancias químicas internacionales de referencia. La Organización Mundial de la Salud, agencia de las Naciones Unidas, mantiene un programa para proveer los estándares biológicos internacionales y las sustancias químicas de referencia. El programa tiene relación con las sustancias de referencia para antibióticos, productos biológicos y agentes quimioterapéuticos. Como regla general, un estándar internacional para un material de origen vegetal se discontinúa una vez que la sustancia responsable de la actividad se ha aislado, identificado y preparado, de tal forma que pueda ser completamente caracterizada por medios físicos y químicos. • Secretaría de Salud (SSA). • United States Pharmacopeia (USP) (Farmacopea de Estados Unidos).
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• O. REVRLIDRCIÓN
Se deben establecer y justificar criterios apropiados para la revalidación de métodos analíticos, así como mantener un control de cambios. Cualquier cambio crítico a un método analítico, da lugar a uno nuevo y por lo tanto requiere de una validación como tal. Como un ejemplo, en la siguiente tabla se establecen cambios en el método, su impacto y el parámetro de desempeño a revalidar.
1
CAMBIO
PARAMETROA REVALIDAR
IMPACTA
DISPOSITIVO DE MEDICION DEL INSTRUMENTO DE MEDICION
VARIACION EN SISTEMA DE MEDICION
CONCENTRACION DE LA SOLUCION DE REFERENCIA
EXACTITUD DEL METODO
LINEALIDAD DEL SISTEMA y EXACTITUD DEL METODO
FORMULACION DEL
EXACTITUD DEL METODO
EXACTITUD Y
PRECISION DEL SISTEMA ADECUABILlDAD DEL SISTEMA
REPETIBILlDAD DEL
PRODUCTO
METODO LINEALIDAD DEL METODO ESPECIFICIDAD
r r,
EQUIPOS
VARIACION DEL METODO
TOLERANCIA
PROVEEDOR DE COLUMNAS
VARIACION DEL METODO
TOLERANCIA
COMPRRRCION DE 2
METODOS RNRLITICOS
Cuando se tiene interés en comparar 2 métodos analíticos para aplicaciones de contenido I potencia I valoración, se pueden emplear los siguientes procedimientos: REVALIDACiÓN
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• Estudio de Comparación de Parámetros de Desempeño. Este procedimiento se utiliza cuando los 2 métodos analíticos han sido validados y se tiene interés en comparar sus parámetros de desempeño, como puede ser el comparar un método volumétrico contra un método por cromatografía de líquidos de alta resolución . • Estudio de correlación. Este procedimiento se utiliza cuando se comparan dos métodos cuyos resultados se expresan en unidades diferentes, tal como, actividad biológica vs concentración.
11.1. Estudio de Comparación de Parámetros de Desempeño: En función de la aplicación analítica de los métodos analíticos, la siguiente tabla indica cuales son los parámetros de desempeño a estudiar.
PARÁMETROS DE DESEMPEÑO A COMPARAR DE
2 MÉTODOS ANALiTICOS
CONTENIDO I POTENCIA I
CAMBIO
PARAMETRO A REVALIDAR
VALORACION
ESPECIFICIDAD PARAMETROS DE
EXACTITUD Y REPETIBILlDAD
DESEMPEÑO LINEALIDAD DEL METODO PRECISION DEL METODO O PRECISiÓN INTERMEDIA
A continuación se listan los parámetros analíticos mínimos a comparar, así como los criterios para establecer la igualdad de dichos parámetros.
11.1.1. Especificidad. Este parámetro debe cumplir para cada método analítico; ya sea demostrando su especificidad o exactitud.
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11.1.2. Repetibilidad en Exactitud.
11.1.2.1. Metodología: De los datos de exactitud y repetibilidad utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular la varianza (8 2 ) del porcentaje de recobro de cada método.
11.1.2.2. Criterios de Aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Lasfórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describenen elAnexo 13. 11.1.3. Repetibilidad en Linealidad del Método.
11.1.3.1. Metodología: De los datos de linealidad del método, utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular la varianza (8 2) del porcentaje de recobro de cada método.
11.1.3.2. Criterios de Aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas y el procedimiento de cálculo con un ejemplo, se describen en el Anexo 14. 11.1.4. Exactitud.
11.1.4.1. Metodología: De los datos de exactitud y repetibilidad, utilizar la información del porcentaje de recobro. Calcular la media aritmética (y) y varianza (8 2) del porcentaje de recobro de cada método.
11.1.4.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la diferencia de las 2 medias poblacionales del porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. El análisis estadístico de los resultados, presenta 2 situaciones: a) Los métodos tienen la misma repetibilidad (varianzas iguales)
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b) Los métodos tienen diferente repetibilidad (varianzas diferentes) por lo tanto para llevar a cabo el análisis es necesario realizar el estudio de comparación de repetibilidad de ambos métodos. (11.1 .2 ) Las fórmulas y el procedimiento de cálculos con un ejemplo para ambas situaciones, se describen en el Anexo 15. 11~ 1.5.
Linealidad del Método.
11.1.5.1. Metodología: De los datos de linealidad del método, utilizar la información de la cantidad adicionada y cantidad recuperada de cada método, así como el porcentaje de recobro de cada método. Para cada método, calcular la pendiente (b, y b,.> y ordenada al origen (b o1 y b o, ) de Ia relación cantidad adicionada -cantidad recuperada, así como la media aritmética (Y1 Y Y2) Y varianza (S21 y S22) del porcentaje de recobro.
11.1.5.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la diferencia de las pendiente de cantidad adicionadacantidad recuperada debe incluir el valor de cero. El intervalo de confianza para la diferencia de las ordenadas al origen de cantidad adicionada-cantidad recuperada debe incluir el valor de cero. El intervalo de confianza para la diferencia de las medias poblacionales del porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. El análisis estadístico de los resultados del porcentaje de recobro, presenta 2 situaciones: a) Los métodos tienen la misma repetibilidad (varianzas iguales) b) Los métodos tienen diferente repetibilidad (varianzas diferentes) por lo tanto para llevar a cabo el análisis es necesario realizar el estudio de comparación de repetibilidad de ambos métodos. (11.1.3) Las fórmulas y el procedimiento de cálculos con un ejemplo para la situación de
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igual repetibilidad, se describen en el Anexo 16. Para el caso de diferente repetibilidad, con base en el porcentaje de recobro se describe en el anexo 15.
11.1.6. Precisión del Método. 11.1.6.1. Metodología: De los datos de precisión del método, utilizar la información del contenido / potencia / valoración del analito de cada método. Calcular las varianzas. (S21 y S22).
11.1.6.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la razón de varianzas, debe incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo,se describen en el Anexo 17.
11.2. Estudio de Correlación. Estos estudios se aplican a métodos de contenido / valoración / potencia y los parámetros a evaluar en este tipo de estudio son: * ProPorcionalidad. Es importante establecer que estos estudios no necesariamente
establecen equivalencia de resultados, sino proporcionalidad; ya que en muchas ocasiones la respuesta analítica es diferente. * Precisión. Es deseable que el método no oficial tenga una precisión igual o
mejor que el método oficial, o que su precisión sea aceptable para la aplicación analítica deseada. Inicialmente se debe establecer el método de referencia y el método a comparar
11.2.1. Proporcionalidad:
A. Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico.
11.2.1.1. Metodología: Un analista debe preparar una cantidad suficiente de placebo analítico con el tipo de componentes que comúnmente están presentes en la muestra, de tal manera que pueda ser analizado por ambos métodos en tres diferentes nivele del analito, que incluya la especiñcación. C o
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Del placebo analítico preparado tomar una cantidad suficiente para adicionarle analito al nivel inferior. Fraccionar en tres muestras y analizar cada muestra con ambos métodos bajo las mismas condiciones analíticas de cada método, para determinar el contenido I valoración I potencia. Es importante que cada muestra
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este identificada. Repetir este procedimiento con el nivel del 100% Y superior.
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Reportar la relación contenido I valoración I potencia de cada método en cada
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muestra del método a comparar (y) - método de referencia (x). Calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (b.), el coeficiente de determinación (r2 ) , el intervalo de confianza para la pendiente (1c(f31) ) , y el coeficiente de variación de regresión (CVy,.). B. No se conocen los componentes de la muestra.
11.2.1.2. Metodología: El analista debe seleccionar por lo menos 9 muestras del producto, cuyo nivel de analito cumpla con la especificación. El analista debe fijar una etapa de los métodos analíticos, en los cuales transfiera una mayor o menor cantidad de la muestra con el objeto de poder variar el nivel del analito, como puede ser al pesar la muestra, al transferir un volumen. al efectuar una dilución, entre otras. Es conveniente que 3 muestras tengan un nivel bajo. 3 el nivel correspondiente al 100% de la especificación y 3 un nivel alto de analito. Las 9 muestras deben ser identificadas y analizadas por ambos método. bajo las mismas condiciones analíticas de cada método. Determinar el contenido I valoración
I potencia de cada muestra. Reportar la relación contenido I valoración I potencia del método a comparar (y) método de referencia (x). Calcular el valor de la pendiente (b.), la ordenada en el origen (be), el coeficiente de determinación (r2 ) , el intervalo de confianza para la pendiente (1c(f31)) , y el coeficiente de variación de regresión (CV y,.).
11.2.1.3. Criterios de aceptación: El 1C(f31) no debe incluir el cero.
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Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado.
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Las fórmulas. el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 18. 11.2.2. Precisión.
11.2.2.1. Metodología: Por lo menos 2 analistas. en por lo menos2 días, deben C o
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analizar por triplicado muestras independientes (pesadas o alícuotas) de un lote homogéneo de producto, cuyo nivel de analito esté incluido dentro de la especificación; tanto con el método de referencia como con el método a comparar. Reportar el contenido I potencia I valoración del analito de todas las muestras en %, para ambos métodos. 11.2.2.2. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza unilateral inferior, para la razón de varianzas del método a comparar respecto del método de referencia, no debe exceder el valor de 1. Cualquier otro criterio de aceptación, debe ser justificado. Las fórmulas, el procedimiento de cálculo y un ejemplo, se describen en el Anexo 19.
COMPARACiÓN
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ANALITICOS
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.2.DDCUMENTACláN
. Las actividades de la validación de un método analítico, deben ser sustentadas por los siguientes documentos. A. Protocolo. El contenido sugerido que debe tener un protocolo es: 1. Título. 2. Propósito u Objetivo. 3. Responsabilidades. 4. Plan de prueba. En éste, se deben describir los parámetros de desempeño que permitan verificar la aplicación analítica deseada. 5. Criterios de aceptación para cada parámetro. 6. Formatos de registro de resultados. B. Reporte, cuyo contenido mínimo debe ser: 1. Título. 2. Resultados. 3. Análisis de resultados. 4. Confrontación contra los criterios de aceptación. 5. Conclusión. Es crítico documentar los registros analíticos. La documentación debe estar ordenada y disponible, bajo la responsabilidad del área de calidad.
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ANALíTICOS
1 :a.CONCORDANCIA CON GUIAS INTERNACIONALES
Esta guía es equivalente a: Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures. ICH-Q2A, March 1995 Guideline on the Validation of Analytical Procedures; Methodology; Availability; Notice ICHQ2B. USP24. Validation of Compendial Methods. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods. CDER. November 1994, CMC 3
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VALIDACIÓN
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14.1. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 7a. Ed. México (2000).
14.2. Métodos Analíticos, Validación. Guías Generales de Validación de la DGCIS, SSA(1989).
14.3. Ley General de Salud (1997).
14.4. NMX-CC-1-1990 Sistemas de Calidad Vocabulario.
14.5. NMX-CC-2-1990 Sistemas de Calidad-Gestión de Calidad. Guía para la Selección, el Uso de Normas de Aseguramiento de Calidad.
14.6. Reglamento de Insumos para la Salud (1998).
14.7. NORMA Oficial Mexicana NOM-059-SSA1-1993, Buenas prácticas de fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la fabricación de medicamentos.
14.8. NOM- 177 SSA1 1998 "Que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable"
14.9. Guidance for Industry Bioanalytical methods Validation for Human Studies. December 1998 FDA.
14.10. Guideline for Industry: Text on Validation of Analytical Procedures.
ICH-Q2A, March 1995 B
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DE
VALIDACiÓN
DE
METODOS
ANALíTICOS
14.11. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods. CDER. November 1994, CMC 3
14.12. Guideline for Industry. Analytical Procedures and Methods Validation.
August 2000. FDA
14.13. Guideline for submiUing Samples and Analytical Data for Methods Validation. February 1987. FDA
14.14. ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation Analytical Procedures: Methodology. 6 Nov 1996.
14.15. ICH Guideline on the Validation of Analytical Procedures; Methodology; ICHQ2B, November 1996.
14.16. USP24. Validation of Compendial Methods.
14.17. NORMA Oficial Mexicana NOM-073-SSA1-1993, Estabilidad de medicamentos.
14.18. Diseño y Análisis de Experimentos, Montgomery D. C.. Grupo Editorial Iberoamérica. 38 Ed. México (1991).
BIBLIOGRAFIA
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ANALíTICOS
15. ANEXOS
CONTENIDO
NUMERO
1 2
MATRIZ DE EQUIVALENCIA DE MÉTODOS ANALíTICOS FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL SISTEMA
3 4
FÓRMULASY PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ADECUABILlDAD DEL SISTEMA
5
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA EXACTITUD Y
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA
REPETIBILlDAD DEL MÉTODO.
6 7
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE .CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO (PRECISiÓN INTERMEDIA).
8
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ESTABILIDAD ANALíTICA DE LA MUESTRA.
9 10 11 12
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LIMITE DE DETECCiÓN.
13
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARALíMITE DE CUANTIFICACiÓN. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ROBUSTEZ. FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA TOLERANCIA.
Y EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
14
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
15
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN EXACTITUD PARA. COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
16
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
17
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN PRECISiÓN DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTQDOS ANALlTICOS.
18
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PROPORCIONALIDAD DE MÉTODOS EN ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARACOMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
19
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO EN ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALlTICOS.
20 21 22
TABLA ESTADíSTICA DE LA DISTRIBUCiÓN t DE STUDENT. TABLAS ESTADISTICA DE LA DISTRIBUCiÓN F DE FISHER. COMENTARIOS RESPECTO A LOS CÁLCULOS Y REGLAS DE REDONDEO.
ANEXOS'
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GUíA
ANEXO 1.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
MATRIZ DE EQUIVALENCIA DE MÉTODOS ANAlÍTICOS.
EQUIVALENTE
PROPÓSITO
USO
CONTENIDO O POTENCIA
CUANTIFICA ALANALlTO
Métodos para producto a granel. Métodos para producto terminado. Métodos para materia prima. Métodos indicadores de estabilidad. Métodos para fármacos. Métodos para cuantificar el analito en la prueba de disolución. Valoración. Ensayos de cuantificación. Determinación del principio activo liberado. Sustancias relacionadas. Titulación. Uniformidad de dosis.
LíMITE
ESTABLECE LA PRESENCIA DEL ANALlTO A UN LíMITE
IDENTIFICACiÓN
IDENTIFICA AL ANALlTO
Métodos límite de impurezas. Métodos límite de residuos. Métodos para determinar el nivel de limpieza. Prueba límite. Sustancias relacionadas. Ensayo de identidad.
.
-
.di' GUiA
ANEXO 2.
DE
VALIDACiÓN
DE
METODOS
ANALITICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL SISTEMA A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
_ LY
y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(L l)-(L y)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
cv = y~*lOO n = número de mediciones. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: PROPIEDAD MEDIDA (ABSORBANCIA) .DE LA SOLUCiÓN DE REFERENCIA (y) 1.0520 1.0462 1.0566 1.0568 1.0554 1.0498 2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n. ~y,= 1.0520 + 1.0462 ~y2
=
1.05202
+...+ 1.0498 = 6.3168
+ 1.0462 2 +...+ 1.04982 = 6.650417
n=6 3) Calcular y y S:
y = 6.3168 = 1.0528 6
s ==
2
6 x 6.650417 - 6.3168 == 0.004252 6x(6-1)
4) Calcular el CV:
cv
== 0.004252 x lOO == 0.4039% 1.0528 .
El CV no excede el 1.5%. ANEXOS'
57
GUiA
ANEXO 3.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ADECUABILlDAD DEL SISTEMA. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
-
¿y
y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
\
\
n(L/)-(2:y)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = ~*lOO y n = número de mediciones. Para la fórmulas de factor capacidad (K'), resolución (R), retención' relativa (Rr), factor de coleo (T) y número de platos teóricos (N), referirse a la FEUM 7a Edición. Páginas 229 a
231. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1) Tabular los resultados: RESPUESTAANALlTICA (ÁREA DE PICO) DE LAS INYECCIONES DE LA SOLUCiÓN DE REFERENCIA.
Inyección Área (mAu*s)
1131.6
1 2 3 4
1134.1 1162.8 1132.9
5
1136.2
2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n. ~y =1131.6 + 1134.1+...+ 1136.2 =5697.6 ~y2 = 1131.62 + 1134.1 2 +...+ 1136.22 = 6493218.06 n=5 3) Calcular
y y S.
y= 5697.6 = 1139.52 5 2
s= 5x6493218.06-5697.6 = 5x(5-1)
13.124
.'''.,
4) Calcular el CV.
cv = 13.124 x100= 1.15% 1139.52 El CV no excede el 1.5%. ANEXOS'
58
..
.~
..... - ..
GUiA
ANEXO 4.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CALCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL SISTEMA.
A) FÓRMULAS PENDIENTE
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica).
ORDENADA AL ORIGEN
COEFicIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(Ixy)-(¿x)(Iy))2 r = (n(Ix 2)-(Ix)2)(n(Ii)-(Iy)2) 2
'0
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
/C(PI) = b¡± (O.975,n-2 Sbl
Sylx-t o.975,n-2
~'2>2
-b¡¿",-b,¿y n-2
=Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
8) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. Estos datos se utilizan únicamente para ejemplificar los cálculos. 1) Tabular los resultados: CONCENTRACiÓN - PROPIEDAD MEDlpA SOLUCiÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9
x (ppm)
y (absorbancia)
80 80 80 100 100 100 120 120 120
0.5194 0.5172 0.5147 0.7800 0.7846 0.8063 1.5917 1.5844 1.5837
GUiA
DE
2) Calcular LX,
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
LY, LX2 , L y2 , Lxy Y determinar n:
LX = 80 + 80 + ... + 120 = 900 LY = 0.5194 + 0.5172 + + 1.5837 = 8.682 L x2 = 802 + 80 2 + + 1202 = 92400.00 'L y2 = 0.51942 + 0.51722 + ... + 1.5837 2 = 10.228243 LXY 80*0.5194 + 80·0.5172 + ... + 120*1.5837 932.37 oo.
oo.
=
=
n=9 3) Calcular b., bo y r2.
b ::: 9 x 932.37 - 900 x 8.682 = 0.026738
9 x 92400- 9002
I
b = 8.682-0.026738x900 = -1.709083 o 9 r2 =
(9 x 932.37 -900x8.682)2 =0.925925 2) (9 x 92400 - 900 2) x (9 x 10.228243 - 8.682
El valor es menor de 0.98 4) Calcular Sytx y
Sbl
10.228243-0.026738x932.37 -(-1.709083)x8.682 = 0.140031 9.,...2
S bl = 0.140031
1 = 0.002858 2 92400- 900 9
5) Determinar en el Anexo 20 to.975,n-2 y calcular 1C({3,), /0.975,7 =
2.365
JCCPl) = 0.026738 ± 2.365 x 0.002858 = 0.019979,0.033496 El intervalo no incluye el cero. GRÁFICA X vs Y 2.0000 , - - - 1.5000
---,
y = 0.0267x - 1.7091 2
r ~
o
=0.9259
1.0000 0.5000 0.0000 +--~--.,.---~--..,__-_..,..--..,__-----l 8060 70 90 100 110 130 120
x
ANEXOS'
60
GUiA
ANEXOS.
, 1
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA EXACTITUD Y REPETIBILlDAD DEL MÉTODO A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
_ LY
y=-
n
DESVIACION ESTÁNDAR:
n(Ly 2)-(Ly)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN: S
CV = _*100 Y INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA MEDIA POBLACIONAL:
-
Je(p) = y± [0.975,1l-1
tO.975.n-1
n
S
.¡;;
Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
=número de recobros.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA- CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO PARA UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO.
PLACEBO ANALlTICO ADICIONADO 1 2 3 4 5 6
CANTIDAD ADICIONADA (mg) 50.00 50.10 50.00 49.90 50.00 50~OO--
......
---
CANTIDAD RECUPERADA (mg)
%DE RECOBRO (y)
50.04 50.39 50.11 49.89 50.23
100.08 100.58 100.22 99.98 100.46 -- 99.86--
- --49~93--
-
----------------
y = Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada.
ANEXOS'
61
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
2) Calcular ¿Y. ¿y2 Y determinar n. ¿y = 100.08 + 100.58 + ¿y2
=100.082 + 100.58
2
o ••
+ 99.86
= 601.1788
+...+ 99.86 2 = 60236.3819
n=6
3) Calcular y Y S:
y= 601.1788 =100.1965 6
s=
6 x 60236.3 819 - 60 I.l788 6x(6-1)
2
= 0.2792
4) Calcular el CV:
cv =
0.2792 x l 00 100.1965
=0.28 %
El CV no es mayor de 2%.
5) Determinar en el Anexo 20
..
(o 9755 =
to.975.n-1 y calcular
IC(Il).
2.571
/C(.u) = IOO.1965±2.57Ix
0.2792
¡¿
==99.90,100.49
El intervalo incluye el valor de 100%.
ANEXOS'
62
ANALíTICOS
G u i
ANEXOG.
A
O E
V
A LID A CiÓ N
D E'
M
É T
o Do s
A
N A LiT I
e o s
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA LINEALIDAD DEL MÉTODO.
6.1 CANTIDAD ADICIONADA VS CANTIDAD RECUPERADA
A) FÓRMULAS PENDIENTE
n¿xy-¿X¿y l
"2" 2
b = nLJx -(LJ X )
n = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada). ORDENADA AL ORIGEN
¿y-bl¿x
b¿ = ='-----=n COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(L xy )-(¿ X )(2: y))2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
lC(PI)=b l
±IO.975,n-2 Sbl
t O.975,n-2 Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA ORDENADAAL ORIGEN lC(Po) = bo ±IO.975,n-2 SbO
_LX
x=--
n
COEFICIENTE DE VARIACiÓN DE REGRESiÓN.
S
CVy/x =~xl00
y ANEXOS'
63
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - CANTIDAD RECUPERADA (y) DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO
PLACEBO ANALíTICO ADICIONADO
1 2 3 4 5 6 7 8 9
x (mg/mL)
y(mg I mL)
1.860 1.860 1.860 2.479 2.479 2.479 3.099 3.099 3.099
1.857 1.885 1.861 2.482 2.485 2.491 3.126 3.115 3.122
j'
2) Calcular ~x, ~y, ~X2, ~y2. ~xy y determinar n:
=1.860 + 1.860 + oo. + 3.099 =22.314 =1.857 + 1.885 + ... + 3.122 =22.424 ~X2 = 1.860 2 + 1.860 2 + oo. + 3.099 2 =57.62653 ~ y2 =1.857 + 1.885 2 + oo. + 3.122 2 =58.22761 ~xy =1.860*1.857 + 1.860*1.885 + ... + 3.099*3.122 =57.9259 ~x
~Y
2
n=9 Calcular b., be y r2.
3)
b = 9x57.9259-22.314x22.424 = 1.01157 I 9x57.62653-22.3142 b = 22.424-1.01157x22.314 =-0.01647 o
2.
r =
9 (9x 57.9259-22.314 x 22.424)2 =0.99971 2 (9x57.62653- 22.314 2)x(9x 58.22761-22.424 )
El valor excede a 0.98
ANEXOS'
64
.~
,
GUíA
DE
4) Calcular Sy/x y
s
= yl x
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
s;
58.22761-1.01157x57.9259-(-0.01647)x22.424 =0.00989 9-2 1
= 0.00989
2 = 0.00652 57.62653- 22.314 9 5) Determinar en el Anexo 20 tO.975.n-2 y calcular 1C(/3,). Sbl
(0.975.7
= 2.365
[CC.8I) = 1.01157 ±2.365 xO.00652 = 0.99615, 1.02699 El intervalo incluye la unidad. 6) Calcular x y
ss,
x= 22.314 = 2.47933 9
1
= 0.00989 "9 +
SbO
2.47933 2 = 0.0165 223142 5762653 - - ' 9- .
7) Calcular lC(b o)'
[CCPo) = -0.01647 ± 2.365 xO.0165 = -0.05548,0.02254 El intervalo incluye el cero. 8) Calcular el CVy/ x :
y = 22.424 = 2.49156 9
CV y/x
= 0.00989 x 100= 0.397% 2.49156
El valor no excede el 2%.
YvsX 4.00 3.00
>-
2.00 y= 1.0116x - 0.0165 (2 = 0.9997
1.00 0.00 1.50
2.00
2.50
3.00
X
ANEXOS'
65
3.50
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
6.2 PORCENTAJE DE RECOBRO. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
- ¿y y=-
n
DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(¿/)-(¿y)2
s=
n(n -1)
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = ~*lOO y
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA MEDIA POBLACIONAL.
_
S
/C(¡.L) = y± t O.975,n- 1
f;¡
tO.975,n-1 Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. n = número de recobros. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA - CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO PLACEBO ANALiTICO ADICIONADO 1 2 3 4 5 6 7 8 9
RECUPERADA (mg I mL)
/
%DE
CANTIDAD ADICIONADA (mg I mL)
RECOBRO
1.857 1.885 1.861 2.482 2.485 2.491 3.126 3.115 3.122
99.84 101.34 100.05 100.12 100.24 100.48 100.87 100.52 100.74
1.860 1.860 1.860 2.479 2.479 2.479 3.099 3.099 3.099
(y)
y =Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada. 2) Calcular 1:y, 1:y2 y determinar n.
1:y =99.84 + 101.34 + + 100.74 =904.21339 1:y2 =99.84 2 + 101.34 2 + + 100.742 =90846.39831 n=9
ANEXOS'
66
GuiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
3) Calcular y y S: y
= 904.21339 = 100.46815 9
s=
9x90846.39831-904.21339 9x(9-1)
2
= 0.4673
4) Calcular el CV:
_ 0.4673 x100 =0.465% CV - 100.46815
I
El valor no excede el 2%. 5) Determinar en el Anexo 20 lo 975 8 =
IC(Jl)
t o.975 ,n- 1 y calcular 1C(J..l).
2.306
= 100.46815 ±2.306x
0.4673
J9 = 100.11,100.83
El intervalo no incluye el valor de 100 .
.\NE
::¡7
ANALíTICOS
GUiA
ANEXO 7.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO (PRECISiÓN INTERMEDIA). A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
_
LY n
y=DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(L/)-(Ly)2 n(n-l)
s=
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = ~*100 y n
=número de muestras de contenido I potencia I valoración.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: CONTENIDO DE ANALlTO EN mg I 9 PARA UN MÉTODO BIOLÓGICO
ANALISTA
1
«
o 2
2) Calcular Ly..,
1
2
49.85 48.70 50.04 53.43 53.12 54.12
52.53 51.78 51.80 51.86 52.44 52.30
Ly2 Y determinar n.
LY =49.85 + 48.70 + ... + 52.30 =621.97
Ly2 =49.85 2 + 48.70 2 +...+ 52.30 2 n
=12
=32264.7003
3) Calcular y y S:
y = 621.97 =51.83 12
s=
2
12x 32264.7003 - 621.97 = 1.5805 12x(l2-1)
4) Calcular el CV:
CV
= 1.5805 x l 00 = 3.05 51.83
El CV no excede el 5%. ANEXOS'
68
GUíA
ANEXOS.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ESTABILIDAD ANALíTICA DE LA MUESTRA.
A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA DEL ANÁLISIS INICIAL
- :2>0
.Yo=-170 no
=número de muestras del análisis inicial.
MEDIA ARITMÉTICA DEL ANÁLISIS DE CADA CONDICiÓN DE ALMACENAJE
- :2>¡
y I. = -
-
n¡
ni = número de muestras del análisis de la i-ésima condición de almacenaje. DIFERENCIA ABSOLUTA DE LA MEDIA ARITMÉTICA DE CADA CONDICiÓN DE ALMACENAJE RESPECTO DE LA MEDIA ARITMÉTICA DEL ANÁLISIS INICIAL
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados:
CONTENIDO DE ANALlTO EN % PARA UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO TIEMPO DE ALMACENAMIENTO EN EL INYECTOR INICIAL MUESTRA
1 2 3
(Yo)
100.05 99.98 100.10
6 horas
24 horas
36 horas
(Y,)
(Y2 )
(Y3)
99.50 99.31 99.50
100.26 99.50 99.31
98.31 98.50 98.31
2) Calcular ¿Yo' ¿Y 1 , ¿Y2 , ¿Y3 Y determinar no' n1 , n2 Y n3 • ¿Yo = 100.05 + 99.98 + 100.10 = 300.13 ¿Y, = 99.50 + 99.31+ 99.50 =298.31 ¿Y2 = 100.26 + 99.50+ 99.31 = 299.07 ¿Y 3 = 98.31 + 98.50+ 98.31 = 295.12 no
=3 =3 =3
n, =3
n2 n3
ANEXOS'
69
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
Yo = 300.13 = 100.0433 3
-
298.31 3
YI = ------ =99.4367
- - 299.07 _ 99 69 Y2 - --3-.
Y3 = 295.1~ =
98.3733
3
I
Id,; = IY1- ~o¡ =199.4367 -100. 04331=0.61 I
!
El valor no excede el 2%.
Id2: = IY2- ~o\ =19 9.69 -100.0433\ = 0.35 El valor no excede el 2%.
El valor no excede el 2%.
MÉTODOS
ANALíTICOS
GUiA
ANEXO 9.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALiTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA lÍMITE DE DETECCiÓN
9.1 SEÑAL RUIDO 1)
Tabular los resultados:
SEÑAL ANALíTICA pA*seg
MUESTRA
3525
BLANCO O RUIDO
10575
3 * RUIDO ANALlTO ppm 0.5
.
1
4215 6954 9267
1.5 2
11045
2.5
13578
El LD se estima en 2 ppm, que es la cantidad de analito inmediatamente posterior a 3 veces el ruido. 9.2 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS. A) FÓRMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACiÓN
PENDIENTE
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica ).
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
r2
= __ (n(¿xy)-(¿x)(¿y»2
-'-::-O-.-~'-:-''--~-:-~
_
(n(¿x 2)-(¿x)2)(n(¿l)-(¿y)2)
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LAPENDIENTE
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
t O.975,n-2 =Referirse al Anexo 20 para determinar el valor de la t de Student. B) FÓRMULA PARA LOS BLANCOS DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS:
n(¿>2)_(¿y)2 n(n -1)
n =número de blancos C) FÓRMULA PARA EL líMITE DE DETECCIÓN.
3.3 x s, LD=-b¡--"-
D) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACiÓN. 1) Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANAlíTICA (y)
MUESTRA
1 2 3 4 5 6 7 8
x (ppm)
y (absorbancia)
0,963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
2)
Calcular ~x, ~y, LX2, Ly2, LXY y determinar n:
~x
= 0.963 + 0.963 +.. oo + 1.926 = 11.556
~Y
=0.315 + 0.314 + oo. + 0.629'= 3,765
L x2 = 0.963 2 + 0.9632 +
... +
1.926 2 = 17.72305
~ y2 =
0.3152 + 0.314 2 + oo' + 0.629 2 = 1.88164
~xy =
0.963*0.315 + 0.963*0.314 +oo. + 1.926*0.629 = 5.77479
n=8 ANEXOS'
72
GUiA
3)
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Calcular b, y r2.
q = 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 8 x 17.72305 -11.556 2
r2 =
(8x5.77479-11.556x3.765)2 2 =0.99989 (8x 17.72305 -11.5562)x (8 x 1.88164 -3.765 )
El valor es mayor de 0.98 4)
Calcular bo'
Sy/x
y
Sbl:
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 =-0.00075 o 8
Sylx =
Sbl =
_1.88164 - 0.32632x 5.77479 - (-Q.00075)x 3.765 =0.00143 8-2
0.00143
1
11.5562 17.72305 8
5) Determinar en el Anexo 20
= 0.00141
tO.975.n'2
y calcular IC(f31)'
tO.975,6 = 2.447 IC(PI) = 0.32632 ± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977 El intervalo no incluye el cero. E) PROCEDIMIENTO DE CALCULO PARA LOS BLANCOS.
1) Tabular los resultados:
BLANCOS
Y (Absorbancia)
1 2 3 4 5
0.003 0.004 0.006 0.002 0.004
2) Calcular 1:y, 1:y2y determinar n:
=0.003 + 0.004 + .,. + 0.004 =0.019 1: y2 =0.003 2 + 0.004 2 + + 0.004 2 = 0.00008 1: y
oo.
n=5 ANEXOS'
73
GUíA
3) Calcular
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
s; 2
Sb =
5 x 0.00008 - 0.019 =0.00148 5(5 -1)
F) CÁLCULO DEL LIMITE DE DETECCiÓN.
= 3.3xO.00148 =0.015ppm
LD
0.32632
9.3 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADA EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n¿xy-¿X¿'y b¡ = nL,¿x "'" 2 -(L,¿X) "'" 2
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica ).
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(LXY)-(LX)(LY)/ r = (n(Lx 2)-(Lx)2)(n(Li)-(Ly)2) 2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
tO.975 ,n.2 =Referirse al Anexo 20,
para determinar el valor de la t de Student.
LíMITE DE DETECCiÓN.
3.3 xS y 1x
LD=--b¡~-
ANEXOS'
74
I, i I
.
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
t
¡¡
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTAANALiTICA (y)
f MUESTRA
1 2 3 4 5 6 7 8 2) Calcular Lx, Ly, Lx2 ,
Lx = 0.963 + 0.963 + L Y =0.315 + 0.314 +
Lx = 2
2
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
Ly2 , LXY y determinar n: + 1.926 = 11.556 + 0.629
2
0.963 + 0.963 +
=3.765
+ 1.9262 = 17.72305
L y2 =0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164 LXY = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3) Calcular b, y r2 •
b¡ = ~~_5:~~~22..=-_!J~~56x2·??~'i_ = 0.32632 8x 17.72305-11.556"2 r2 =
2 (8x 5.:.?2.~79-11.556x 3.765) _= 0.99989 2) 2)x (8x 17.72305-11.556 (8x 1.88164- 3.765
El valor es mayor de 0.98 4) Calcular bo' Sy/x y Sbl:
b = 3.765-0.32632xI1.556 =-0.00075 a 8
I.88164-0.32632x5.77479 -(-0.00075)x3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143
2
=0.00141
17.72305 _ L1.556 8
ANEXOS·
75_
GUiA
DE
VALIDACiÓN
IC(P.)
MÉTODOS
ANALíTICOS
tO.975,n-2 y calcular 1C(f3,).
5) Determinar en el Anexo 20 (0.975,6
DE
=2.447 = 0.32632± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular el límite de detección.
m
LD = 3.3xO.00143 = 0.014 0.32632
PP
9.4 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
nLxy- LxLy b¡ = nI>2 -CLX)2
n
=número de mediciones (concentración -
respuesta analítica ).
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
I
S" =S,¡,
1
~LX2 _ (L nX)2
L y -b¡LXy-boLY
_ I SYIX-~ b
o
2
n-2
L>-b¡Lx
==--~-
n
tO.975,n-2 = Referirse al Anexo 20, para
determinar el valor de la t de Student.
DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN.
ANEXOS'
76
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
- ¿>
X=--
n LíMITE DE DETECCiÓN.
LD=
3.3xSb
o
b, B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANALíTICA (y)
MUESTRA
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
1 2 3 4 5 6 7 8
L.X, L.y, L.X2, L.y2, L.xy y determinar n:
2)
Calcular
L.X
=0.963 + 0.963 +
+ 1.926
=11.556
L. y = 0.315 + 0.314 + + 0.629 = 3.765 L. x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + + 1.9262 =17.72305 L. y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164 L.xy = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3)
Calcular b, y r 2•
b = 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 1 8 x 17.72305-11.556 2
r2 =
(8x5.77479-11.556 x 3.765)2 =0.99989 (8 x 17.72305-11.556 2) x (8 x 1.88164 -3.765 2)
El valor es mayor de 0.98 4)
Calcular bo'
Sy/x
y Sb1
b¿ = 3.765-0.32632x11.556 =-0.00075 8 ANEXOS·
77
GUíA
S Y/ J:
S61
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
1.88164-0.32632 x 5.77479 - (-0.00075) x 3.765 8-2
=:
=:
DE
0.00143
1 =0.00141 2 17.72305 _ 11.556 8
5) Determinar en el Anexo 20 (0975,6
=
IC(j3I)
tO.97S.n-2
=y calcular IC({3J
2.447
=:
0.32632± 2.447xO.00141 =: 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero.
6) Calcular
x
=:
x y s,
o
11.556 =1.4445 8 2
5 60 =0.00143
1. 1.4445 8'+-----=0.00210 2 17.72305- 11.556 8
7) Calcular el límite de detección.
LD = 3.3xO.0021O =0.021 m 0.32632 PP
ANEXOS'
78
=:
ANALíTICOS
0.00143
GUíA
ANEXO 10.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA liMITE DE CUANTIFICACiÓN
10.1 SEÑAL RUIDO 1)
Tabular los resultados:
SEÑAL MUESTRA
ANALlT/CA pA*seg
PLACEBOANALITICO (BLANCO O RUIDO) 10" RUIDO ANALlTO ppm
3525 35250
5 10 15 20 25
15228 26250 37145 42180 59624
El LC se estima en 15 ppm, que es la cantidad del analito, inmediatamente posterior a 10 veces el ruido.
10.2 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS. A) FÓRMULAS PARA LA CURVA DE CALIBRACiÓN PENDIENTE
n = número de mediciones (concentración - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
(n(¿xy)-(¿x)(¿y»2 r = (n(¿x 2)_(¿x)2)(n(¿y2)-(¿y)2) 2
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
leefi¡)=b 1 ±IO.975,n-2 S b¡
~.
ANEXOS'
79
GUiA
tO.975.n-2
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
B) FÓRMULA PARA LOS BLANCOS DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LOS BLANCOS:
n(¿y2)_(¿»2
= .I--=~----"'=--
Sb
n(n-l)
n = número de blancos C) FÓRMULA PARA EL LIMITE DE CUANTIFICACiÓN.
Le = IOxSb b) D) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA CURVA DE CALIBRACiÓN. 1)
Tabular los resultados:
CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTAANALlTICA (y)
PLACEBO ANAL\nco
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO 1 2 3 4 5 6 7 8 2)
Calcular LX, LY, LX2 , Ly2 ,LXY determinar n:
LX
= 0.963 + 0.963 +.oo + 1.926
=11.556
L y = 0.315 + 0.314 + oo. + 0.629 = 3.765 L x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + oo. + 1.926 2 =17.72305 L y 2 =0.315 2 + 0.314 2 + oo. + 0.629 2 =1.88164 LXY
=0.963*0.315 + 0.963*0.314
+ oo. + 1.926*0.629
=5.77479
n=8 Calcular b, y r2 •
3)
= 8x5.77479-11.556x3.765 = 0.32632
b
) r2 =
8x 17.72305-11.556 2 2
(8x5.77479-11.556 x3.765) 2 =0.99989 (8 x 17.72305-11.556 2 ) x (8 x 1.88164 -3.765 )
ANEXOS'
80
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
M.ÉTODOS
ANALíTICOS
El valor excede 0.98 4) Calcular ba, Sytx y Sb'
ha = 3.765-0.32632xl1.556 = -0.00075 8 1.88164- 0.32632x 5.77479 - (-0.00075) X 3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143
1
17.72305_ 11.556 8
2
=0.00141
5) Determinar en el Anexo 20 tO.975.n-2 y calcular 1C({3,). 10.975,6
= 2.447
IC(Pl)= 0.32632±2.447xO.00141 = 0.32288,0.32977 El intervalo no incluye el cero. E) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO PARA LOS BLANCOS. 1)
Tabular los resultados: PLACEBO ANALíTICO (BLANCOS) Y (Absorbancia)
2)
PLACEBO ANALiTICO (BLANCOS)
y (Absorbancia)
1
0.003
2
0.004
3
0.006
4
0.002
5
0.004
Calcular "iy, "iy2 y determinar n:
"i y =0.003 + 0.004 + ... + 0.004 =0.019 "i y2 = 0.003 2 + 0.004 2 + ... + 0.004 2 =0.00008 n=5 3)
Calcular
Sb =
s;
5xO.00008-0.019 5(5-1)
2
=0.00148
F) CÁLCULO DEL LíMITE DE CUANTIFICACiÓN.
Le = 10xO.00148 0.32632
m
= 0.045 PP
ANEXOS'
81
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
10.3 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADA EN LA DESVIACfóN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n = número de mediciones (concentración - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN 2
(n(¿xy)-(¿x)(¿y))2 - (n(¿x 2)_(¿x)2)(n(¿y2)-(¿y)2)
r -
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
tO.975.n-2
=Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
LíMITE DE CUANTIFICACiÓN.
lOxS y t x LC=---
bl
ANEXOS'
82
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANAlíTICA (y)
PLACEBO ANAlÍTICO
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO
1 2 3 4 5 6 7 8 2)
Calcular
LX, LY, LX2 , Ly 2 , LXY y determinar n:
LX = 0.963 + 0.963 +
+ 1.926 = 11.556
L Y =0.315 + 0.314 + + 0.629 =3.765 L x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + + 1.926 2 =17.72305 L y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + + 0.629 2 = 1.88164
LXY =0.963*0.315 + 0.963*0.314 + ... + 1.926*0.629 =5.77479 n=8 Calcular b, y r2 •
3)
b - 8x5.77479-11.556x3.765 =0.32632 1-
8xI7.72305-11.5562 2
(8x5.77479-11.556 x3.765) =0.99989 r 2 - (8 xI7.72305-11.556 2)x(8 x1.88164-3.765 ) 2
El valor excede 0.98 4)
Calcular b a, Sy/x y Sbl
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 = -0.00075
8
o
1.88164-0.32632x5.77479-(-0.00075) x3.765 = 0.00143 8-2 Sbl
= 0.00143 17.72305_
11.5;6
5) Determinar en el Anexo 20,
2 =0.00141
tO.975,n-2 y calcular 1C(f31) .
t 0.975,6 = 2.441
JCCPI) = 0.32632 ± 2.447 x 0.00141 = 0.32288 , 0.32977
ANEXOS'
83
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular el límite de cuantificación.
LC = 10xO.00143 = 0.044 ppm 0.32632 10.4 CURVA DE CALIBRACiÓN BASADO EN LA DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n = número de mediciones ,..:oncentracíón - respuesta analítica ). COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
s = f¿y2 -b¡¿xy-bo¿y yIx
~
n-2
bo ==¿=-y_-_b---,¡¿=--X n t O.975,n-2= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA AL ORIGEN.
- LX
X=--
n LIMITE DE CUANTIFICACiÓN.
LC=
10xSb
b¡
o
ANEXOS'
84
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA (x) - RESPUESTA ANALíTICA (y)
PLACEBO ANALíTICO
x (ppm)
y (absorbancia)
0.963 0.963 1.284 1.284 1.605 1.605 1.926 1.926
0.315 0.314 0.417 0.418 0.522 0.521 0.629 0.629
ADICIONADO
1 2 3 .» 4 5 6 7 8 2) Calcular
L.X, L.y, L.X2 , L.y2, L.xy y determinar n:
L.X =0.963 + 0.963 + + 1.926 =11.556 L. Y = 0.315 + 0.314 + + 0.629 = 3.765 L. x2 = 0.963 2 + 0.963 2 + oo. + 1.9262 = 17.72305 L.y2 = 0.315 2 + 0.314 2 + oo. + 0.629 2 = 1.88164 L.xy = 0.963*0.315 + 0.963*0.314 + .oo + 1.926*0.629 = 5.77479 n=8 3) Calcular b, y r2 .
_ 8x5.77479-11.556 x3.765 =0.32632 b 8 x 17.72305 -11.556 2 l
2
(8x5.77479-11.556x3.765) =0.99989 2 2 r = (8x 17.72305-11.556 ) x (8 x 1.88164- 3.765 ) 2
El valor es mayor de 0.98 4) Calcular b o'
Sy/x
y
Sbl:
b = 3.765 - 0.32632 x 11.556 o 8
Sylx
Sbl
=
=-0.00075
1.88164 0.32632x 5.77479 -(-0.00075)x3.765 = 0.00143 8-2
= 0.00143
1 - - - - - - - - ; ;2-
11.556 17.72305 8
=0.00141
ANEXOS'
85
·
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTO(')OS
5) Determinar en el Anexo 20, to.975,n-2 y calcular 1C(f3J (0975,6 =
JC(P.)
2.447
= 0.32632± 2.447 x 0.00141 = 0.32288,0.32977
El intervalo no incluye el cero. 6) Calcular
xy Sbo
X = 11.556 = 1.4445 8 SbO =
1 1.4445 2 0.00143 - + =0.00210 2 8 17.72305 _ 11.556 8
7) Calcular el límite de cuantificación.
0064 ppm Le =.10xO.00210 =. 0.32632
ANEXOS'
86
ANALíTICOS
GUíA
ANEXO 11.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA ROBUSTEZ. A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA DE LA CONDICiÓN NORMAL DE OPERACiÓN
- ¿Yo Yo=-no
no
=número de muestras de la condición normal de operación.
MEDIA ARITMÉTICA DEL ANÁLISIS DE CADA CONDICiÓN DE OPERACiÓN. DIFERENTE A LA CONDICiÓN NORMAL
ni = número demuestras de la i-ésima condición de operación. DIFERENCIAABSOLurA DE LA MEDIAARITMÉTICA DE CADA CONDICiÓN RESPECTO DE LA MEDIA ARITMÉTICA DE LA CONDICiÓN NORMAL
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: . VALORACiÓN (%) DELANALlTO ROBUSTEZ AL % DE UN COMPONENTE DE LA FASE MÓVIL DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO
CONDICION 0.31%
0.34%
0.37%
BAJA
NORMAL
ALTA
(Y,)
(Yo)
(Y2)
1
101.88
100.55
B9.QO
2
101.88
100.22
98.74
3
101.37
103.63
99.33
MUESTRA
2) Calcular LYo'
LY" LY2 Y determinar. no' n, Y n2 • LYo = 100.55 + 100.22 + 103.63 = 304.40 LY, =101.88 + 101.88+ 101.37 =305.13 LY2 = 99.00 + 98.74+ 99.33 = 297.07 no
=3 =3
n, =3 n2
ANEXOS'
87
GUíA
3) Calcular
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
Yo, y32 :
Yo = 304.4 = 101.4667 3
YI = 305.13 = 101.71 3
Y2 = 297.07 = 99.0233 3
4) Calcular 1dil:
¡dll =
/YI-., =1101.71-101.46671 = 0.2433
El valor no excede el 2%.
El valor excede el 2%.
ANEXOS'
88
ANALíTICOS
GUíA
ANEXO 12.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA TOLERANCIA.
A) FÓRMULAS MEDIA ARITMÉTICA:
-
¿y n
y=DESVIACiÓN ESTÁNDAR:
n(¿/)-(¿y)2
s=
n(n-l)
COEFICIENTE DE VARIACiÓN:
CV = :'*100 y n
=número de muestras de contenido I potencia I valoración.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: VALORACiÓN DEL ANALlTO TOLERANCIA DE UN MÉTODO CROMATOGRÁFICO A EQUIPOS
2) Calcular LY,
Ly =98.69
MUESTRA
CLAR 1
CLAR2
1
98.69
97.9
2
98.51
97.5
3
98.35
98.11
Li y determinar n.
+ 98.51 + oo. + 98.11
=589.06
L y2 = 98.69 + 98.51 +oo.+ 98.112 = 57832.8908 n=6 2
2
3) Calcular y y S :
y= 589.06 =98.1767 6
S
=
I
/6 x 57832.8908 - 589.06 ~ 6x(6-1)
2
= 0.4344
4) Calcular el CV:
CV = 0.4344 X 100-044°/ -. /0 98.1767 El valor no es mayor de 2%.
EXOS .
89
GUíA
ANEXO 13.
DE
VALIDACiÓN
DE
MéTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
A) FÓRMULAS VARIANZA
Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer:
S,2 =varianza menor. S/
=varianza mayor.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2 2 S2 < a 2 . < ...-LxF, S2 r:" 2 x rO.025,n 2 -l,n,-l 2 - S2 O.975,n2- 1,nl-1 ~
al
1
FO.025,llrl,Il,-1 y FO.975,1l2_1,1l,.1=Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. nz-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n 1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
n, =número de recobros del método de varianza menor. nz
=número de recobros del método de varianza mayor.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO.
1)
Tabular los resultados:
% DE RECOBRO PLACEBO ANALÍTICO
METODOA
METODO B
101.22 99.56 100.39 99.11 100.19 100.95
100.08 100.59 100.22 99.97 100.47 99.85
ADICIONADO 1 2 3 4 5
6
ANEXOS'
90
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2) Calcular ~y, ~y2 Y determinar n, para cada método analítico: % DE RECOBRO
MÉTODO B
MÉTODO A ~y ~y2
101.22 + 99.56 + ... + 100.95 =601.42
100.08 + 100.59 + ... + 99.85 =601.18 2 2 2 101.22 + 99.56 + ... + 100.95 =60287.5648 100.082 + 100.59 2 + ... + 99.852 =60236.6472
n
6
6 3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
s2
==
6 x 60287.5648 - 60 1.42 6x(6-1)
2
== 0.6457
Método B:
S2 === 6x60236.6472-601.18 6x(6-1)
2
==0.0830
4) Determinar la varianza mayor (S22) y la varianza menor (S,2)
s? == 0.0830 si == 0.B457 5) Determinar en el Anexo 21
F0.025.0
2,1.0,,1
YF0.975.02,1.0,,1'.
FO.025.S.S = 0.14 F097SSS=7.15 6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas: 2
0.6457 xO.14S~S 0.6457 x7.15 0.0830 0'¡2 0.0830
El intervalo de confianza no incluye el valor de 1.
ANEXOS'
91
GUiA
:0 14.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA REPETIBILlDAD EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS.
A) FÓRMULAS VARIANZA
:¿y2 _(¿_~_)_~ ., (n -1) Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S/ varianza menor. S/ varianza mayor. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS
y Fo.975.n2-I.n,-¡= Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados eje libertad del numerador; y n,-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
Fo.025.n2.1.n,-1
n¡
=número de recobros del método de varianza menor.
n2 =número de recobros del método de varianza mayor.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados: MÉTODO A CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
MÉTODO B
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
400.00 400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 '500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
ANEXOS'
92
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2) Calcular el porcentaje de recobro de cada muestra en cada método (y), al obtener el cociente de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada expresada en porcentaje.
% DE RECOBRO MÉTODO A
(392.88/400.00)*100
MÉTODO B
=98.22
{407.72/400.00)*100
97.47
102.31
99.43 98.44
99.56 101.40
102.73 99.44
99.59
=101.93
98.79 102.38 98.77
98.80 97.80 98.73
98.76 99.44
97.30 99.24
97.18 99.11 100.03
97.16
100.35 97.31 3) Calcular Sy, Sy2 y determinar n, para cada método analítico:
MÉTODO B
MÉTODO A "Ly
98.22 + 97.47 +
"Ly2
98.22 2 + 97.47 2 +
oo'
oo.
+ 97.16 = 1184.7609 + 97.16 2 = 116996.0999
101.93 + 102.31 + + 97.31 = 1496.9118 101.932 + 102.31 2 + + 97.31 2 = 149420.3404 oo.
15
12
n
oo.
4) Calcular la varianza de cada método: Método A: 2
S2 = 12x116996.0999-1184.7609 =2.2332 12x(l2-1) Método B:
2 S2 == 15x149420.3404-1496.9118 =2.6672 15x(l5-1) 5) Determinar la varianza mayor (S/) y la varianza menor ( S/)
s; =2.2332 si = 2.6672
ANEXOS'
93
GUíA
DE
VALIDACiÓN
6) Determinar en el Anexo 21 F0025.14,11
F0975.14,11
DE
MÉTODOS
F0.0_5.n,-1.n ~ YF0.975.n ,-I.n ,-1\ ,-1
= 0.32 = 3.36
7) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas:
2.6673 - - - x0.32 2.2332
0.39
~
0-; 2 0-,
~
2.6673 ------x3.36 2.2332
~ o-~ ~ 4.01
0-,
El intervalo de confianza incluye el valor de 1.
ANEXOS'
94
ANALíTICOS
GUiA
ANEXO 15.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALiTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN EXACTITUD PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANAlÍTICOS. 1.0 COMPARACiÓN DE REPETIBILlDAD DE AMBOS MÉTODOS A) FÓRMULAS VARIANZA 2
n 2:>2
-el> )2
S = ~=----'=--n (n -1) Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de cálculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S/ S/
varianza menor. varianza mayor.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2
~1.2 x F,O.025,n, -l,n¡-l S1
2 :;;(J'2
2
s
2 S2 x F, S2 O.975,n, -I,n,-l
(J'I
I
=
FO.o:!5.n, . (,n ' . 1 y Fo.975,n2. l. n , . 1 Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. nz-1 sangrados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n 1-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador. n 1 = número de recobros del método de varianza menor. n 2 =número de recobros del método de varianza mayor. Las varianzas son iguales si en el intervalo de confianza incluye la unidad. 2.0 IGUAL REPETIBILlDAD (VARIANZAS EQUIVALENTES). A) FÓRMULAS. MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
¿Y2
Y2 = - - n2 VARIANZA DEL MÉTODO 1
'L>l -
2 ni (¿YI)2 SI = ---'=---==-ni (ni -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2 2
n2 ¿Y~ _(¿Y2)2 n2(n2 - l)
S2 =..
ANEXOS'
95
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALITICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES.
to.975.n, +n,-2
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
n, = número de rec-obros del método 1. n2 = número de recobros del método 2. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: % DE RECOBRO
PLACEBO ANALíTICO
MÉTODO A
MÉTODO B
98.22 101.58 98.44 99.44 100.25 97.16
101.93 99.56 101.40 98.79 102.38 99.11
ADICIONADO 1 2 3 4 5 6
2) Calcular "i.y, "i.y2 y determinar n, para cada método analítico: MÉTODO A
MÉTODO B
= =
"i.y2
98.22 + 101.58 +oo. + 97.16 595.09 98.22 2 + 101.58 2 + .oo + 97.16 2 59034.5401
n
6
"i.y
6
3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
52 ,
2
= 6~~?O~,!:5401- 59?09 = 2.5044 6x(6-1)
Método B:
52
= .6:<~~~42:?_~?! -=_~?3.172
=
2.4249
6x(6-1)
2
4) Determinar la varianza mayor (S/) y la varianza menor (S,2):
S,2
= 2.5044
si = 2.4249 5) Determinar en el Anexo 21 F002555
F O.975,5,5
F-0.025.n, -\.n 1-\ Y Fo. 975.n, -Ln, -1 :
= 0.14 = 7.15 ANEXOS'
96
=603.17 =60647.7991
101.93 + 99.56 +oo. + 99.11 101.93 2 + 99.56 2 + oo. + 99.112
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varíanzas:
ai
2.S044 2.S044 --xO.14:$-- < - - x 7 IS 2.4249 a,2 - 2.4249 .
El intervalo de confianza incluye el valor de 1. 7) Tabular otra vez los resultados:
% DE RECOBRO
Calcular Ly,. Ly/.
8)
MÉTODO 1
MÉTODO 2
98.22
101.93
101.58
99.56
98.44
101.40
99.44 100.25 97.16
98.79 102.38 99.11
LY2 , LY/ y determinar n, y n2 :
LY,= 98.22 + 101.58 + + 97.16 =595.09 LY/ = 98.22 2 + 101.58 2 + ... + 97.16 2 = 59034.5401 LY2 = 101.93 + 99.56 + + 99.11 = 603,17 LY/= 101.93 2 + 99.56 2 + + 99.112 = 60647.7991 "0
oo'
oo.
n1 = 6 n2 = 6
- 603.17 = 100.5283 6 10) Calcular S/. Y2
st
S2
=
~.~ S9034oS4~~-=-~~:..~~2
=
2.5044
6x(6-1)
1
s: = 6 x 606~7.7??.1..:-_?~~~.!]_ =2.4249 2
6x(6-1)
2
11) Determinar en el Anexo 20 (0.975,10
tO.975.n\ +n,-2
y calcular 1C(lld.l2)O
= 2.228
ISX2.S044+SX2.4249.[1 1] ICCf-l1 - f-l2) = (99.1817 - 100oS283)±2.228, 1--'------ - + .. = -3.37,0.67
ID
V
El intervalo de confianza incluye el cero. ANEXOS'
97
6
6
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
8)
Calcular ¿Yl' ¿Y/o ¿y2• ¿Y/ y determinar n, y n2: ¿y,= 102.15 + 98.26 + ... + 99.15 = 602.38 ¿Y/= 102.152 + 98.26 2 + ... + 99.15 2 = 60500.4108 ¿Y2= 100.93 + 99.56 + ... + 99.11 = 600.16 ¿Y/= 100.932 + 99.56 2 + ... + 99.112 =60034.1916 n1=6 n2= 6 9) Calcular Y"
Y1 2:
YI = 602.38 = 100.3967 6
Y2 = 600.16 =
100.0267
6 10) Calcular
S~
S/. S/=
= 6x60500AI08-602.38 2
=4.6933
6x(6-1)
I
S2 2
6 x 60034.1916 = -----.--
600.16 6 x (6 -1)
2
= 0.4375
11) Calcular gl.
12) Determinar en el Anexo 20
t 0.975.6
tO.975.gl
y calcular IC(Jld12)'
=2.447
. [4.6933 0.4375 JCCPI - P2) = (100.3967 -100.0267) ± 2.447,1-- + - - = -1.89,2.63 '1 El intervalo de confianza incluye el cero.
ANEXOS'
98
6
6
GUiA
2)
DE
VALIDACiÓN
DE
MéTODOS
ANALiTICOS
Calcular ¿y, ¿y2 y determinar n, para cada método analítico: MÉTODO A
MÉTODO B
¿y
102.15 + 98.26 + ... + 99.15 = 602.38
¿y2
102.152 + 98.26 2 + ... + 99.15 2 = 60500.4108
100.93 + 99.56 + ... + 99.11 = 600.16 100.93 2 + 99.56 2 + .z, + 99.11 2 = 60034.1916
n
6
6
3)
Calcular la varianza de cada método:
Método A: 2
= 6 x 60500.4108 -
602.38 =4.6933 6x(6-1)
S2 A
Método 8: 2
6 x 60034.1916 - 600.16 = 0.4375 SB 6x(6-1) 2 _
4) Determinar la varianza mayor (8 22) y la varianza menor (8/) S¡2
= 0.4375
si = 4.6933 5) Determinar en el Anexo 21 Fo.o25.nz.l.n,.1 FO.025.5,5
y Fo.975.nz.l.n,.1
:
= 0.14
F097555=7.15
6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas:
4.6933 xO.14:o:::;
2 u2
0.4375
u¡2
s 4.6933 x7.15 0.4375
u2 1.50:0:::; _2 :o: :; 76.67 u 12 El intervalo de confianza no incluye el valor de 1. 7)
Tabular otra vez los resultados:
MÉTODO 1
MÉTODO 2
102.15 98.26 100.65 98.51 103.66 99.15
100.93 99.56 100.40 99.79 100.37 99.11
t
./
lt :1 J¡
¡i
¡l'1 1
j¡I 1I 11 ANEXOS'
99
I
¡
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
3.0 DIFERENTE REPETIBILlDAO (VARIANZAS DIFERENTES). FÓRMULAS. MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
:¿>\ y\=-nI
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
- ¿Y2
)') =---
n2
VARIANZA DEL MÉTODO 1
2 SI
/1¡:¿>? _(¿YI)2
= ---------.ni
(/11 -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2
/12¿Y2 2 " " 2 -(¿Y2) "" 2 S1 =. ----------. -- -. /12 (n2 -1) INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES_
t 0 975 . gl =Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. nl = número de recobros del método 1.
m = número derecobros del método 2. gl =.
[ ~12 +~i]2 /11
n2
2
fS{Jl : 111 'e.. _ . ,__.. 111 +
1
+
rI ~l.l
2 -
2
/12
h..__~_
/1 2 + 1
El valor de gl, debe ser redondeado al entero inmediato anterior.
n, = número de recobros del método 1. n 2 = número de recobros del método 2. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados:
% DE RECOBRO
PLACEBO ANAlÍTICO ADICIONADO
MÉTODO 1
MÉTOOO2
1
102.15
100.93
2
98.26
99.56
3
100.65
100.40
4 5 6
98.51 103.66 99.15
99.79 100.37
ANEXOS'
100
99.11
-
GUiA
ANEXO 16.
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN LINEALIDAD DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTICOS. 16.1 CANTIDAD ADICIONADA (x) VS CANTIDAD RECUPERADA (y) A)
FÓRMULAS.
SUMATORIAS. MÉTODO 1
MÉTODO 2
Lx, LX,2
Lx, LX22 LY2 Ly/ LXY2
LY, Ly,2 LXYl
El subíndice, indica la sumatoria del método respectivo. PENDIENTE DEL MÉTODO 1.
n, = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada) del método 1. PENDIENTE DEL MÉTODO 2.
n2 = número de mediciones (cantidad adicionada - cantidad recuperada) del método 2. ORDENADA AL ORIGEN DEL MÉTODO 1.
ORDEtIADAAL ORIGEN DEL MÉTODO 2.
DESVIACiÓN ESTÁNDAR DE REGRESiÓN.
¿yl-b¡¡¿xy¡ -bo¡¿y¡ + ¿y~ -b¡2¿XY2 -b02¿Y2 SVlx =
n¡ +n2-4
ANEXOS·
101
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA 8E LAS 2 PENDIENTES
Donde:
t 0.975.n 1 + n,·-I = Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE LAS ORDENADAS AL ORIGEN
¡C(Po I
-
P02 ) = (b oI
-
b02) ± t 0.975'//1 +//2 -4 SbOl -b"2
Donde:
B) PROCEDIMIENTO DE CALCULO. 1)
Tabular los resultados: MÉTODO A CANTIDAD ADICIONADA
(mg/g)
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
MÉTODO B
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g)
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g)
392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
400.00 400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
ANEXOS'
102
GUíA
2) Calcular
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2 ¿XI' ¿X,2 , ¿X1 , ¿YI ' ¿y¡2 , ¿xy¡ , ¿X2 ' ¿>~ '¿Y2' ¿y~, ¿xy
determinar n, y n2 . METODO 1
¿ x, = 400.00 + 400.00 + + 550.00 = 5800.0000 ¿ x; = 400.002+ 400.002+ + 550.002= 2850000.0000 oo.
oO.
¿YI = 392.88 + 389.88 + ... + 534.38 = 5726.4600 ¿y¡2 = 392.882 + 389.882 +
I
Oo.
+ 534.382 = 2778528.1070
xy¡ = 400.00*392.88 + 400.00*389.88 +
oo.
+ 550.00*534.38 = 28137245000
n,=12 METODO 2
¿ x = 400.00 + 400.00 + ... + 550.00 = 7250.0000 I x ~ = 400.002+ 400.002+ + 550.00 = 3562500.0000 I Y2 = 407.72 + 409.24 + '" + 535.21 = 7226.7600 I y~ = 40772 + 409.24 + ... + 535.212 = 3533049.5062 2
2
'Oo
2
2
") Xl', J-J
•
.
=:
400.00*407.72
+
40000*409.24
+ 55000*535.21
+.
= 354730900C;'~'
n 2= 15 3) Calcular b ll , b,2' bOl Y b o2 :
hl l
12x 2813724.5000 - 5800.0000x 5726.4600 '=
.•.- -
12x 2850000.0000 - (5800.0000) 2
b¡2
'=
bOl '=
15x3547309.0000-=-J??Q:OOOOx7~26:7600 =0.9321 15 x 3562500.0000 - (7250.0000)2
57?6:460~ -~-?~~~~.~8.9Q.~000 = 1 4445 12
b02
=09843
.
= 72~6:7~?g~.~·.2~~J~2?50.:~0~0
= 31.2483
15
4) Calcular SlÚY y Sb ll " b'2: Sylx
'=
i 2 778528.-107()::'O~8¡3~ 28-1372'4.5'000'- 1'.4445'~ 5726.4600 +'3533049.5062 - Ó. 93 2 I x 3S473OY GOnO - :;1.24X.' .,J.------. .--..---.. - -.. - --..-.----.. . -- . -·-···.. -··.. ----2-3---··.. . ..-....- ...
SxIy = 7.3540
S
-7 3540 bll-bl2
-.
_.
r=_·.====.-_~__._=~_=~-=-_==··.~:·~:~~=~T=·~-.··-_~ ~.· ==0.0457
(5800.0000)2 '\ 2850000.0000 .' ~ 12 l'
ANEXOS'
(7250.0000)2 3562500.0000 - ----- .. ----15
103
GUiA
I
DE
VALIDACiÓN
5) Determinar en el Anexo 20 (0.975,23
(0975.23
DE
MÉTODOS
ANALITICOS
Y calcular IC( f3, 1-(3 12 ) :
= 2.069
IC(PII -
P12 ) = (0.9843 -
0.9321) ± 2.069 x 0.0457 = -0.0423 , 0.1467
El intervalo incluye el cero. 6) Calcular
.. x 1
x~
-
x" x"
y S bo,-b o2
5800.0000 = -----.-.
= 483.3333
12
=
7~~~.:~00~ = 483.3333 15
: l' Sb o l-b02
"1'- -.---.
(4li"J.3333)2
= 7.354 ¡12 +"i"s +-·-·-·----·--(5-800.0000)2 2850000.0000 -- --" .. -----12
-1;
o
(483.3333)2 + ._' _.... -_._.--._..----_ ..- ._- _. (7250.0000)2 3562500.0000 - --.-.-----15
SbOl -b o, = 22.2581 7) Calcular IC(f301-f30 ) .·
= (1.4445 -
[CCPOI - P02)
31.2483) ± 2.069 x 22.2581 = ·75.8482 , 16.2406
El intervalo incluye el cero. 16.2 PORCENTAJE DE RECOBRO. 1.0 COMPARACiÓN DE REPETIBILlDAD DE AMBOS MÉTODOS A) FÓRMULAS VARIANZA
S
2
=
n ¿y2
-(L> )2
n (n
._-
-1)
Nota: Calcular fa varianza de cada método y para fines de calculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: S,2 varianza menor. S22 varianza mayor. INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS
si
0";
si
- 2 x F0.025,/12 -1,/1,-1 < -=-2 --< S2 x Fo.975 ,/1, --¡,11 1 1SI 0"1 I o
Fo.025.n,.I,n .1 Y F O.975.n,.I,nl.¡=Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n,-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
-1
n, = número de recobros del método de varianza menor. n2 =número de recobros del método de varianza mayor. Las varianzas son iguales si en el intervalo de confianza incluye la unidad. Si las varianzas son iguales desarrolle el punto 2. Si las varianzas no son equivalentes desarrolle el punto 3.
ANEXOS'
104
,
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2.0 IGUAL REPETIBILlDAD (VARIANZAS EQUIVALENTES). A) FÓRMULAS. _ MEDIAARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
LY2 Y2=-n2 VARIANZA DEL MÉTODO 1
VARIANZA DEL MÉTODO 2
2
n2¿>ª _(LY2)2
SJ = -..--_ .... -. .----- ---n2(n 2 -1)
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES.
tÓ:975.n¡+ n,.~=
Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
n, = número de recobros del método 1. n2 = número de recobros del método 2. 3.0 DIFERENTE REPETIBILlDAD (VARIANZAS DIFERENTES). "-
FÓRMULAS, MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 1:
LYI YI = - - n¡ MEDIA ARITMÉTICA DEL MÉTODO 2:
VARIANZA DEL MÉTODO 1 2 _
S) -
nlL>l-(LY¡~~ n¡ (ni -1)
VARIANZA DEL MÉTODO 2
2 n2Lyi -(LY2)2 82 = -=---==--n2(n2 -1)
ANEXOS'
105
·
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA DIFERENCIA DE 2 MEDIAS POBLACIONALES. I-
-
-
¡ S2I
'
/C(J.Ll - J.L2) = (YI - Y2) ± t o975,gl \: "
,C'~ .),
+-
Y nI
(:>9',,,,
/12
= Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student.
.d ··
(Y
ce qt. debe ser redondeado al entero inmediato anterior. .le recobros del método 1.
"
'''·cONOS del método 2.
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados: CANTIDAD ADICIONADA - CANTIDAD RECUPERADA - % DE RECOBRO EN AMBOS MÉTODOS
-
---MÉTODOA CANTIDAD ADICIONADA
(mg/g)
! I
,I
400.00 400.00 400.00 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g) 392.88 389.88 397.72 393.76 513.65 497.20 494.00 489.00 543.02 535.15 545.82 534.38
MÉTODO B %DE RECOBRO (y)
98.22 97.47 99.43 98.44 102.73 99.44 98.80 97.80 98.73 97.30 99.24 97.16
CANTIDAD ADICIONADA (mg/g) 400.00 400.00 400.00 400.00' 400.00 500.00 500.00 500.00 500.00 500.00 550.00 550.00 550.00 550.00 550.00
CANTIDAD RECUPERADA (mg/g) 407.72 409.24 398.36 405.60 398.36 493.95 511.90 493.85 393.80 497.20 534.49 545.10 550.17 551.93 535.21
y = Es el cociente porcentual de la cantidad recuperada respecto de la cantidad adicionada.
2)
Calcular LY, Ly2 y determinar n, para cada método analítico:
ANEXOS'
106
%DE RECOBRO (y)
101.93 102.31 99.56 101.40 99.59 98.79 102.38 98.77 98.76 99.44 97.18 99.11 100.03 100.35 97.31
I
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
MÉTODO B
MÉTODO A "Ly
"Ly2
=1184.7609
98.22 + 97.47 + ... + 97.16 2
98.22 +
97.47 2
+ ... + 97.16
n
ANALíTICOS
2
=
101.93 + 102.31+ ... + 97.31
116996.0999
101.93 2 + 102.312 + ... + 97.31 2
=1496.9118 = 149420.3404
15
12
3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
S ~ = 12 x 116996.0999 -1 184.7609 12x(l2-1)
2
= 2.2332
Método B:
15x149420.3404-1496.9118 SR = 15x(l5-1) 2
2
=26672
4) Determinar la varianza mayor ( S/ ) y la varianza menor ( S/)
S? = 2.2332
si = 2.6672 5) Determinar en el Anexo 21
Fo.025.n,ol.n,ol
y Fo.
F0 025.14,11 = 0.32 FO 975,14,11 = 3.36 6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas:
El intervalo de confianza incluye el valor de 1, lo que indica que las varianzas sor. iguales, por lo que es necesario desarrollar el ejemplo con base al punto 2.
ANEXOS'
107
GUíA
7)
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
Tabular otra vez los resultados: % DE RECOBRO EN AMBOS MÉTODOS MÉTODO A
MÉTODO B
ANALíTICO (BLANCOS)
%DE RECOBRO (y)
98.22
101.93
97.47
102.31
99.43
99.56
98.44
101.40
102.73
99.59
99.44
98.79
98.80
102.38
97.80
98.77
98.73
98.76
99.24
99.44
97.16
99.44 99.11 100.03 100.35 97.31
8) Calcular :¿y" :¿y/ :¿Y2 ,:¿y/ y determinar n,y n 2: :¿y,= 98.22 + 97.47 + ... + 97.16 = 1184.7609 :¿y/= 98.22 2 + 97.47 2 + ... + 97.16 2 =116996.0999 :¿Y2= 101.93 + 102.31+ '" + 97.31 = 1496.91118 :¿y/= 101.932 + 102.31 2 + .., + 97.312 = 149420.3404 n,= 12 n2 15
=
9) Calcular Y, y Y2:
}o1
= 1184.7609 =98.7301 12
Y2 = 1496.9118 = 99.7941 15
ANEXOS'
108
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
10) Calcular S/ y S/ :
82
= 12x1l6996.0999-1184.7609 2
82
=2.2332
12x(12-l)
1
= 15x 149420.3404-1496.9118 2
11) Determinar en el Anexo 20 (0.975,25
= 2.6672
15x(l5-1)
2
t0975.n,+n2.2
y calcular
1C(J..ldIJ
= 2.06
IC(fll-fl2)=(98.7301_99.7941)±2.06}I
X2.2332+14 X2.6672[
25
V El intervalo de confianza incluye el cero.
ANEXOS'
109
J
1 :-1 =-2.32 0.19 12 15 '
GUiA
DE
VALIDACIÓN
DE
MÉTODOS
ANALITICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO EN PRECISiÓN DEL MÉTODO PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANALíTIcos.
ANEXO 17.
A) FÓRMULAS VARIANZA
,"'C '" 17
¿:>.2 -(L)' 17 (17
-
)2
1)
Nota: Calcular la varianza de cada método y para fines de calculo del intervalo de confianza para la razón de varianzas, se debe establecer: Si
Si
varianza menor. varianza mayor.
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS
s~·
O"i
•....' »: ¡-r")?5.11.,··1,11
. I
1
1
$
si
.. 2 :S; Sl2 0"1
xFü 9 ". 5 n ~ . "
-r •' ,
-1
"
FO ' I? 5.,,," l.n
.1 y F097S.n,.l.n,.¡ = Referirse al Anexo 21, para det:rminar el valor de la F de Fisher. 'n2-1 son grados de libertad de la varianza mayor, que corresponden a los grados de libertad del numerador; y n,-1 son los grados de libertad de la varianza menor, que corresponden a los grados de libertad del denominador.
n, = número de muestras analizadas del método de varianza menor. n2 = número de muestras analizadas del método de varianza mayor. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
1
«
O 2
Tabular los resultados:
MÉTODO 1
MÉTODO 2
ANALISTA
ANALISTA
1
2
1
2
49.85
50.23
49.25
51.15
46.22
53.50
48.25
52.92
47.11
54.11
48.22 45.12
52.25
50.85
50.85
50.04
51.80
50.26
51.86
50.95
49.95
51.15
50.30
1
-c o 2
ANEXOS'
110·
53.40
GUíA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
2) Calcular LY, Ly 2 y determinar n, para cada método analítico: MÉTODO A
MÉTODOS
LY
49.85 + 50.85 + ... + 50.30 = 608.09
49.25 + 46.22 + ... + 53.40 = 601.50
Ly2
49.85 2 + 50.85 2 + ... + 50.30 2 = 30819.6067
49.25 2 + 46.22 2 + ... + 53.40 2 = 30258.8618
n
12
12
3) Calcular la varianza de cada método: Método A:
s~
= 12 x 30~?6067 -
608.09 12x(l2-1)
2
=
0.4684
Método S:
4) Determinar la varianza mayor ( S/ ) y la varianza menor ( S/):
S l2 = 0.4684
si =9.8795 5) Determinar en el Anexo 21 FO.O~5.n ,-I.n
,_1
y
FO.975.n ,-I.n ,-1 :
F0 025,11,11 = 0.29
F0 975,11,11 = 3.47 6) Calcular el intervalo de confianza para la razón de varianzas:
9.8795 xO.29 $ 0.4684
O"? O"f
$
?8795 x3.47 0.4684
2
6.07
S;
O"J -'2
S;
73.26
0"1
El intervalo de confianza no incluye el valor de 1.
ANEXOS'
111
GUiA
ANEXO 18.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PROPORCIONALIDAD DE MÉTODOS EN 'ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANAlÍTICOS. A) FÓRMULAS PENDIENTE
n = número de muestras analizadas con el método no oficial y el método oficial. ORDENADA AL ORIGEN
b
= =¿=--)_)-_b-----'I¿=---X
()
n
COEFICIENTE DE DETERMINACiÓN
INTERVALO DE CONFIANZA PARA LA PENDIENTE
lc(fJ, ) = bl ± t o 975.n-2 S bl
t0975n-2 =Referirse al Anexo 20, para determinar el valor de la t de Student. COEFICIENTE DE VARIACiÓN DE REGRESiÓN.
S
CVy/x =~xlOO y
Donde:
- ¿y
y=--
n
ANEXOS·
112
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALiTICOS
B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1) Tabular los resultados (datos primarios):
MUESTRA
POTENCIA RELATIVA MÉTODO OFICIAL (x) (%)
CONTENIDO MÉTODO NO OFICIAL (y) (rng I rnL)
1
83.16
16.63
2
78.25
16.12
3
82.11
16.41
4
94.87
18.97
95.47
19.09
101.67
20.33
118.56
25.33
122.15
25.89
125.33
26.08
5
I
6
\
!
7
! i
:
8 9
2) Calcular ¿ x, ¿ y. ¿ x2 • ¿ y2 , ¿xy y determinar n: ¿x=83.16+ 78.25+
+ 125.33=901.57
¿y = 16.63 + 16.12 + + 26.08 = 184.85 ¿x2 = 83.16 2 + 78.25 2 + + 125.33 2 = 92917.0319 2 ¿ y2 = 16.63 + 16.12 2 + + 25.08 2 = 3935.3467 ¿xy = 83.16*16.63 + 78.25*16.12 + ... + 125.33*26.08 = 19115.1179 n=9 3) Calcular b., bo y r2 .
b = I
9 x 19115.1179- 90 1.57 x 184.85 -- - - ----------------------- = 0_2297 9x92917.0319-901.57 2
b = _1~~~_-=-Q.2~97x901.57 =-2.4719 o 9 r2
=
2
(9x19115.1179-901.57xI84.85) ? = 0_9898 (9x92917.0319-901.572)x(9x3935.3647 -184.85-)
4) Calcular Sytx y s;
3935.3647 -0.2279x 19115.1179 - (-2.4719)x 184.85 9-2
r----l-------S
= 0.4497 ,61
---= 0.0088 901 57 2
~ 92917.0319--~---
ANEXOS'
113
=0.4497
GUiA
DE
VALIDACiÓN
5) Determinar en el Anexo
t 0975,7
t0975.n.2
DE
MÉTODOS
y calcular 1C({3,).
= 2.365
¡C({JI)
= 0.2297 ± 2.365 x 0.0088 =0.2089 ,0.2506
El intervalo no incluye el cero. 6)
Calcular el CV y/ x :
\' = 184.85 = 20.5389
.
9
,. .. (1 .l •. r
0.4497 = ..._-
000
20.5389
x 100 --219 . 0//0
ANEXOS'
114
ANALiTICOS
GUíA
ANEXO 19.
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
FÓRMULAS Y PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO CON EJEMPLO PARA PRECISiÓN DEL MÉTODO EN ESTUDIOS DE CORRELACiÓN PARA COMPARACiÓN DE 2 MÉTODOS ANAlÍTICOS.
A)
FÓRMULAS
VARIANZA DEL MÉTODO OFICIAL
2 nl¿>~ _(¿::»)2
SI = - - n)(nl -1)
n, = número de muestras analizadas utilizando el método oficial.
n2 = número de muestras analizadas utilizando el método no oficial. LíMITE UNILATERAL INFFRIOR DE CONFIANZA PARA LA RAZÓN DE VARIANZAS 2
0"2 2 0"1
2
S2 S2 1
--~-xF.
0.05,/1, -1,11,-1
FO.05.n , - l. n, . 1 = Referirse al Anexo 21, para determinar el valor de la F de Fisher. n2-1
son grados de libertad de la varianza del método no oficial, que corresponden a los grados de libertad del numerador y n 1-1 son los grados de libertad del método oficial, que corresponden a los grados de libertad del denominador. B) PROCEDIMIENTO DE CÁLCULO. 1)
Tabular los resultados (datos primarios): PORCENTAJE MÉTODO NO OFICIAL
MÉTODO OFICIAL
ANALISTA
ANALISTA
1
-c O 2
1
2
1
103.95
98.25
101.44
97.80
98.91
99.21
99.06
100.65
102.64
101.26
102.56
103.15
102.75
98.27
97.92
98.54
98.41 101.67
99.72 100.26
1 ~
o
2
2) Calcular ¿Y" ¿Y/' ¿Y2' ¿y} Y determinar
n, Y n2·
¿Yl = 103.95 + 98.91 + ... + 100.26 =-1200.74 ¿Y/ = 103.952 + 98.91 2 + ... + 100.26 2 = 120188.9554 ¿Y 2 = 101.44 + 99.06 + ... + 104.32 = 1217.09 ¿y} = 101.442 + 99.06 2 + ... + 104.32 2 = 123504.7041
ANEXOS'
115
2
104.40
103.56
99.13
104.32
GUiA
DE
VALIDACiÓN
DE
MÉTODOS
ANALíTICOS
3) Calcular la varianza del método oficial y del método no oficial. 2
S2 _ ~.~~_!2ü188.9554-12üü.7~_
= 3.7191
12x(l2-1)
1 -
12x1235ü4.7ü41-1217.ü9 S2 = 12x(l2-1) 2
2
5.6696 o
4) Determinar en el Anexo 21 Fo.05.n, . l. n, . 1 :
FO.05;11.11 = 0.35 5) Calcular el limite unilateral inferior de confianza para la razón de varianzas:
(Ji2 >- 5.6696 x 035 . (JI
3.7191
El límite unilateral inferior de confianza no excede el valor de 1. ANEXO 20. TABLA ESTADISTICA DE LA DISTRIBUCiÓN t DESTUDENT.
GRADOS DE LIBERTAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
t 0975
GRADOS DE LIBERTAD
t 0975
GRADOS DE LIBERTAD
12.706 26 2.056 4.303 27 2.052 3.182 28 2.048 2.n6 29 2.045 2.571 30 2.042 2.447 31 2.040 2.365 ~Lo_._ .__o~'ºªL.. -----2.306 33 2.035 2.262 34 2.032 2.228 35 2.030 2.201 36 2.028 .2.179 37 2.026 2.160 38 2.024 2.145 39 2.023 .. o' 2.131 40 2.021 2.120 41 2.020 2.110 42 2.018 2.101 43 2.017 2.093 44 2.015 2.014 __ _ o. 2.086 45 2.080 46 2.013 ... 2.074 47 2.012 2.069 48 2.011 2.064 49 2.010 2.060 50 .. __ o~·OOL__o
51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
61 62 63 64 65 66
67 68
69 70 71 72 73 74 75
t 0975 2.008 2.007 2.006 2.005 2.004 2.003 2.002 2.002 2.001 2.000 2.000 1.999 1.998 1.998 1.997 1.997 1.996 1.995 1.995 1.994 1.994 1.993 1.993 1.993 1.992
Losgrados delibertad (gl) sefijan con base ala fórmula indicada enel subíndice del slnt>olo dela1de Student.
ANEXOS'
116
ANEXO 21. TABLAS ESTADíSTICAS DE LA DISTRIBUCiÓN F DEFISHER.
FO.975, gln, gld 91 numerador I I denom inador
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 21
28
3
4
5
6
7
8
9
10
15.44 9.98 7.76 6.60 5.89 5.42 5.08 4.83 4.63 4.47 4.35 .4.24 4.15 4.08 4.01 3.95 3.90 3.86 3.82 3.78 3.75 3.72 3.69 3.67 3.65 3.63
15.10 9.60 7.39 6.23 5.52 5.05 4.72 4.47 4.28 4.12 4.00 3.89 3.80 3.73 3.66 3.61 3.56 3.51 3.48 3.44 3.41 3.38 3.35 333 331 329
14.88 9.36 7.15 5.99 5.29 4.82 4.48 4.24 4.04 3.89 3.77 3.66 3.58 3.50 3.44 3.38 3.33 3.29 3.25 3.22 3.18 3.15 3.13 3.10 3.08
14.73 9.20 6.98 5.82 5.12 4.65 4.32 4.07 3.88 3.73 3.60 3.50 3.41 3.34 3.28 3.22 3.17 3.13 3.Q9 3.05 3.02 2.99 2.97
14.62 9.07 6.85 5.70 4.99 4.53 4.20 3.95 3.76 3.61 3.48 3.38 3.29 3.22 3.16 3.10 3.05 3.01 2.97 2.93 2.90 2.87 2.85
294
2.82 280
14.54 8.98 6.76 5.60 4.90 4.43 4.10 3.85 3.66 3.51 3.39 3.29 3.20 3.12 3.06 3.01 2.96 2.91 2.87 2.84 2.81 2.18 2.75 2..13
14.47 8.90 6.68 5.52 4.82 4.36 4.03 3.78 3.59 3.44 3.31 3.21 3.12 3.05 2.98 2.93 2.88 2.84 2.80 2.76 2.73 2.10 2. • 2.65 2.63
14.42 8.84 6.62 5.46 4.76 4.30 3.96 3.72 3.53 3.37 3.25 3.15 3.06 2.99 2.92 2.87 2.82 2.77 2.73 2.70 2.67 2.64 2.61 2.59 2.51 2.55 2.53 2.51 2.50 2.48 2.47 2.45 2.44 2.43 2.42 2.41 2.40 2.39
'a:5t! á.22 33 34 35 36 37 38 39 40
3.54 3.53 3.52 3.50 3.49 3.48 3.47 3.46
292
3.002.84
3'-20 2.98 3.19 . 2.97 3.18 2.96 3.17 2.94 3.16 2.93 3.15 2.92 3.14 2.91 3.13 2.90
2.82 2.81 2.80 2.78 2.77 2.76 2.75 2.74
211
2.69 2..61 a,61 . 2~59 2:65 2.57 2.64 2.56 2.71 2.62 2.54 2.70 - 2.61 2.53 2.69 2.59 2.52 2.68 2.58 2.50 2.66 2.57 2.49 2.65 2.56 2.48 2.64 2.55 2.47 2.63 2.54 2.46 262 253 2.45
3..06 2.90 2.18 . ;':2;7& .•,;';~¿~i75 5 2.73
11
12
13
14
14.37 14.34 14.30 14.28 8.79 8.75 8.72 8.68 6.57 6.52 6.49 6.46 5.41 5.37 5.33 5.30 4.71 4.67 4.63 4.60 4.24 4.20 4.16 4.13 3.91 3.87 3.83 3.80 3.66 3.62 3.58 3.55 3.47 3.43 3.39 3.36 3.32 3.28 3.24 3.21 3.20 3.15 3.12 3.08 3.09 3.05 ,3.01 2.98 3.01 2.96 2.92 2.89 2.93 2.89 2.85 2.82 2.87 2.82 2.79 2.75 2.81 2.77 2.73 2.70 2.76 2.72 2.68 2.65 2.72 2.68 2.64 2.60 2.68 2.64 2,60 "'?;~ 2.65 2.62 2.59 156 2.51 '%:e' 2.44 2.54 2.'- 2.45 242 251 247 243 239 2.49 2.45 2.41 2.37 2.48 2.43 2.39 2.36 246 2.41 2.37 2.34 2.44 2.40 2.36 2.32 2.43 2.38 2.34 2.31 2.41 2.37 2.33 2.29 2.40 2.35 2.31 2.28 2.39 2.34 2.30 2.27 2.37 2.33 2.29 2.25 2.36 2.32 2.28 2.24 2.35 2.31 2.27 2.23 2.34 2.30 2.26 2.22 2.33 2.29 2.25 2.21
15 14.25 8.66 6.43 5.27 4.57 4.10 3.77 3.52 -3.33 3.18 3.05 2.95 2.86 2.79 2.72 2.67 2.62 2,5.7
16
17
18
19
20
14.23 14.21 14.20 14.18 14.17 8.63 8.61 8.59 8.58 8.56 6.40 6.38 6.36 6.34 6.33 5.24 5.22 5.20 5.18 5.17 4.54 4.52 4.50 4.48 4.47 4.08 4.05 4.03 4.02 4.00 3.74 3.72 3.70 3.68 3.67 3.50 3.47 3.45 3.44 3.42 3.30 3.28 3.26 3.24 3.23 3.15 3.13 3.11 3.09 3.07 3.03 3.00 2.98 2.96 2.95 2.92 2.90 2.88 2.86 2.84 2.84 2.81 2.79 2.77 2.76 2.76 2.74 2.72 2.70 2.68 2.70 2.67 2.65 ~.~~ .~:q2 2.64 2.62 2;60. 2.59 ..'."-.2... .:.... _..:.. -I~
~E,le'~i~~~~'i~~~f'1F 2.. 41 239 236 2.34 2.32 2.31 2.29 2.28 2.26 2.25 2.23 2.22 2.21 2.20 2.19 2.18
2.38 2.36 2.34 2.32 2.30 2.28 2.26 2.25 2.23 2.22 2.21 2.20 2.18 2.17 2.16 2.15
2.36 2.34 2.31 2.29 2.27 2.26 2.24 2.22 2.21 2.20 2.18 2.17 2.16 2.15 2.14 2.13
2.34 2.31 2.29 2.27 2.25 2.23 2.22 2.20 2.19 2.17 2.16 2.15 2.14 2.13 2.12 2.11
2.32 2.30 2.29 2.28 2.27 2.25 2.25 2.23 2.23 2.21 2.21 2.20 2.20 2.18 2.18 2.16 2.17 2.15 2.15 2.13 2.14 2.12 2.13 2.11 2.12 2.10 2.11 2.09 2.10 ..2.08 2.09 2.07
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(Continuación)
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FO. 0 25 , gln, gld (Continuación) gl numerador gl denominador
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0.26 0.29 0.31 0.33 0.34 0.35 0.36 0.37 0.38 0.38 0.39 0.40 0.40 0.40 0.41 0.41 0.42 0.42 0.42 0.42 0.43 0.43 0.43 0.43 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45
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0.27 0.30 0.32 0.34 0.35 0.37 0.38 0.39 0.39 0.40 0.41 0.41 0.42 0.42 0.43 0.43 0.44 0.44 0.44 0.45 0.45 0.45 0.45 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.47 0.47 0.47 0..47 0.47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.48
0.27 0.30 0.32 0.34 0.36 0.37 0.38 0.39 0.40 0.41 0.41 0.42 0.42 0.43 0.43 0.44 0.44 0.44 0.45 0.45 0.45 0.46 0.46 0.46 0.46 0.46 0.47 0.47 0:47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48 0.48
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39
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~.~,F.'.,"'~::-;:r~
·'~_~~:'f'.'l.').r :::;;J;"(.'.::!~'~,
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.'
4
5
6
7
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(U7
0..22
9
10
11
12
13
16
17
18
19
20
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CL2e
02:9
O 32
035
0.37
O 38
O 40
O 41
O 43
O 44
O 45
046
047
047
048
029
G 32
1)
31
039
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046
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0.39
042
043
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o 45 e 48
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048 o 48 048
o 48 o 49
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o 45 O..... o 45
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0.45 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45 0.45
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0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
1)
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G.U
28
29
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0.17
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33 34 35 . 39 37 38 39 40
0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12
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0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22
H
15
02S
r.t11 0.22
21
14
on
fU2
e..a
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0.37
0.~9
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040
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-
-
""'-
Fo.os.
I
91 numerador gl denominador 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 '14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
gln. gld
(Continuación)
21
22
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25
26
27
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29
30
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32
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38
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0.33 0.35 0.37 0.39 0.40 0.41 0.42 0.43 0.44 0.44 0.45 0.46 0.46 0.46 0.47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51
0.33 0.36 0.38 0.39 0.41 0.42 0.43 0.44 0.44 0.45 0.46 0.46 0.46 0.47 0.47 0.48 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52
0.33 0.36 0.38 0.40 0.41 0.42 0.43 0.44 0.45 0.45 0.46 0.47 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52
0.33 0.36 0.38 0.40 0.41 0.42 0.43 0.44 0.45 0.46 0.46 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53
0.33 0.36 0.38 0.40 0.42 0.43 0.44 0.45 0.45 0.46 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53
0.34 0.36 0.39 0.40 0.42 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.50 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0,54 0.54
0.34 0.37 0.39 0.41 0.42 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.50 050 0.50 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 053 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 054 0.54
0.34 0.37 0.39 0.41 0.42 0'44 0.45 0.46 0.46 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 055 0.55 0.55
0.34 0.37 0.39 0.41 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.48 0.49 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 054 0.54 054 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 055
0.34 0.37 0.39 0.41 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.48 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 054 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 056 0.56 0.56
0.34 0.37 0.40 0.42 0.43 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56
0.34 0.37 0.40 0.42 0.43 0.45 0.46 0.47 0.48 0.48 0.49 0.50 0.50 051 051 0.52 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 055 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0,56 0.56 0.56 0.56 0.57
0.35 0.38 0.40 042 0.43 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.52, 0.52 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.54 055 0.55 0.55 0.55 056 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57
0.35 0.38 0.40 0.42 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.49 0:50 0.51 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.55 056 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57
0.35 0.38 0.40 0.42 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 0.50 0.51 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58
0.35 038 0.40 0.42 0.44 0.45 0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 0.51 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.53 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58 0.58 0.58
0.35 0.38 0.40 0.42 0.44 0.45 0.47 0.48 0.49 0.49 0.50 0.51 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 056 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58
0.35 0.38
0.35 0.38 0.41 0.43 0.44 0.46 0.47 -0.48 0.49 0.50 0.50 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55" 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.59 0.59 0.59
0.35 038 0.41 0.43 0.44 0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 0.51 0.51 0.52 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.59 0.59 0.59 0.59
0.~1
0.43 0.44 0.46 0.47 0.48 0.49 0.50 0.50 0.51 0.52 0.52 0.53 0.53 0.54 0.54 0.54 0.55 0.55 0.55 0.56 0.56 0.56 0.56 0.57 0.57 0.57 0.57 0.57 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.58 0.59
COMENTARIOS RESPECTO A LOS CALCULOS y REGLAS DE REDONDEO.
Todos los cálculos llevados a cabo parten delos resultados demanera tabular, los cuales sedenominan datos primarios. En el caso del % de recobro, por omisión los cálculos se redondearon a 2 decimales. Los cálculos según las fórmulas, fueron llevados a cabo con una hoja de cálculo; y sereportan hasta 2 decimales más de los datos primarios. Puede ser que al verificar los cálculos con ayuda de una calculadora de bolsillo, estos puedan diferir de los aquí reportados, ya que la hoja decálculo efectúa las operaciones hasta con una precisión de 15decimales. Se sugiere que en los cálculos que usted lleve a cabo al analizar los datos primarios y llegue a utilizar calculadora de bolsillo, como minimo maneje 4 decimales más que el de los datos primarios y que el resultado final, lo redondee como mínimo alnúmero dedecimales asociados al delos datos crudos. Para redondear observe las siguiente reglas: 1) Determinar al decimal a redondear, al cual vamos a definir como X Por ejemplo, si sevaa redondear a 3 decimales, X vale 3. 2) Determinar en el valor, el decimal X+1. En nuestro ejemplo corresponde al decimal 4. 3) Determinar el valor del decimal X+1 del número. Por ejemplo el número 3.23456 El valor del decimal 4 deeste número es5. 4) Siel valor del decimal X+1 es 5 o más, el decimal X seredondea al siguiente entero osi el valor del decimal X+1 es 4 o menos, el valor del decimal X semantiene.
._4,
En nuestro ejemplo ya que el cuarto decimal es5, el valor del decimal 3,que en este entero, por lo que elnúmero 3.23456, seredondea a 3.235, considerando redondearl Ejemplos: 102.6731 redondeando a 2 decimales es 102.67. 102.6761 redondeando a 2 decimales es 102.68. 0.0050 redondeando a 2 decimales es0.01 0.0041 redondeando a 2 decimales esO
....
se redondea al siguiente
ales.
El Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C.
AGRADECE EL APOYO DE .
Boehringer - Ingelhelm Pro
Laboratorios de Contro .
Lambda Cien
(Q\
~IIIIIII
Boehringer 1
PromeCO¡
L\ ~~2 i.aboratorio de
A