Guía de Virología

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA DE AMÉRICA FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

GUÍA DE PRÁCTICA DE VIROLOGÍA (Código: TO 4023)

AÑO ACADÉMICO: 2014-II

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

Profesora Responsable del Curso: Zila Patricia Caballero Ñopo Profesores que participaron en la elaboración elaboración de la Guía de Práctica: Práctica: Ávila Arosemena, Julia Graciela Caballero Ñopo, Patricia Cabezas Sánchez, Cesar Chávez Perez, Victor Manuel Cuadra Koshansky, Ana Luisa Espinoza Silva, Maximo Manuel García Mendoza, María Paquita González Collantes, Sofía León Sandoval, Segundo Marocho Chahuayo, Luis Peralta Chirinos, Marilú Reyes Puma, Nora Valencia Bazalar, Esther L. Wong Chero, Paolo

2


ÍNDICE

PRÁCTICA 1º.

VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS ...................................................................... 5

PRÁCTICA 2º.

ESTERILIZACIÓN, DESINFECCIÓN Y ANTISEPSIA..................................................... 7

PRÁCTICA 3º.

PREPARACIÓN DE MATERIALES Y SOLUCIONES.................................................... 9

PRÁCTICA 4º.

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES M ATERIALES Y SOLUCIONES ................................................ 14

PRÁCTICA 5º.

IDENTIFICACIÓN, CODIFICACIÓN, PRESERVACIÓN, CONSERVACIÓN CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS................................................................. MUESTRAS ................................................................. ................16 ................ 16

PRÁCTICA 6º.

SANGRADO DE ANIMALES ...................................................................................... ANIMALES ......................................................................................18 18

PRÁCTICA 7º.

INOCULACIÓN DE ANIMALES....................................................... ANIMALES ....................................................... ...........................21 ........................... 21

PRÁCTICA 8º.

HUEVO EMBRIONADO, ANATOMIA Y VIAS DE INOCULACION. INOCULACION. ............................. 25

PRÁCTICA 9º.

PREPARACIÓN DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO PRIMARIO ...................................................28 .................................................. 28

PRÁCTICA 10º.

CULTIVO CELULAR SECUNDARIOS Y EFECTO CITOPÁTICO ..................................... CITOPÁTICO ..................................... 32

PRÁCTICA 11º.

BIOLOGÍA MOLECULAR EN VIROLOGÍA ............................................................. .....40 .....40

PRÁCTICA 12º.

LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ..................................................... .....................................................40 40

PRÁCTICA 13º.

INMUNOFLUORESCENCIA............................................................ INMUNOFLUORESCENCIA ............................................................ ...........................47 ........................... 47

PRÁCTICA 14°.

ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay ) ...................................................48 ................................................... 48

PRÁCTICA 15º.

WESTERN BLOT BLOT ...................................................................................................... ......................................................................................................52 52

PRÁCTICA 16º.

HEMAGLUTINACIÓN VIRAL Y SU TITULACIÓN ....................................................... TITULACIÓN .......................................................55 55

PRÁCTICA 17º.

PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN ............................................. HEMAGLUTINACIÓN .............................................57 57

PRÁCTICA 18º.

PAUL BURNELL - TITULACION ................................................................................. TITULACION .................................................................................59 59

PRÁCTICA 19º.

INOCULACIÓN DE ENTEROVIRUS EN CULTIVOS DE CELULAS -

PRÁCTICA 20º.

HEPATITIS VIRAL - DIAGNÓSTICO ........................................................................... DIAGNÓSTICO ........................................................................... 64

3


4


PRÁCTICA 1º. 1.

VISITA AL LABORATORIO DE VIRUS

INTRODUCCIÓN Los virus son agentes infecciosos que miden de 20 a 300 nanómetros, en su genoma contienen una clase de ácido nucleíco (ADN o ARN). Los virus son inertes en el medio extracelular y se replican sólo en células vivas, siendo parásitos obligados

Los virus han desarrollado mecanismos para sobrevivir en la naturaleza y transmitirse de un huésped a otro, e incluso pueden infectar durante el trabajo al personal de laboratorio

En las clases práctica del capítulo de virus se tratará de facilitar el aprendizaje de Algunas técnicas de laboratorio que permitan colaborar en el diagnóstico de las enfermedades causadas por las infecciones virales y en el desarrollo de trabajos de investigación

Los métodos y técnicas se modifican de acuerdo con el avance de la ciencia, la biotecnología ha logrado implementar nuevas técnicas que ahorran material y tiempo en el proceso del diagnóstico, para determinar la presencia de antígenos virales y/o anticuerpos antivirales

2.

LABORATORIO DE VIRUS En un laboratorio de virus se deben seguir estrictamente las normas de bioseguridad, para evitar las infecciones durante el trabajo El laboratorio de virus debe indicar los procedimientos adecuados para la toma de muestras y la forma como se debe enviar al laboratorio Las muestras deben estar adecuadamente conservadas para evitar su deterioro El personal debe estar bien instruido en el manejo y procesamiento de cada tipo de muestras En un laboratorio de virus el ambiente de desinfección, lavado, preparación de material y esterilización juega un rol importante en el trabajo virológico. Este paso cada día se simplifica con el uso de material descartable, pero todo el material no puede ser descartable por lo que indispensable el buen lavado y esterilización

5


3.

EQUIPOS INDISPENSABLES Cabina estéril, flujo laminar, centrífuga, centrífuga refrigerada, incubadoras, incubadoras de CO2, Baño María, lector de ELISA con impresora, bomba de vacío, lavador automático, autoclave, horno estéril, lavador de pipetas, destilador de agua, bidestilador, potenciómetro, balanza, refrigeradoras, congeladoras de -4 y -70 C, depósito de nitrógeno líquido , filtros antibacterianos, etc.

4.

MATERIAL DE TRABAJO De vidrio y/o descartable

5.

MATERIAL BIOLÓGICO Cepas de células, cepas de virus, sueros normales, sueros inmunes, antibióticos, vitaminas, aminoácidos, medios de cultivo

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PRÁCTICA 2º.

ESTERILIZACIÓN, DESINFECCIÓN Y ANTISEPSIA

ESTERILIZACIÓN

1. Introducción Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria. Métodos:

2.



Físicos



Químicos



Filtración



Agentes esterilizantes y desinfectantes

Métodos físicos:

2.1

Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

2.1.1

Calor seco

2.1.2



Mechero de bunsen



Estufas:

Calor Húmedo

2.2



Autoclave



Tindalización

Radiaciones: Rayos Ultravioletas. 

7




3.

Rayos Gamma:

Métodos Químicos: Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

4.



Oxido de etileno:



.Aldehídos:



Glutaraldehído



Formaldehído



Esterilización por gas-plasma de Peróxido de Hidrógeno

Filtración: Este método consiste en usar membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Tipos de Filtros

5.

a.

Filtros profundos o Filtros de profundidad

b.

Membranas filtrantes

c.

Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo)

Agentes esterilizantes y desinfectantes

5.1 Antisépticos Alcohol (etílico o isopropílico) 70-90% Yodo 1-2 mg yodo libre en un L. Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros Órgano Mercuriales Colorantes

8

5.2 Desinfectantes o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehídos Oxido de Etileno Compuestos Fenólicos Ácidos y Álcalis


PRÁCTICA 3º. 1.

PREPARACIÓN DE MATERIALES Y SOLUCIONES

PREPARACIÓN DE MATERIALES En la preparación de material hay que considerar las siguientes etapas: 1. La desinfección 2. El lavado 3. La preparación 4. La esterilización

2. SOLUCIONES EMPLEADAS EN VIROLOGÍA 2.1 INTRODUCCIÓN Para el aislamiento y mantenimiento de los virus en el laboratorio, se requiere hacer uso de sistemas biológicos, los cuales sufren cambios como expresión de la actividad viral Las células cultivadas en el laboratorio sirven como un medio de estudio de agentes virales de algunas enfermedades, el mantenimiento de las líneas celulares que se emplean en el laboratorio de diagnóstico virológico debe hacerse bajo determinadas condiciones de temperatura, humedad, aporte de nutrientes, concentración de sales, pH y debe estar libre de contaminación en todo momento Las soluciones que a continuación se preparan serán de gran utilidad para conservar “in Vitro” las líneas celulares en mención

2.2

PROCEDIMIENTOS

2.2.1

INSUMOS

2.2.1.1

Químicos Ca Cl2 Ca Cl2. 2H2O H2O C6 H12 O6 KCl KH2PO4 Mg SO4. 7 H2O. Na HCO2 Na Cl Na2 HPO4 Mg Cl 2 6H2O

9

Cloruro de Calcio anhidra Cloruro de Calcio Hidratado Agua Bidestilada Glucosa anhidra Cloruro de Potasio Fosfato de Potasio Sulfato de Magnesio Bicarbonato de Sodio Cloruro de Sodio Sodio Fosfato dibásico Hexahidrato de cloruro de Magnesio


2.2.1.2 2.2.2

Indicadores Rojo de fenol SOLUCIONES Pesar minuciosamente, la cantidad precisada para cada componente en las formulas de las soluciones a preparar. Realizar las combinaciones según se especifica para cada solución. SOLUCION DE HANKS Composición de las soluciones madres: Solución A:

Solución B:

Solución C:

Solución D:

Solución E:

Na.Cl.

100 gr.

KCl

5 gr.

Mg SO4. 7 H2O.

2.5 gr.

Agua bidestilada c.s.p.

500 ml

KH2PO4

0,75 gr.

Na2 HPO4

0,75 gr.

Agua bidestilada c.s.p

200 mL.

Ca Cl2 anhidra

1,75 gr.

Ca Cl2. 2H2O

2,3 gr.

Agua bidestilada c.s.p

200 mL.

Agua bidestilada.

100 mL

Glucosa anhidra.

20 gr.

Na HCO2

1,4 gr.

Rojo de fenol

0,04 gr.

Agua bidestilada c.s.p.

100 mL

Las soluciones A,B,C, serán esterilizadas en autoclave a 110º C por 10 minutos. Las soluciones D y E serán esterilizadas por filtración en filtros de Setz. Las soluciones madres serán conservadas a temperatura de +4 grados centígrados. Preparar en un litro de la solución isotónica de Hanks mezclar: Solución A 40 mL Solución B 40 mL Solución C 20 mL Solución D 5 mL Solución E 20 a 25 mL Agua bidestilada c.s.p 1000 mL 10


SOLUCIÓN P.B.S (Phosphate Buffered Saline) SOLUCIÓN S FOSFATO SALINA Composición de las soluciones madres: Solución A: Na Cl KCl Na2 HPO4 NH2 HPO4 . Agua bidestilada c.s.p.. Solución B: Ca Cl2 anhidra. Ca Cl2. 2H2O . Agua bidestilada c.s.p Solución C: Mg Cl 2 6H2O Agua bidestilada c.s.p

8 gr. 0,2 gr. 1.15 gr. 0,2 gr. 800 mL 0,1 gr. 0,132 gr. 100 mL. 0,1 gr. 100 mL

Combinar las soluciones madres en el siguiente orden: 1. 2. 3. 4. 5.

2.2.3

Mezclar las soluciones A y C Agregar lentamente la mezcla A + C a la solución B y agitar Esterilizar por filtración en la bujía de Chamberland Autoclavar por separado las soluciones A, B y C a 100º C durante 10 minutos. Conservar a + 4ºC

SOLUCIONES EMPLEADAS PARA FACILITAR EL DESPRENDIMIENTO CELULAR DE LA SUPERFICIE DEL TUBO Solución de Tripsinas al 0.25 por 100 Tripsina Solución de Hanks (sin la solución E)   

2.2.4

Preparar la solución Mantener en reposo durante 2 horas a +4º C hasta que clarifique. Filtrar con el Filtro de Seitz y conservar a -20º C.

SOLUCIONES PARA AJUSTAR EL PH DEL MEDIO Solución de bicarbonato con rojo de fenol Rojo de fenol Bicarbonato de Sodio Agua bidestilada c.s.p   

11

2.5 gr. 1000 mL.

Preparar la solución Filtrar en la membrana de Seitz Conservar a temperatura ambiente

0,004 gr. 3,92 gr. 100 mL


2.2.5

SUPLEMENTOS NUTRITIVOS Solución de glucosa al 9% Glucosa Agua bidestilada c.s.p

9 gr. 100 mL

Solución de Tryptosa Phosphate Broth (TPB) a 3% Caldo Triptosa Fosfato 3% TPB 3 gr. Agua bidestilada c.s.p 100 mL Solución de Bacto tryptosa al 10% Bactotrytosa Agua bidestilada c.s.p

10 gr. 100 mL

Solución de Extracto de Levadura al 10% Extracto de levadura Agua bidestilada c.s.p

10 gr. 100 mL

Extracto embrionario El extracto embrionario de pollo es preparado a partir de huevos de pollo incubado durante 8 a 10 horas Líquido Amniótico de Bovinos Se recolecta líquido amniótico, se esteriliza y se mantiene en recipientes de 1 litro. Suero animal Se suele usar suero de aves 2.2.6

ANTIBIOTICOS Penicilina (solución de 100,000 U mililitro Penicilina 1 000,000 UI Agua bidestilada c.s.p 100 mL La solución habitualmente empleada es de 100 U.O por mililitro Streptomicina (solución de 200 000 ug por ml) Estreptomicina 1 gr. Agua bidestilada c.s.p 100 mL La solución habitualmente usada es de 50 ug por mililitro Mycostatina Micostatina Propilenglicol

200 mg 10 mL

Se vierte un mililitro de esta solución a 1000 mL de medio de cultivo al momento de su preparación 12


13


PRÁCTICA 4º.

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y SOLUCIONES

1.

INTRODUCCIÓN

1.1

De la descontaminación La descontaminación, tiene como objetivo disminuir la carga microbiana de los materiales de vidrio (placas, pipetas y otros ) dejándolos seguros para su manipulación. El término se aplica a artículos contaminados durante la atención de pacientes o por contacto con fluidos corporales o materia orgánica presente en artículos contaminados. La descontaminación se logra a través de la eliminación de la materia orgánica con métodos de limpieza estandarizados.

1.2

De la limpieza La limpieza disminuye la carga microbiana por arrastre pero no destruye microorganismos. Puede realizarse a través de métodos manuales o automáticos. La tendencia actual en las centrales de esterilización es la automatización de los procesos de lavado con el fin de lograr mayor estandarización y disminuir los márgenes de error.

1.3

De la Desinfección Es la destrucción de formas vegetativas de microorganismos en objetos inanimados y no necesariamente esporas. Se realiza por métodos químicos o físicos. La desinfección de alto nivel implica la eliminación total de toda forma de vida microbiana excluyendo sólo las esporas bacterianas. Existen agentes desinfectantes que no tienen capacidad para la destrucción completa de todos los microorganismos vegetativos, en este caso la desinfección que se obtiene se califica como de nivel intermedio o bajo. Estos últimos niveles de desinfección tienen muy poca aplicación práctica en la actualidad.

1.4

De la Esterilización Es la eliminación completa de toda forma de vida microbiana de objetos inanimados incluyendo esporas. Puede conseguirse a través de métodos físicos, químicos o gaseosos.

14


1.5

Del Almacenamiento Proceso a través del cual, los artículos son conservados hasta su uso. Las condiciones de almacenamiento deben asegurar la esterilidad o desinfección del artículo al momento del uso.

1.6

De la Preparación/empaque Etapa en que los materiales son preparados y empaquetados en condiciones que se facilite su uso y se eviten daños y deterioro del material.

15


PRÁCTICA 5º.

IDENTIFICACIÓN, CODIFICACIÒN, PRESERVACIÓN, CONSERVACIÓN

Y

TRANSPORTE DE MUESTRAS

1.

MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO POR AISLAMIENTO VIRAL Los virus son muy frágiles, son agentes intracelulares obligados y por lo tanto no pueden sobrevivir sino es dentro de una célula viva Fuera del huésped los virus se inactivan rápidamente por la luz UV, agentes químicos, pH y temperatura Las muestras para diagnóstico de virus deben de manejarse asépticamente a fin de prevenir la contaminación bacteriana

2.

MUESTRAS PARA DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Componentes del suero de la sangre recogida durante la fase aguda para demostrar clases específicas de anticuerpos Ig M, para diagnóstico presuntivo Componentes del suero de la sangre recogidas durante la fase aguda y de convalecencia de la enfermedad, para demostrar el incremento en el título de anticuerpos específicos para el virus, o la seroconversión, lo que nos da un diagnóstico concluyente

3.

PRESERVACIÓN DE MUESTRAS DE SUERO PARA DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN VIRAL El suero debe mantenerse refrigerado hasta que pueda ser almacenado a -20 º C para el análisis de anticuerpos

4.

ETIQUETADO DE MUESTRAS Usar etiquetas generadas por computadoras, lápiz de cera, o tinta indeleble, para asegurarse que la etiqueta no se manchará cuando sea sometida a la humedad El almacenamiento de muestras debe realizarse en cajas para viales, las cuales estarán adecuadamente rotuladas con el tipo de muestra, códigos y tipo de estudio Debe haber un mapa en el banco de sueros para localizar las muestras en el congelador

5.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS DE VIRUS Y ANTICUERPOS 16


La muestra para el aislamiento viral debe ser diluida en una solución salina y balanceada (1/5) complementada con suero animal (similar al suero de feto de carnero) y antibióticos El suero es comúnmente diluido a 1/10 en una solución salina balanceada, complementada con una baja concentración de suero animal y antibióticos para análisis de anticuerpos El suero debe ser calentado a 56 C por 30 minutos para inactivar reactantes no específicos para análisis de anticuerpos

6.

MEDIO DE TRANSPORTE Composición: E-MEM con Sales Hank´s

10 gr.

Suero bovino Fetal

20 mL.

Solución Antibiótico, antimicótico

10 mL

Agua Bidestilada estéril

970 mL

Procedimiento: 

Se disuelve el E-MEM con sales de Hank´s con el agua bidestilada y finalmente se agrega el suero bovino fetal y la solución de antibiótico antimicótico.



Se filtra toda la solución



Se dispensa 2,5 mL en un vial de 5 mL de capacidad



Se controla por 24 hs. A 37º C



Finalmente se almacena a -20º C.

Existen en el mercado Sistemas de obtención y transporte de muestras comerciales.

17


PRÁCTICA 6º. 1.

SANGRADO DE ANIMALES

INTRODUCCIÓN La toma de sangre en los animales de experimentación puede ser de la carótida, esta operación se practica cuando hay que recoger gran cantidad de sangre o la totalidad. El conejo se inmoviliza sobre la mesa con el vientre hacia arriba mientras que de la vena marginal del conejo se obtiene una pequeña cantidad de sangre. También pequeñas cantidades de sangre se pueden obtener de un ratón, se le corta la punta de la cola y se recoge la sangre que sale. En algunas ocasiones se requiere una cantidad considerable de suero de Cobayo (complemento), entonces se recurre a la sangría total del animal que puede ser por decapitaci6n que es más rápida que por extracción desde la carótida. Se afeita el pelo que circula el cuello del cobayo y se desinfecta bien la piel, para luego decapitarlo; la sangre que emana es recogida en embudos con tubos estériles. Para practicar esta operación el animal debe estar en ayunas.

2.

MATERIALES 1 1 2 1 1 1

conejo joven de aproximadamente 2 Kg jeringa hipodérmica de 10 mL con aguja N* 21 o 22 x 1,5. tubos de 13 x 100 o 16 x 150, estériles. fco con Xilol, éter. bolsa colectora con anticoagulante (comercial de aproximadamente 50 mL) o Erlenmeyer estéril de 250 mL de capacidad con citrato de sodio al 3.8 %, 60 mL para 50 mL de sangre.

2 tijeras.

3.

PROCEDIMIENTO Los materiales usados para el sangrado deben ser estériles con la precaución necesaria de proteger al operador y al material que se está obteniendo.

3.1

De la vena marginal de la oreja del conejo 

Colocar al conejo de manera que no se mueva libremente, y con la oreja extendida.



Transiluminar la oreja y limpiarla con alcohol al 70%. Suavemente presionar la oreja con los dedos de manera que los vasos se dilaten.

18




Hacer un corte de aproximadamente 0,5 cm. de longitud con una hoja estéril hasta que se produzca la coagulación espontánea. No se debe sangrar más de 20 mL x kg peso x semana. También puede obtenerse un menor volumen de sangre usando una jeringa con aguja delgada.

3.2

Del corazón del conejo 

Colocar al animal sobre una mesa y agarrarlo de manera que no pueda moverse. Darle una ligera anestesia con éter.



Ubicar el área del corazón (donde se perciben mejor los latidos cardiacos).



Desinfectar con solución yodada.



Introducir la aguja, conectada a una jeringa estéril, en el punto de mayor latido



El ingreso de sangre en la jeringa indicará que se está en la cavidad cardiaca.



Extraer lentamente 10 a 20 mL de sangre.



Traspasar a un tubo estéril para la separación del suero.



Retirar la aguja después de la extracción y hacer presión con un algodón en la zona por algunos minutos. Si es necesario colocar al animal con la cabeza hacia abajo hasta que se recupere.

Existe el riesgo que el animal muera durante el

procedimiento sobre todo si es hecho por personal con poca experiencia.

3.3

De la vena yugular en carneros 

Inmovilizar al carnero en posición de pie o echado lateralmente, nivelar la cabeza hasta que la nariz y el centro del cuello formen una línea recta. voltear la cabeza ligeramente y separar, eliminar la lana del área de puntura. Puede ser necesario cortar la lana.



Aplicar presión digital por sobre la clavícula para producir dilatación de la vena yugular externa. Esterilizar el área donde se localiza la vena, con solución yodada débil o alcohol al 70%



Aplicar presión digital debajo del punto donde se hará la puntura e insertar la aguja estéril dentro de la piel y luego dentro de la vena. Portar el frasco recolector continuamente durante la colección de sangre y por 5 minutos después de la extracción para prevenir la formación de coágulos.

19




Dejar enfriar la sangre a temperatura ambiente. Dispensar la sangre asépticamente en tubos o frascos estériles y guardar en refrigeración hasta su uso.



20

Después de retirar la aguja presionar la zona con un algodón por unos minutos.


PRÁCTICA 7º. 1.

INOCULACIÓN DE ANIMALES

INTRODUCCIÓN La inoculación de muestras problema sospechosas de etiología viral, en animales de laboratorio, nos sirven para el aislamiento de los virus. Los virus que no se logran cultivar en medios artificiales, se cultivan rápidamente en animales de laboratorio. En algunos casos se observan los efectos que produce en el animal inoculado, en otros casos después de un cierto tiempo muere el animal al cual se estudia para evidenciar la enfermedad (a partir de diferentes órganos se preparan frotices, se realizan cultivos y se realizan estudios macro y microscópicos), en otros casos el animal no muere, pero se le realiza un examen de sangre y de otros líquidos corporales tomándolos a diferentes tiempos para observar los cambios que se producen

Otra utilidad es para la preparación de antígenos, titulación de virus, producción de sueros inmunes, obtención de glóbulos rojos de carnero necesario para al gunas pruebas de laboratorio (hemaglutinación)

Los animales de laboratorio más conocidos son: conejos, cobayos, ratones, ratas blancas y hámsteres

A los conejos se les utiliza para producir antisueros contra los virus y cuando se necesita en grandes cantidades a veces se utilizan caballos y ovejas

2.

MATERIALES 2 ratones de 8 a 12 semanas de edad respectivas jaulas. 1 tubo de suero fisiológico estéril. 2 pares de guantes descartables. 1 frasco con algod6n. 1 frasco con alcohol de 70% o alcohol yodado 1 marcador 1 contenedor para descartar el material con solución desinfectante. 2 hojas de bisturi estériles. 21


3.

PROCEDIMIENTO Desinfectar con alcohol de 70% o alcohol yodado el sitio de la inyección, la mayor



parte de las veces se necesita rasurar esta área. Con los guantes puestos, coger al ratón por la cola y con ayuda de la otra mano agarrar



de la parte posterior del cuello de manera que finalmente quede inmovilizado con una sola mano y con la otra se proceda a la inoculación. 

Inocular 0,2 mL de suero fisiológico estéril por todas las vías citadas.



Marcar los animales inoculados y controles con algún colorante y colocar en sus jaulas adecuadamente rotuladas.



Colocar los materiales usados en recipientes con desinfectante.



Autoclavar y se descartar los materiales usados.

Es necesario conocer las vías de inoculación dependiendo del virus y del animal a ser usado. También es importante la edad del animal de acuerdo a los requerimientos, por ejemplo ciertos virus requieren de ratones lactantes para su replicación y posterior aislamiento, en cambio para casos de inmunización se prefiere conejos de 24 meses Las vías de inoculación más comunes son: 3.1

Epidérmica.- Se escoge una parte del cuerpo que cl animal no pueda rascar o lamer: la piel de la espalda o de la parte posterior de la oreja. Afeitada o desinfectada la zona de la piel, se practican con el bisturí escarificaciones lineales muy superficiales, de medio centímetro de longitud, también se puede usar un papel de lija, se lleva a la parte así preparada la sustancia o virus que se debe inocular. Se unta y se hace penetrar por fricción.

3.2

Intracardiaca.- Se inyecta en el área del corazón donde se perciben los latidos.

3.3

Intracraneana.- Para esta vía se inocula 0,03 ml en la fontanela del ratón. La aguja debe ser fina, de preferencia curva, se introduce verticalmente a través de la pared craneal evitando dañar la corteza cerebral. Se puede clavar primero la aguja, luego cuando se ha comprobado que la aguja está bien, se adapta con cuidado la jeringa que contiene el líquido que hay que inyectar. 22


3.4

Intradérmica.- Se clava la aguja, que debe ser finísima, en la dermis, teniendo cuidado de no pasar de ella y se inyecta el líquido Intramuscular: Se introduce la aguja casi perpendicularmente en la masa muscular del muslo o sobre la masa muscular de la raíz de la cola del ratón

3.5

Intraperitoneal: El animal se debe poner en una posición oblicua en que la masa intestinal se coloca en la parte superior de la cavidad abdominal, la pared abdominal debe estar hacia el operador. Se inyecta en la parte baja del vientre en forma oblicua de 4 a 5 mm, se atraviesa la piel y se siente una sensación de caer en cavidad libre. No hay así riesgo de herir los órganos internos.

3.6

Intravenosa: Para el caso de ratones y ratas se inyecta en la vena de la cola. En el caso de conejos puede hacerse en la vena marginal externa de la oreja, generalmente se usa para éste último aguja calibre 25. La aguja debe insertarse en la dirección del flujo de la vena, hacia la base de la oreja, colocando la inyección inicial cerca del extremo y las posteriores cada vez más cerca de la base para evitar la cicatrización del tejido dado que en general las muestras de sangre se toman también de la oreja, debe utilizarse una oreja para las inyecciones y la otra para extraer las muestras-. La oreja se sostiene con la mano izquierda, y se apoya la aguja en el pulgar en el punto de introducción durante la inyección. La aguja se coloca con el bisel hacia arriba con un ángulo no menor a 45 hacia la superficie de la oreja. A medida que se introduce el líquido, la vena se dilata en forma evidente. Cualquier resistencia en el flujo indica que la aguja no está insertada en la vena. De ser así, no se debe aplicar una mayor presión, pues el líquido penetrará en el tejido perivascular y estropeará la oreja.

3.7

Retroocular.- Se clava la jeringa provista de una aguja muy curvada en el ángulo externo del ojo. La concavidad de la aguja se desliza por la pared ósea de la órbita, pasando por delante de la glándula lacrimal. Para inyectar cantidades de líquidos superiores a 0,5 cc la inyección será bilateral, la absorción es por lo demás rápida.

23


3.8

Subcutánea: La aguja puede ser introducida tangencialmente a la piel (bajo la piel, observándose la formación de una ampolla en el punto de la inoculación, la punta de la aguja debe correr hacia los costados pero no debe atravesar los músculos

24


PRÁCTICA 8º. 1.

HUEVO EMBRIONADO, ANATOMIA Y VIAS DE INOCULACION.

INTRODUCCIÓN Muchos de los virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en células vivas Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio embrión.

2.

ANATOMIA Anatómicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura las siguientes partes:

3.

VIAS DE INOCULACIÓN Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar, depende del agente (virus o rickettsias) que va a ser inoculado

Con el objeto de visualizar las cavidades se inoculará un colorante por vía alantoidea y otro por vía amniótica. También se inoculará por vía del saco de yema o saco vitelino

25


Descripción de las áreas en el huevo embrionado: 1 embrión 2. Cavidad Amniótica 3. Saco Vitelino (yema) 4 Albumina (clara) 5. Cavidad Alantoidea 6. Membrana corioalantoidea 7. Membrana externa 8. Cascara y 9 saco de aire

4. 4.1

PROCEDIMIENTO Materiales Huevos embrionados de 7 a 8 días y de 10 a 12 días 

4.2



Alcohol yodado



Pinzas de disección



Jeringas de tuberculina con aguja



Punzones de acero



Tijeras curvas



Fucsina al 1 % en agua destilada



Azul de metileno al 1 % en agua destilada



Placas de petri



Solución fisiológica



Ovoscopio



Cinta adhesiva

Procedimiento

4.2.1

Inoculación por vía alantoidea 

En huevos embrionados de 10 a 12 días, determinar mediante el ovoscopio el límite de la cámara de aire y colorear una marca entre dos vasos sanguíneos de la membrana corioalantoidea, esta estaría aproximadamente a 1 cm. por debajo de la cámara de aire



26

Desinfectar la cáscara con alcohol yodado sobre la cámara de aire




Usando un punzón estéril hacer un pequeño agujero con cuidado en las zonas marcadas



Introducir la aguja de jeringa de 1ml. cargada con fucsina (aproximadamente ¼ de la aguja) en un ángulo de 45 grados, e inocular 0,2 ml del colorante



Cortar con tijeras la cáscara siguiendo la marca que señala la cámara de aire, levantar la membrana corioalantoidea y observar el líquido alantoideo coloreado, el cual se elimina vertiéndolo en un petrí con cuidado

4.2.2

Inoculación por vía amniótica En un huevo de 10 a 12 días, marcar mediante el ovoscopio el embrión y la 

cámara de aire 

Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire por encima del embrión



Hacer una perforación rectangular de 0,5 cm2



Dejar caer una gota de solución fisiológica estéril



Con unas pinzas curvas introducir a través de ésta área dentro de la cavidad alantoidea, cogiendo al membrana amniótica hacia arriba, formar una pequeña “tienda” en cuya base se inyecta 0,2 ml de un colorante o del inóculo

problema 

4.2.3

Se tapa la abertura con cinta adhesiva

Cosecha Con tijeras cortar la cáscara a nivel del límite de la cámara de aire 



Se descarga el líquido alantoideo luego con pipeta Pasteur se extrae el líquido amniótico. En caso de no haber líquido, hacer un lavado con suero fisiológico estéril (1ml) y luego se colecta este líquido

27


PRÁCTICA 9º. 1.

PREPARACIÓN DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO

INTRODUCCIÓN Los diferentes tipos de células tienen diferentes requerimientos de crecimiento, pero en todos los casos el medio que las rodea debe suministrar todos los nutrientes esenciales. La temperatura, pH, osmolaridad y humedad deben ser mantenidos dentro de ciertos límites. Además sustancias tóxicas o inhibitorias no deben estar presentes o permitir que se acumulen. La adición de suero al medio basal como fuente de factores de crecimiento macromoleculares es esencial para el crecimiento de muchos tipos celulares. Las células dependientes de anclaje (unión firme) requieren de una superficie para fijarse que no sea tóxica y biológicamente inerte.

Después de colocar una semilla en un recipiente para cultivo nuevo y fijado a la superficie, las células entran a la fase de regazo durante la cual no hay aumento en el número de células. Posteriormente ésta es seguida de una fase logarítmica de crecimiento, con un aumento exponencial en el número de células y actividad metabólica. La duración de la fase logarítmica varía entre los tipos celulares ya que los diferentes tipos de celulares ya que los diferentes tipos de células se dividen a diferentes índices (tiempo de generación). Se alcanza una fase estacionaria cuando los nutrientes se agotan y los desechos o productos tóxicos se acumulan. El número de células permanece constante, esto a menudo sucede cuando se alcanza la confluencia. El cultivo celular se denomina confluente cuando las células ocupan toda el área de crecimiento disponible. Algunas células son sensibles a la inhibición por contacto (inhibición de la proliferación debido al contacto de célula a célula resultante de la confluencia) mientras otros tipos, como las células tumorígenas no son sensibles. Las células se afectan desfavorablemente y de manera eventual morirán si se permite la acumulación de productos de desecho. Las células son pasadas (subcultivadas) para mantener la viabilidad y condiciones de cultivo celular óptimos. El número de pasajes se refiere al número de veces que las células se han subcultivado o transferido desde que se obtuvo el cultivo celular

28


TIPOS DE CULTIVOS CELULARES 1.1

Cultivos Primarios Son aquellas células recientemente aisladas a partir de tejidos u órganos y suelen tener una duración limitada en cultivos llamados cultivos celulares finitos.

- Tejidos fetales, adultos normales - Tejidos tumorales - Primer cultivo: Fibroblastos, epiteliales u otras células 1.2

Cultivo de Líneas Celulares

1.2.1

Semicontinuas (Células diploides): son subcultivos sub- siguientes de cultivo de células primarias de tejidos diploides normales. Puede cultivarse hasta 50 generaciones, poseen el cariotipo normal; diploide, se usa para producir vacunas y para diagnóstico (HDCS, MRC-9, WI.38)

1.2.2

Continuas:

Son células aneuploides transformadas o de tejidos tumorales, se

mantienen in vitro por tiempo prolongado por medio de cultivos repetidos (propagación indefinida). No se usan para vacunas. Cultivo de Linfocitos: Linfocitos B inmortalización (Virus EB), Linfocitos T Interleukina2

2.

1

CULTIVOS Cultivos Primarios

Caja de Instrumentos: 1 tijera curva 1 1 pinza diente de ratón 1 1 pinza de disección 8 Alfileres 1 soporte de disección 29


Material de vidrio y otros 2 placas petri pequeñas con papel filtro 1 beaker de 50 Ml 1 Erlenmeyer con barra magnética de 50 mL 1 embudo con gasa 1 tubo de centrífuga 10 mL de tripsina 0.25 % 1 lamina porta objeto 1 pipeta pasteur 1 frasco de colorante, cristal vileta o azul de Tripán 1 frasco con éter 1 frasco con medio de lavado (PBS) 1 frasco con medio de cultivo

2.1.1

Procedimiento 1

Sacrificar al ratón o hámster, usando una campana con éter.

2

Extraer los riñones con asepsia y adecuada técnica quirúrgica inmediatamente después de la muerte.

3

Colocar en la placa petri con el medio de lavado hasta cubrir.

4

Hacer un corte transversal, seleccionar trozos de corteza eliminar la médula y lípidos.

5

Pasar a la otra placa petri y lavar con PBS.

6

Pasar al Beaker cortar hasta un tamaño de 2-3 mm.

7

Lavar con PBS.

8

Colocar en el Erlenmeyer con magneto el tejido triturado luego agregar 3 volúmenes de tripsina pre calentados a 37 C por volumen de tejido

9

Llevar al agitador por 30 minutos, no debe formarse espuma.

10

Descartar el sobrenadante y reemplace por un volumen igual de tripsina nueva.

30


31

11

Llevar nuevamente al agitador durante 30 minutos a temperatura ambiente.

12

Filtrar con el embudo y gasa.

13

Centrifugar a 600-700 rpm por 10 minutos

14

Descartar el sobrenadante

15

Observar viabilidad, contar 4 x 106 cel/mL

16

Resuspender 1 mL de las células en 9 mL de medio de cultivo celular.

17

Observar el cultivo diariamente.


PRÁCTICA 10º.

CULTIVO CELULAR SECUNDARIOS Y EFECTO CITOPÁTICO

LINEAS CELULARES CONTINUAS 1

Materiales 2 tubos de cultivos de células

2

Procedimiento Observar al microscopio la botella de cultivo con el objetivo de ver si el monoestrato celular es continuo y uniforme.

Frascos de Cultivo Celular

Célula cultivada

32

Cultivo Celular Normal


Cultivo de fibroblastos Monocapa epitelial del embrión o de riñón de mono verde africano.

Cultivo de células VERO sanas

33

Efecto citopático 48 horas después de la inoculación de virus sarampión


34


Se denomina efecto citopático a las alteraciones que sufre la célula por la infección viral. Los cuerpos de inclusión son la presencia de cuerpos anormales intracelulares asociados a algunas enfermedades humanas y de animales. 





Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su localización y sus características tintoriales son generalmente específicas para una enfermedad viral. Acerca de la naturaleza de estos cuerpos de inclusión, se consideran en algunos casos como conglomerados de virus infecciosos asociados a productos de reacción de la célula infectada. Cuerpos de inclusión pueden observarse en muestras tomadas directamente del paciente o en cultivos de células infectadas.

Cuerpos de Inclusión

VIRUS

NOMBRE

LOCALIZACIÓN

CARACTERISTICAS TINTORIAL

Viruela

Guarniere

citoplasma

acidófila –eosinófila (rosado)

Rabia

Negri

citoplasma

Acidófila

Fiebre Amarilla

Margarino Torres

núcleo

Acidófila

Herpes simplex

Lipschutz

núcleo

Acidófila

núcleo

basófila (azulado)

núcleo

Basófila

Citoplasma- núcleo

Acidófila

Adenovirus Citomegalovirus Sarampión

35

“Ojos de lechuza”


CULTIVO DE CÉLULAS NORMAL

Con coloración de Hematoxilina eosina (H/E).

El citoplasma se tiñe de rosado.y núcleo azulado

RABIA En corte histológico de cerebro, con coloración de H/E. Se observan inclusiones intracitoplasmáticas denominadas Corpúsculos de Negri. Virus Rabia: Neuronas con corpúsculos de Negri en su interior

ENTEROVIRUS Virus Polio – Virus ECHO – Virus Coxsakie En cultivo de células humanas (HEP-2), se observa redondeamiento y degeneración celular, picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el borde de la célula.

36


Enterovirus: Virus Coxsakie

HERPESVIRUS Se observan células gigantes multinucleadas, inclusiones eosinofílicas intranucleares denominadas Cuerpos de Lipschutz.

Herpesvirus : Cuerpos de Lipschutz

HERPESVIRUS

Tzank Test

CITOMEGALOVIRUS En sedimento de orina se observa inclusiones nucleares basófilas (azuladas) en “Ojos de Lechuza” rodeada de un halo claro con citoplasma basófilo.

37


Citomegalovirus: Inclusiones en “Ojo de Lechuza”

Se realizara una práctica de Citomegalovirus

38


ADENOVIRUS Cultivo de Células Hep – 2. Se observa agrupación de células en racimo e inclusiones basófilas intranucleares.

FIEBRE AMARILLA

Cuerpos de Councilman Necrosis hepática e inclusiones citoplasmáticas acidófilas llamadas cuerpos de Councilman y descritas en un principio en la fiebre amarilla

39


PRÁCTICA 11º.

BIOLOGÍA MOLECULAR EN VIROLOGÍA

PRÁCTICA 12º.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1 1.1

INTRODUCCIÓN Breve revisión de la historia de la Biología Molecular La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR: Polymerase Chain Reaction) es un método que forma parte de las herramientas de la biología molecular, ciencia que surge como producto de la unión de la genética y la bioquímica. Es importante resaltar que antes del descubrimiento de la PCR ya se estudiaba el ADN mediante diferentes métodos como se observa en el cuadro siguiente.

Cuadro 1. Breve revisión histórica de la biología molecular AÑO 1869 1953 1972 1973 1977 1986

DESCUBRIMIENTO Descubrimiento del ADN Estructura del ADN ADN recombinante In Vitro ADN se clona en un plásmido Secuenciamiento rápido de ADN PCR

CIENTIFICO(s) F. Miescher Watson, Crick, Franklin, Wilkins P. Berg H. Boyer y S.Cohen F. Sanger y W. Gilbert K. Mullis y col.

1.2 Métodos Moleculares empleados en Virología El impacto del uso los métodos moleculares ha sido mayor en microbiología, especialmente en el diagnóstico, seguimiento o monitoreo de los pacientes, así como genotipificación, detección de genes de resistencia entre otros. En Virología se emplean varios métodos moleculares como vemos en el siguiente cuadro: Cuadro 2. Principales Métodos Moleculares empleados en Virología MÉTODO PCR y variantes

USO Diagnóstico como: Carga Viral (Viral load- VL) aplicados en VIH, HCV, HBV, etc. Tipificación como: Detección de mutaciones, deleciones, inserciones, etc Genotipificación y detección de mutaciones, deleciones, inserciones. Desarrollo de vacunas Investigación básica 



Secuenciamiento Clonación en vectores

40


1.3

Reacción en Cadena de la Polimerasa Método desarrollado por Mullis et al, utilizó una enzima capaz de resistir a los cambios de temperatura. Pero para poder entender mejor la secuencia de trabajo en el desarrollo de la técnica de PCR revisaremos el siguiente esquema:

1.3.1

Esquema de Trabajo para el desarrollo de una PCR convencional Es común, en el aprendizaje del procedimiento de PCR, considerar solo el concepto de la amplificación de hebras de ADN molde con el uso de reactivos y la obtención de millones de copias; sin embargo existen dos procesos alrededor de la amplificación. El primero incluye la preparación de reactivos y se denomina Pre-Amplificación, en condiciones ideales se trabaja en un área libre de ADN y ARN. El segundo proceso se lleva acabo luego de la amplificación y busca visualizar el producto amplificado, usualmente se utiliza la electroforesis horizontal en agarosa (Esquema 1). Por lo antes mencionado en los laboratorios de biología molecular encontramos áreas de trabajo denominados como: pre-amplificación, amplificación y post amplificación, pero esto no constituye una regla estándar y va a depender del diseño del laboratorio y del tipo de material biológico empleado, por ejemplo se puede incluir un área exclusiva para la extracción de ADN/ARN (no incluida en el Esquema 1). Esquema 1. Esquema de Trabajo de una PCR

PRE-AMPLIFICACI N PREPARACIÓN DE REACTIVOS

AMPLIFICACIÓN DESARROLLO DE LA PCR-USO TERMOCICLADOR

POST-AMPLIFICACIÓN ELECTROFORESIS - VISUALIZACION DEL PRODUCTO

1.3.2

Componentes de la PCR-Amplificación La finalidad de este método es lograr obtener millones de copias a partir de un segmento de acido nucleíco. Para ello se requiere contar reactivos que permitan la amplificación del ADN molde:

41


a. Tampon o Buffer PCR: Contiene KCl, NaCl, Tris-HCl, BSA y detergentes no iónicos. La finalidad del uso del tampón es brindar estabilidad a la enzima ADN polimerasa, asegurar un pH apropiado en la reacción.

b. Desoxirribonucleótidos trifosfatos - dNTP :

Constituyen las “unidades” que,

agregadas, permitirán la formación de hebras nuevas de ADN, se debe buscar una concentración equimolar de dATP, dTTP, dGTP y dCTP. Las concentraciones de trabajo de dNTP en la PCR, varía entre 20-200 uM para cada uno.

c. Magnesio: Ion de Magnesio divalente (Mg 2+) es necesario para la actividad de la enzima de amplificación, ADN polimerasa. Para estandarizar los PCR se recomienda determinar la concentración apropiada de Mg2+

d. Oligonucleotico o cebador:

Conocido como “primer” permite reconocer el

segmento de amplificación usualmente se trabaja con 2 set de oligonucleótidos y brindan la especificidad al sistema

e. Enzima de amplificación: La más conocida es la Taq polimerasa obtenida de la bacteria Thermus aquaticus, pero existen otras enzimas de mayor versatilidad especialmente para la amplificación de grandes segmentos de ADN como Pfu entre otros.

f. Agua PCR o Agua MilliQ esteril: Se puede utilizar agua altamente pura sea tridestilada, desionizada, comercialmente se le conoce como agua PCR

g. ADN molde: Puede ser extraído de diferentes muestras biológicas, microorganismos aislados, entre otros.

1.3.3

Etapas de la Amplificación- PCR La PCR tiene tres etapas en base a la programación de temperatura lo que asegura mayor actividad o eficacia de los componentes de reacción:

42


a. Denaturación inicial: el principio es que a altas temperaturas por encima de 90ºC se busca “abrir” la doble hebra de ADN. La mayoría de laboratorios programa esta

etapa entre 94 – 95 ºC con un tiempo entre 2 a 10 minutos, pero el rango permitido es entre 92 – 96 ºC.

b. Ciclaje: La programación varía entre 20 a 40 ciclos 

Denaturación: Usualmente entre 94 – 95 ºC por 20 a 60 segundos busca denaturar la molécula de ADN



Hibridación: Etapa de unión de los cebadores o primer a la hebra molde, la programación varía de acuerdo a la temperatura de hibridación.



Extensión: La ADN polimerasa agrega los nucleótidos. Aunque el tiempo depende de la longitud del ADN, la temperatura óptima de actividad de la ADN polimerasa es 72ºC.

c. Extensión final: Temperatura programada 72ºC. Tiempo entre 5 a 10 min. 1.3.4

Tipos o Variantes de la PCR Los métodos moleculares han evolucionado a través del tiempo lo que nos permite contar incluso con sistemas automatizados. Los principales tipos de PCR de acuerdo a su aplicación: PCR convencional o estándar, PCR Hot Start, RT PCR (Reverse Transcription PCR), Long PCR, Nested PCR, PCR en Tiempo Real, entre los modelos automatizados comerciales tenemos: Taq Man 48 Roche, m2000 Abbott, etc.

1.3.5

Electroforesis Para verificar el producto de amplificación se utilizan métodos como electroforesis horizontal con el uso de un soporte como agarosa, tampón de electroforesis, buffer de corrida y marcador de peso molecular. El porcentaje de agarosa utilizado depende del tamaño del producto amplificado.

43


2

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS En la presente practica requerimos contar con los

2.1

Materiales Cabina de bioseguridad Cabina de esterilización PCR biología molecular Micropipeta digital rango 100-1000 uL Micropipeta digital rango 10-100 uL Micropipeta digital rango 0.5-10 uL Micropipeta digital rango 2-20 uL Sistema de Electroforesis Horizontal Sistema de documentación de geles Microcentrifuga 14,000 rpm Microondas Refrigeradora Termociclador Congelador vertical -20ºC

2.2

Reactivos Taq DNA Polymerasa dNTP's ClMg Cebadores u oligonucleotidos 1 Kb o 100 pb DNA Ladder Agua PCR Reactivo para electroforesis Buffer TAE o TBE Bromuro de etidio ADN Agarosa Lejía 10%

44


Alcohol 70% 2.3

Materiales

Guantes descartables sin talco Tips o punteras con filtro de 0.1-10 µl, 2-200 µl, 100-1000 µl, Microtubo cónico PCR 0.2 mL Microtubo cónico 1.5 ml Caja para almacenamiento 81, 9x9 Paños absorbentes Contenedor de bioseguridad Bolsas autoclave Gradilla de polipropileno Papel toalla descartable Plumón marcador Hoja de trabajo para PCR Pizetas

3

PROCEDIMIENTO PRIMERA PARTE: Duración del procedimiento 2 horas aproximadamente

3.1

Protocolo PCR

a. Prepare el protocolo de trabajo, en la hoja de trabajo, calcule el volumen de reactivos para la PCR de acuerdo al número de muestras a amplificar.

b. Siguiendo las pautas de las medidas de bioseguridad en cada ambiente de trabajo, realice la limpieza de los equipos y prepare el material siguiendo las pautas descritas en el procedimiento de limpieza de ambientes de trabajo de laboratorio.

c. Pre-Amplificación: Utilice el siguiente cuadro para el cálculo total de volumen de reactivos a utilizar en su PCR. La mezcla de reactivos se realiza en la sala A sin ADN/ARN y la adición de ADN se realiza en la sala B.

45


Master Mix componentes Buffer 10X Cl2Mg Primer forward Primer reverse (10 uM) dNTP Agua PCR o MilliQ esteril Taq ADN Volumen

Concentración 50 mM 10 uM 10 uM 10 mM 5 U/uL 0.05 -0.1ug

Volumen 2,5 uL 1,5 uL 1,5 uL 1,5 uL 0,75 uL 16,05 uL 0,2 uL 1 uL 25 uL

d. Amplificación Utilice el siguiente protocolo para la amplificación programando el uso del termociclador Protocolo PCR

T ºC

Denaturación inicial 95 ºC Denaturación 95 ºC Hibridación 55/51 ºC Extensión 72 ºC Extensión final 72 ºC

Tiempo

Ciclos

5 min 1 min 1 min 1 min 10 min

35 ciclos

SEGUNDA PARTE: Duración del procedimiento 2 horas aproximadamente

e. Post Amplificación 

Prepare agarosa al 2% en la cámara de electroforesis con el uso de peines



Mezcle 1 uL de buffer muestra con 5 uL de producto de PCR



Encienda el equipo de electroforesis entre 80 a 100 V por 45 minutos



Retire la agarosa y colóquelo en la bandeja con bromuro de etidio 1 ug/mL durante 1º minutos



Enjuague el gel



Coloque el gel de agarosa sobre el transiluminador en el equipo de documentación, realice la toma fotográfica

f.

Interpretación de resultados 

Evalúe los productos de amplificación en la fotografía, verifique el tamaño del producto y revise la “pureza” de amplificación.

46




PRÁCTICA 13º.

47

Interprete el resultado y realice el reporte respectivo.

TÉCNICA DE LA INMUNOFLUORESCENCIA


PRÁCTICA 14th.

ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorbent Assay )

Para la detección de anticuerpos del virus por técnica de ELISA son de dos tipos, para:

- Inmunoglobulina ( Ig) M - Inmunoglobulina ( Ig) G

1. ELISA = Prueba de inmunoadsorvencia ligada a enzima 2. Esta técnica nos permite poner de manifiesto la inmunoglobulina M y G 3. El ELISA para Ig M es el procedimiento más útil para la determinación de una infección reciente 4. Un resultado Ig M no reactivo e Ig G reactivo nos indica una infección antigua 5. Las muestras tomadas dentro de los primeros 6 días desde el inicio de la enfermedad tienen un porcentaje variable de falsos negativos debido al tiempo insuficiente para la detección de anticuerpo detectable 6. Lo recomendable es el estudio de muestras pareadas o sea una muestra de la fase aguda y otra muestra del período convaleciente (con una diferencia de 7 a 10 días entre una y otra muestra ) 7. Cuando se tienen muestras pareadas se deben hacer titulaciones de la muestra y su incremento, el que se mantenga estable o una caída de la titulación puede indicarnos de forma más segura el tiempo de la infección 8. Su resultado se informa como reactivo o no reactivo 9. Es fácil de realizar 10. Los antígenos son derivados de virus lisados o producidos por recombinación genética o sintética 11. Los antígenos se encuentran fijados a la fase sólida (superf. de plastico, microplacas o perlas) 12. Es una reacción inmunoenzimatica en la que la unión antígeno-anticuerpo, se pone de manifiesto a través de la acción de un enzima ligada a un anticuerpo antiinmunoglobulina, y con el substrato especifico, da una coloración cuya intensidad esta en relación a la cantidad de anticuerpos presentes

48


13. La intensidad del color se mide a una longitud de onda determinada, con el espectofotometro y se convierte en unidades de densidad optica (DO) 14. Se trabaja en cada ensayo con controles positivos y negativos que vienen e los kits

Placa de ELISA

ELISA PARA Ig M (Ampliación de un pocillo) 

Sustrato.

Anti Ig M Ligado a Enzima Anticuerpo viral Antígeno Ig M (suero del paciente)

Ac. Anti Ig M humano (cabra)

49


ELISA PARA Ig G (Ampliación de un pocillo)

Sustrato



 

Anti- Ig G ligado a enzima

Anticuerpo Ig G (suero del paciente)

Antígeno viral

50


DIAGNÓSTICO DE VIH - ELISA SIDA Son las siglas del sindrome de innunodeficiencia humana, que se presenta en el último estadio de la infeccion viral por el virus de la innunodeficiencia humana VIH El VIH se transmite por fluidos corporales Las pruebas para la detección de anticuerpos del virus son: A B

ELISA Western Blot

ELISA (enzyme linked inmunoabsorbent assay) 

Prueba de tamizaje, para el diagnóstico preliminar



Su resultado se informa como reactivo o no reactivo



Es fácil de realizar



Alta sensibilidad



Especificidad, da falsos positivos



Sus resultados son inconcluyentes



Los antígenos son derivados de virus lisados o producidos por recombinación



genética o sintética



Los antígenos se encuentran fijados a la fase sólida (superficie de plástico, microplacas o perlas)



Es una reacción inmunoenzimática en la que la unión antigeno-anticuerpo, se pone de manifiesto a través de la acción de un enzima ligada a un anticuerpo antiinmunoglobulina, y con el substrato especifico, da una coloración cuya intensidad esta en relación a la cantidad de anticuerpos presentes



La intensidad del color se mide a una longitud de onda determinada, con el espectofotometro y se convierte en unidades de densidad óptica (DO)



51

Se trabaja en cada ensayo con controles positivos y negativos que vienen en los kits


PRÁCTICA 15º.

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT 

Prueba de diagnóstico concluyente



Su resultado se informa como negativo o positivo a la infección



Es más laboriosa



Alta sensibilidad



Muy especifico



Es costosa



Emplea antígeno relativamente puro



Las proteínas que son codificadas por genes estructurales del VIH, son separadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida



El peso molecular (PM) de las proteínas difiere, por lo que migran a diferentes sitios en el gel



Las proteínas separadas en poliacrilamida son electrotransferidas a un papel de nitrocelulosa, el cual es cortado en tiras para el uso en el ensayo, estas tiras se incluyen en los kits de WB comercial



Esta prueba detecta anticuerpos contra cada uno de estos antígenos



Si hay anticuerpos contra el VIH presentes en el espécimen, la enzima estará disponible para reaccionar con el substrato para producir bandas oscuras en los sitios particulares donde los anticuerpos estan enlazados a los antígenos virales



La presencia o ausencia de estas bandas son la base para la interpretación de los resultados del examen



La prueba NO es exclusiva para el diagnóstico del VIH

INTERPRETACION DEL WESTERN BLOT (según casas comerciales) 

CDC - positivo:



DUPONT- positivo: p 24, p 31 + gp 41 ó gp l60

52

p 24 + gp 41 p 24 + gp l20/l60




53

OTROS positivos: p 24 + p 55 ó gp 41


ESQUEMA DEL PRINCIPIO DE LA PRUEBA DE WESTERN BLOT

Sustrato Enzima Anticuerpo anti IgG

Anticuerpo IgG anti VIH

Antígenos VIH separados gp120

gp41

p24

REPRESENTACION DE LOS RESULTADOS DE WESTERN WESTERN BLOT

A B C

Resultado Positivo: Positivo: Reactivo a todos los antígenos antígenos del VIH Controles: Negativa y Positiva Muestras: Muestras: Negativa – Positiva - Indeterminada A

54

B

C

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA PRÁCTICA 16º. 1.

HEMAGLUTINACIÓN VIRAL Y SU TITULACIÓN

INTRODUCCIÓN Algunos virus producen aglutininas que en presencia de glóbulos rojos producen hemoaglutinación por poseer estos glóbulos receptores específicos: así el virus de la influenza es capaz de aglutinar los hematíes del ganso entre otros.

La importancia de la hemaglutinación es constatar rápidamente la presencia del virus, titular al virus, ejecutar pruebas diagnósticas de valor clínico y estudiar las interrelaciones entre virus y células.

2.

MATERIALES -Líquido alantoideo cosechado de los huevos embrionados inoculados con virus influenza. -Suero fisiológico -Suspensión de glóbulos rojos de ganso al 0.5 % en suero fisiológico. -Gradilla metálica con tubos de 13 x 100 -Pipetas de 10 Ml -Pipetas de 5 mL -Pipetas de 1 mL

3. PROCEDIMIENTO Distribuir el material según el siguiente esquema:

Tubo No 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Sol. Salina

0.9

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Virus

0.1

Suspensión de Glóbulos Rojos al 0.5%

0.5

del mL anterior, tomar 0.5 y pasar al siguiente tubo, mezclar y repetir hasta el 9 Después de mezclar el tubo 9 descartar 0.5 0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

No recibe 0.5

Agitar bien y dejar en reposos a temperatura ambiente durante 2 horas o a 4 o C durante la noche. Guía de práctica Virología Médica

Página 55

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

RESULTADOS TITULOS

1 / 10

1 / 20

1 / 40

1 / 80

1 / 160

1 / 320

1 / 640

ETC.

LECTURA Lectura transparente con botón rojo de contorno bien definido en el fondo: NEGATIVO (-) -Líquido turbio en el fondo del tubo y los hematíes formando anillo: DUDOSO (+/-) -Líquido claro, hematíes depositados en grupos sobre el fondo del tubo: POSITIVO (+)

Guía de práctica Virología Médica

Página 56

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA PRÁCTICA 17º. 1.

PRUEBA DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN

INTRODUCCIÓN Los pacientes con Influenza o los animales experimentalmente inoculados con el virus de la Influenza desarrollan anticuerpos específicos los cuales pueden ser detectados por pruebas serológicas dentro de las cuales la más sencilla es la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH).

Si el virus hemaglutinante es expuesto a anticuerpos homólogos antes de entrar en contacto con los hematíes, el fenómeno de la hemaglutinación es inhibido. Es te test se usa en el diagnóstico serológico de la Influenza para medir el título de anticuerpos.

Para esta prueba el suero es diluido y se le añade cuatro veces la cantidad mínima del virus pre-titulado que da aglutinación positiva, es decir cuatro unidades hemaglutinantes.

El título de anticuerpos es la dilución más alta del suero que inhibe la aglutinación de los hematíes. 2.

MATERIALES un tubo con 3 mL de líquido alantoideo infectado con virus de Influenza tipo A en 

dilución que contenga 4 unidades hemaglutinantes en 0.25 de volumen. suero colectado en la práctica anterior, inactivado a 56º C por 30 minutos. 

solución salina (NaCl 0.85 % en agua destilada), un frasco con 10 mL



suspensión de glóbulos rojos de ganso al 0.5 % un frasco con 10 mL



una gradilla con 20 tubos de 13 x 100



una pipeta de 5 mL y 4 pipetas de 1 mL



un beaker con hielo


Página 57


3.

PROCEDIMIENTO

Distribuir el material según el siguiente esquema: Tubo No 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Sol. Salina

0.4

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

Suero Inmune

0.1

Del mL anterior, tomar 0.25, mezclar y pasar al siguiente tubo, No repetir hasta el 9. Después de mezclar el tubo 9 descartar 0.25 recibe 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

0.25

Virus con 4U. 0.2 hemaglutinante 5 Dejar a temperatura ambiente por 30 minutos Suspensión de 0.5 globulos rojos al 0.5%

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Agitar bien y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 1 o 2 horas.

4.

RESULTADOS

Títulos

1/5


1 / 10

1 / 20

1 / 40

1 / 80

1 / 160

1 / 320

1 / 640

1/ 1280

Control

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PRÁCTICA 18º.

PAUL BURNELL - TITULACION

1. INTRODUCCIÓN Es una prueba inespecífica que detecta anticuerpos heterófilos y es po sitiva en cualquier momento de la infección por el virus de Epstein - Barr

2. MATERIALES 2.1 Biológicos 1. suero problema inactivado 1. suero control positivo inactivado 1. suero negativo 1. solución de glóbulos rojos de carnero al 2 % 2.2 Material de vidrio 10 tubos de 13 x 100 1. pipetas de 1 1. pipeta 5 ml 2.3 otros materiales 1. jeringa de 5 cc descartable 1. canastillas para los tubos 1. algodón 1. alcohol 3. PROCEDIMIENTO 

Numerar los tubos del 1 al 8



Colocar en el tubo 1: 0,1 de suero problema inactivado



Añadir al tubo 1: 0,4 de suero fisiológico y 0,25 a los demás tubos



Iniciar las diluciones: tomando 0,25 del tubo 1, pasarlo al tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo 7



El tubo 8 es control de glóbulos rojos



Añadir de la solución de glóbulos rojos de carnero 0,1 a cada tubo



Incubar a temperatura ambiente por 2 horas



Realizar la lectura


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Tubo No Suero Fisiológico Suero Problema Inactivado

1

2

3

4

5

6

7

8

0.4

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.1

Del 0,5 mL anterior, tomar 0.25 y pasar al siguiente tubo, hasta el 8. Después de mezclar el tubo 8 descartar 0.25

Solución de Glóbulos rojos 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 de Carnero al 2% Agitar la gradilla y dejar incubar a temperatura ambiente por 2 horas

0.1

No recibe

0.1

RESULTADOS TITULOS

1/7


1 / 14

1 / 28

1 / 56

1 / 112

1 / 224

1 / 448

CONTROL

Página 60


PRÁCTICA 19º.

1.

INOCULACIÓN DE ENTEROVIRUS EN CULTIVOS DE CELULAS - VIRUS POLIO

INTRODUCCIÓN La infección de las células por virus es evidenciada por una serie de cambios en la célula, denominado efecto citopatogénico. Por ejemplo las células He - La infectadas con virus polio adquieren una forma redondeada, contraída, presentando picnosis nuclear y marcada granulación citoplasmática. Estas células en el transcurso de 1 a 3 días se desprenden de la pared del tuvo de cultivo y cesan de metabolizar. Este efecto es neutralizado por el suero inmune antipoliomielitis. En general no todas las células de cultivo, son suceptibles a ser infectadas por todos los virus, hay cierta especificidad, por ejemplo el virus polio sólo se propaga en células provenientes de órganos de primates PACIENTE CON SOSPECHA CLINICA DE POLIOMIELITIS

Hisopo de faringe

y/o

Heces

Transportar en baño de hielo

Procesamiento para eliminar bacterias

Sangre 5 ml

Fase Aguda

Fase Convaleciente

Búsqueda de aumento de título de anticuerpo por prueba de neutralización con virus conocidos

Suspensión de secreción faríngea o heces libres de bacterias y hongos

Inoculación en cultivo de células de riñón humano - fetal o Hep - 2

Efecto cito patogénico

Tipificación por neutralización con sueros inmunes específicos conocidos


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PARA DEMOSTRAR : Inoculación de la misma suspensión en cultivo de células de fibroblastos de embrión de pollo. NO HAY EFECTO CITOPATICO 2.

MATERIALES 

2 tubos de cultivo de células de riñon de humano fetal de 4 a 5 días de procesado, con medio de mantenimiento



2 tubos de cultivo con células Hep-2 de 5 a 7 días con medio de mantenimiento



2 tubos de cultivo con células de fibroblastos de embrión de pollo de 2 a 3 días, con medio de mantenimiento



1 pipeta de 1 ml. graduada 1/100



1 beaker con hielo



1 gradilla metálica



1 portatubos de metal



1 microscopio



tubos con cultivo de células inoculadas dos días antes y en los que se observará el efecto citopatogénico

3.

4.

PROCEDIMIENTO 

Observar los cultivos de células al microscopio con lente de pequeño aumento



Rotular un tubo de cada tipo de células para ser infectado y otro control



Usar técnica aséptica



Tomar con una pipeta de 1 mL virus



Inocular 1 mL de virus polio en los tubos rotulados correspondientes



Colocar los tubos en una gradilla inclinada, con la capa de células hacia abajo



Incubar a 37 C por 48 horas



Observar el efecto citopático y anotar PROTOCOLO

Cultivo de célula Efecto citopático Guía de práctica Virología Médica

Fibroblastos de embrión de pollo

Hep -2 Muestra

Control

Muestra

Control

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA PRÁCTICA 20º.

HEPATITIS VIRAL - DIAGNÓSTICO

VIRUS DE LA HEPATITIS B.- HBV 1.

INTRODUCCIÓN El virus de la Hepatitis B infecta sólo a los seres humanos y son estos el único reservorio conocido. Las infecciones primarias pueden ser autolimitadas y resolverse o volverse persistentes y continuar por muchos años a menudo por el resto de la vida del individuo infectado. Las infecciones agudas y crónicas casi siempre están acompañadas por Antígeno viral detectable y virus infeccioso en la sangre Los individuos más expuestos, son los drogadictos por via intravenosa, los pacientes que reciben transfusiones sanguíneas, u otros derivados de sangre, pacientes en hemodiálisis, personal de laboratorio que trabaja con sangre o sus productos, homosexuales y personas con contactos sexuales con diferentes parejas, personal médico y odontológico expuesto al contacto con sangre El virus de la Hepatitis B posee los siguientes antígenos y anticuerpos de utilidad para su identificación en el laboratorio Antigeno de Superficie

(HBs Ag)

Anticuerpos contra el Antigeno de Superficie

(anti HBs)

Anticuerpos Ig M contra el Ag Core

(anti HBc IgM)

Anticuerpos lg G contra el Ag Core

(anti HBc lgG)

Antigeno E

(HBe Ag)

Anticuerpos contra el Antigeno E

(anti HBe).

La detección del HBsAg se puede hacer en la primera o segunda semana hasta las 11 ó 12 semanas después de la exposici6n y significa infección activa. El Anti-HBs se detecta durante la recuperación y sus títulos se elevan 6 - 12 meses después de la desaparición de HBsAg

El HBeAg es otro marcador que aparece casi al mismo tiempo que el HBsAg en casi todas las infecciones y su titulo se eleva y desaparece paralelamente con el HBsAg. Declina a las 10 semanas del inicio de los síntomas, de continuar los títulos indica persistencia de Guía de práctica Virología Médica

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA replicación viral. El Anti-HBe aparece cuando el HBeAg se hace indetectable persistiendo durante 1 - 2 años después de la resolución de la infección.

Otro marcador importante que aparece antes del inicio de la lesi6n hepatica es el anticore-HB, anticuerpo dirigido contra cl antigeno interno de los viriones, de dos tipos Ig M e Ig G. Detectable de la terecra a quinta semana después del HBsAg. El Ig M se encuentra en la etapa aguda y sus titulos declinan rápidamente después de la desaparición del HBsAg. La IgG se detecta después de la Ig M

2.

TEST DE ELISA PARA LA DETECCIÓN DE ANTIGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B (HBsAg) EN SUERO HUMANO Es un método enzimático directo de tipo 'sandwich' en el que se emplean los pocillos de una placa de microtitulación recubierto con anticuerpos de cobayo anti-HBs que actua como captura empleando como conjugado Ac de cabra anti-HBs marcado con peroxidasa. Se incuban el suero del paciente en los micropocillos, si contiene HBsAg se fija al Ac anti-HBs en la placa. Se lava para extraer el material no fijado, añadir Ac de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa reaccionando con el complejo Ag-Ac de la primera incubación. Un segundo lavado y se procede añadir sustrato enzimático y del cromógeno dando la aparición de color si la muestra es positiva HBsAg.

3.

REACTIVOS 

Placa de microtitulaci6n con micropocillo con Ac de cobayo anti-HBs.



Conjugado concentrado: Ac. de cabra anti-HBs conjugado con peroxidasa. Diluir 1:51



Diluyente del conjugado.



Tampón sustrato.



Cromógeno (TMB).



Solución de lavado concentrado 10 X.



Control positivo.



Control negativo.



Solución de parada (H2S04 IN).



Láminas adhesivas.


Página 65


4.

MATERIALES 

Agua destilada.



Micropipetas de 100 ul.



Sistema de lavado manual.



Lector de microplacas con filtro 450 nm.

5.

REALIZACIÓN DE LA PRUEBA 

Transferir 100 ul de suero, control positivo y negativo en los pocillos y uno

para el

blanco 

Cubrir la placa con la lámina adhesiva



Incubar 1 hora a 37'C.



Desechar la lámina y proceder a lavar. Aspirar el contenido y agregar 300 ul solución lavado previamente preparada (solución lavado concentrada 100 ml y agua destilada 100 ml). Aspirar nuevamente. Repetir el lavado por tres veces más.



Añadir 100 ul conjugado diluido a cada pocillo menos al blanco. Preparación conjugado: 1 ml y conjugado concentrado 20 ul.



Cubrir la placa con lámina adhesiva



Incubar 30 minutos a 37'C



Lavar como en paso 4.



Añadir sustrato TMB a cada pocillo 100 ul. Preparación del sustrato: Tampón sustrato 1 ml y solución cromógeno 20 ul. Se prepara 10 minutos antes de terminar la segunda incubación.



Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.



Detener la reacción de color añadiendo 100 ul de H2S04 IN.



Leer la absorvencia con filtro de 450 nm. Si es bicromática usar 620 nm. Ajustar a cero el lector con el pocillo blanco.

6.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS


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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA HUMANA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA Un resultado repetidamente positivo de HBsAg es indicativo de la existencia de infección por el HBV. Para determinar si la infección es aguda o crónica deberá analizarse otros marcadores serológicos y paralelamente estudiar el cuadro clínico.

VIRUS DE LA HEPATITIS C - HCV Las pruebas diagnósticas se basan en la detección de anticuerpos reactivos con proteínas recombinantes o péptidos sintéticos El ELISA es el método más usado para detectar anticuerpos contra HCV, el cual consiste en la detección de anticuerpos IgM e IgG. Hay que tener en cuenta que la seroconversión de los anticuerpos es tardia pudiendo ocurrir después de los seis meses de la infección por el virus Otra técnica actualmente útil es la determinación de la carga viral del virus de la hepatitis C

VIRUS DE LA HEPATITIS E - HEV Es un virus que al igual HAV está incluido dentro del grupo de infección por transmisión fecal-oral. Tiene tendencia a producir hepatitis fulminante y fatal en mujeres que se infectan en el primer trimestre del embarazo La HVE puede diagnosticarse por detección de IgM anti-HVE o por demostración de titulos significativamente combinantes de anticuerpos IgG, la capacidad para diagnosticar esta infección es limitada por falta de pruebas facilmente disponibles. Se emplea una estrategia diagnóstica alternativa y es el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero su uso esta limitado a laboratorios referenciales con fines de investigación.

VIRUS DE LA HEPATITIS A - HAV El virus de la hepatitis A (HAV) puede diagnosticarse por la detección de anticuerpos de tipo Ig M e Ig G contra el virus, los cuales son de aparición temprana durante el período agudo se la enfermedad. La Ig M nos indica la fase aguda de la enfermedad y cuando ésta se negativiza y sólo persiste la Ig G positiva nos indica memoria o antecedente de haber tenido hepatitis A


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Guía de Virología

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