GLUCÓLISIS

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DETERMINACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE GLUCÓLISIS OBJETIVO: Determinar algunos de los productos formados en la fermentación de la glucosa y de una muestra biológica por acción de la levadura y del lactobacillus. FUNDAMENTO: La glucosa por acción de la levadura de saponificación saccharomyces cerevisiae  es capaz de degradarse en condiciones anaeróbicas hasta etanol, en el proceso conocido como fermentación alcohólica. La misma glucosa, por acción de  Lactobacillus del yogurt, se transforma en ácido láctico, proceso conocido como fermentación láctica. En ambos casos hay una serie de reacciones comunes a ambos procesos, que van desde la glucosa hasta el ácido pirúvico. Identificando la presencia de ácido pirúvico, acetaldehído y etanol se comprueba que se está realizando una fermentación alcohólica. De Forma similar, al identificar la presencia de ácido láctico y ácido pirúvico se puede comprobar que se está llevando a cabo una fermentación láctica

Glucosa

Fermentación Láctica

Fermentación Alcohólica

Etanol

Acetaldehído

Ácido Pirúvico

Ácido Láctico

El ácido pirúvico, por ser un metabolito intermediario se va a encontrar en muy baja concentración. Igual cosa sucede con el acetaldehído, un metabolito intermediario en la fermentación alcohólica. Para lograr detectarlos es necesario impedir que se transformen en otros compuestos, lo cual se puede lograr bloqueando, mediante inhibidores, las enzimas que catalizan la conversión de éstos compuestos. También se pueden cambiar las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima o, por último, se puede usar un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse, como los de ésta práctica. La enzima piruvato descarboxilasa (2-oxoácido carboxi-liasa, 4.1.1.1 ), que cataliza la conversión de ácido pirúvico en acetaldehído, no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o 2,4 dinitrofenilhidrazina. Para “atrapar” el acetaldehído se añade a la mezcla sulfito de sodio. La presencia de acetaldehído se puede demostrar por el color azul producido por la reacción con nitroprusiato de sodio y piperidina. Al demostrar la presencia de acetaldehído, que es un intermediario de la fermentación alcohólica, se puede comprobar la realización de éste proceso. En forma similar, al detectar la presencia de ácido láctico se puede comprobar que ocurrió fermentación láctica.

2 MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo Cinta de enmascarar Baño María Termómetro de 0- 100ºC Embudos de vidrio Papel de filtro Pipeta Pasteur Solución de glucosa al 10% Levadura de cerveza al 10% en agua Yogurt o leche Suspensión de levadura al 10% en Na 2HPO4 0.2M Sulfato de amonio sólido Muestra de Carbohidratos (jugo de fruta, o zumo de papa ) Solución de ácido tricloroacético al 10% Nitroprusiato de sodio al 5% Solución de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 0.2% en HCl 2M Amoniaco concentrado Hidróxido de sodio al 10% Piperidina al 3% Carbonato sódico finamente pulverizado Ácido pirúvico al 2% Ácido láctico al 2% Acetaldehído al 5 % Eter etílico Etanol al 10% Carbón activado vidrio de reloj Solución de yodo-yoduro: 4 g de yoduro de potasio y 2 g de yodo en 50 ml de agua destilada. Solución sulfocrómica diluida: 1 g de dicromato de potasio en 50 ml de ácido sulfúrico 0.5N. Solución de cloruro férrico al 0.3%

PROCEDIMIENTO: Rotule 8 tubos de ensayo como A, Am, B, Bm, C, Cm, D, Dm y agregue los reactivos que se detallan a continuación:

Reactivos Muestra Biológica Glucosa 10% Levadura en agua Levadura en Na2HPO4 Yogurt Sulfito Sódico Ácido Tricloroacético

Tubos A Am B Bm C Cm D Dm 5 ml 5 ml 5 ml 5ml 5ml 5ml 5 ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5 ml 5 ml 5 ml 0.5 g 0.5 g Calentar todos los tubos a 35 – 40ºC durante dos horas o mas 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Mezcle bien y filtre el contenido de cada tubo. Deseche el residuo y con el filtrado haga las siguientes pruebas.

Determinación de Etanol: Tome 2 tubos de ensayo y agregue respectivamente 2ml de filtrado de los tubos A y Am y otro tubo con 2 ml de etanol al 5% que servirá de patrón. Agrégueles 0.1 g de carbonato de sodio. Una vez disuelto, coloque los tubos en un baño maría, mantenido a 70ºC y añada lentamente gotas de solución de yodo-yoduro hasta que ya no desaparezca el color del yodo. Una vez llegue a este punto, se dejan los tubos durante unos tres minutos más en el baño maría y luego enfríelos con agua. Aparecerá un precipitado amarillo de yodoformo de olor característico cuando hay presencia de etanol.

3 La presencia de etanol se puede observar también mediante su oxidación con ácido sulfocrómico a acetaldehído. Tome en sendos tubos 1 ml del filtrado de los tubos A y Am y 1 ml de etanol al 5% en otro tubo, se les añaden 0.5 ml de solución sulfocrómica diluida. Después de mezclar bien el conjunto, se calientan en un baño maría; aparece un intenso color verde, percibiéndose el olor característico del acetaldehído. Esta reacción es bastante sensible pero no es tan específica del etanol como la del yodoformo

Determinación de acetaldehído: Tome tres tubos de ensayo y adicione 2 ml de filtrado del tubo B al primero y 2 ml del tubo Bm al segundo y 2 ml de acetaldehído 5% al tercero que servirá de testigo. Luego agregue 0.5 ml de solución fresca de nitroprusiato de sodio y 2 ml de piperidina acuosa a cada tubo y agite. Si hay acetaldehído presente, se observa una coloración azul.

Determinación de la presencia de piruvato: Con nitroprusiato de sodio: En un tubo de ensayo hierva 2 ml del filtrado del tubo C, en otro 2 ml del tubo Cm y en otro 2 ml de ácido pirúvico como patrón. Una vez hervidos agregue inmediatamente a cada tubo 1 g de sulfato de amonio sólido. Adicione dos gotas de solución de nitroprusiato de sodio, mezcle vigorosamente y deje deslizar por las paredes del tubo, amoniaco concentrado hasta que se formen dos capas. Si hay piruvato, se formará un anillo verde o azul en la interfase de los dos líquidos. La formación de un anillo rosado transitorio en la interfase, indica la presencia de grupos tioles y con frecuencia se observa antes de la coloración azul o verdosa característica de la reacción de piruvato. Con 2,4-dinitrofenilhidrazina: Tome 2 ml de filtrado del tubo C, lo mismo que 2ml del tubo Cm y en otro tubo con 2 ml de ácido pirúvico, agregue a cada uno, 1 ml de solución saturada de 2,4 dinitrofenilhidrazina, mezcle fuertemente, coloque tres gotas de la mezcla en un tubo de ensayo, agregue 1 ml de solución de NaOH al 10% y diluya con agua destilada hasta 5 ml. La formación de un color rojo indica la presencia de piruvato.

Determinación de Ácido láctico: Tome tres tubos de ensayo y agregue 1 ml de filtrado del tubo D en uno, 1 ml del tubo Dm en otro tubo y 1 ml de ácido láctico al otro, el cual servirá de testigo. Adicione a cada tubo 1 ml de éter etílico y agite intensamente. Al formarse dos fases en los tubos, se recoge la fase etérea (parte superior) en otros tubos y a éstos se les añade un volumen igual de solución de cloruro férrico. El lactato férrico que se forma confiere al conjunto un intenso color verde amarillento, que indica la presencia de ácido láctico.

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RESULTADOS: 1. Llene la siguiente tabla de acuerdo con sus resultados: Prueba realizada

Tubo de muestra

Tubo de glucosa Tubo de patrón

Ácido pirúvico - Con nitroprusiato - con dinitrofenilhidrazina Acetaldehído Etanol - Con yodo-yoduro - con ácido sulfocrómico Ácido láctico 2. Con base en sus resultados determine si ocurrió fermentación alcohólica o fermentación láctica. 3. En caso de no producirse resultados positivos, que pudo ocurrir en la muestra? 4. Consulte las reacciones que ocurren en cada una de las pruebas realizadas.