Aceites esenciales Definición
Los componentes volátiles provenientes de plantas han atraído la atención del hombre desde la antigüedad como principios aromáticos o especies de gran complejidad en su composición. El estudio de los aceites esenciales como materias primas básicas para la industria de fragancias y sabores, se ha transformado en una de las áreas de investigación y desarrollo más importantes para muchos países. Inicialmente considerados como material de deshecho del metabolismo de las plantas, la importancia biológica biológica de los aceites esenciales ha sido reconocida sólo recientemente. Los aceites esenciales son las fracciones líquidas volátiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica (saborizantes). Los aceites esenciales generalmente son mezclas complejas de hasta más de 100 componentes que pueden tener la siguiente naturaleza química: • • • •
Compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos), Monoterpenos, Sesquiterpenos, Fenilpropanos.
En su gran mayoría son de olor agradable, aunque existen algunos de olor relativamente relativamente desagradable como por ejemplo los componentes que forman parte de la fracción aromática del ajo y la cebolla, los cuales contienen compuestos azufrados. Los aceites pueden estar asociados formando mezclas con otros productos naturales como es el caso de las resinas y productos relacionados. Resinas y combinaciones de resinas
Dentro de este grupo de productos naturales, podemos encontrar a su vez una serie de posibles combinaciones o mezclas: 1. Resinas, son productos amorfos sólidos o semisólidos de naturaleza química compleja. Pueden ser de origen fisiológico o fisiopatológico. Ejemplos: resina colofonia, obtenida por separación de la oleorresina trementina. Composición: Composición: ácido abiético y derivados resina jalapa, extracción alcohólica de la raíz de Exogonium purga. Composición: glicósidos con acción como catárticos. • •
2. Oleorresinas, son mezclas homogéneas de resinas y aceites esenciales. Ejemplos: oleorresina trementina, obtenida por incisión en los troncos de diversas especies de Pinus. Composición: resina (colofonia) y aceite esencial (esencia de trementina) que se separa por destilación por arrastre con vapor oleorresina copaiba, obtenida por incisión en los troncos de diversas especies de Copaiba. Composición: resina y aceite esencial que se separa por destilación por arrastre con vapor. También se utiliza el término oleorresina para nombrar los extractos vegetales obtenidos mediante el uso de solventes, los cuales deben estar virtualmente libres de dichos solventes. Se utilizan extensamente para la sustitución de especias de uso alimenticio y farmacéutico por sus ventajas (estabilidad y uniformidad química y microbiológica, facilidad de incorporar al producto terminado). •
•
3. Goma-resinas, son extractos naturales obtenidos de un árbol o planta. Están compuestos de mezclas de gomas y resinas. Bolilla 4.- 1 de 18
Ejemplo: guta, obtenida por incisiones de la corteza de Garcinia handburyi. Composición: resina y un polisacárido (arabina). Si la fuente de la goma-resina también contiene un aceite esencial, se denomina oleo-goma-resina. Ejemplo: asafétida (obtenida por incisiones en las raíces y rizomas de diversas especies del género Ferula), mirra (obtenida por incisiones en las cortezas de diversas especies del género Commiphora). •
•
4. Bálsamos, son extractos naturales obtenidos de un arbusto o un árbol. Se caracterizan por tener un alto contenido de ácido benzoico y cinámico, así como sus correspondientes ésteres. Ejemplos: bálsamo de benjuí, obtenido por incisión de las cortezas de diversas especies del género Styrax bálsamo de Perú, obtenido por incisión de los troncos de árboles del género Myroxylon. • •
Clasificación de los aceites esenciales
Los aceites esenciales se clasifican con base en diferentes criterios: consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios. De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en esencias fluidas, bálsamos y oleorresinas. Las esencias fluidas son líquidos volátiles a temperatura ambiente. Los bálsamos son de consistencia más espesa, son poco volátiles y propensos a sufrir reacciones de polimerización, son ejemplos el bálsamo de copaiba, el bálsamo del Perú, Benjuí, bálsamo de Tolú, Estoraque, etc. Las oleorresinas tienen el aroma de las plantas en forma concentrada y son típicamente líquidos muy viscosos o sustancias semisólidas (caucho, gutapercha, chicle, oleorresina de paprika, de pimienta negra, de clavero, etc.). De acuerdo a su origen los aceites esenciales se clasifican como naturales, artificiales y sintéticas. Los naturales se obtienen directamente de la planta y no sufren modificaciones físicas ni químicas posteriores, debido a su rendimiento tan bajo son muy costosas. Los artificiales se obtienen a través de procesos de enriquecimiento de la misma esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de esencias de rosa, geranio y jazmín enriquecida con linalool, o la esencia de anís enriquecida con anetol. Los aceites esenciales sintéticos como su nombre lo indica son los producidos por la combinación de sus componentes los cuales son la mayoría de las veces producidos por procesos de síntesis química. Estos son más económicos y por lo tanto son mucho más utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencias de vainilla, limón, frutilla, etc.). Desde el punto de vista químico y a pesar de su composición compleja los aceites esenciales se pueden clasificar de acuerdo con los componentes mayoritarios. Según esto los aceites esenciales ricos en monoterpenos se denominan aceites esenciales monoterpénicos (por ej. hierbabuena, albahaca, salvia, etc.). Los ricos en sesquiterpenos son los aceites esenciales sesquiterpénicos (por ej. copaiba, pino, junípero, etc.). Los ricos en fenilpropanos son los aceites esenciales fenilpropanoides (por ej. clavo, canela, anís, etc.). Aunque esta clasificación es muy general resulta útil para estudiar algunos aspectos fitoquímicos de los monoterpenos, los sesquiterpenos y los fenilpropanos, sin embargo existen clasificaciones más complejas que tienen en cuenta otros aspectos químicos. Distribución y estado natural
Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en plantas que incluyen las Compuestas, Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas, Pináceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas, etc. Se les puede encontrar en diferentes partes de la planta: en las hojas (ajenjo, albahaca, eucalipto, hierbabuena, mejorana, menta, pachulí, romero, salvia, etc.), en las raíces (angélica, cúrcuma, jengibre, sándalo, sasafrás, valeriana, vetiver, etc.), en el pericarpio del fruto (cítricos como limón, Bolilla 4.- 2 de 18
mandarina, naranja, etc.), en las semillas (anís, cardamomo, hinojo, comino, etc.), en el tallo (canela, etc.), en las flores (lavanda, manzanilla, piretro, tomillo, rosa, etc.) y en los frutos (nuez moscada, perejil, pimienta, etc.). Aunque en los aceites esenciales tanto los mono-, los sesquiterpenos y los fenilpropanos se les encuentra en forma libre, más recientemente se han investigado los que están ligados a carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos del aceite como tal. Extracción y aislamiento
Los diferentes procesos de extracción utilizados en la obtención de aceites esenciales y extractos aromáticos, se pueden resumir de la siguiente forma:
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Método
Métodos de extracción de mezclas aromáticas Procedimiento
Productos obtenidos
1. Métodos directos
1.1.1. Compresión de cáscaras aceites esenciales cítricos
1.1. Expresión
1.1.2. Raspado de cáscaras 1.2. Exudado
1.2.1. Lesiones mecánicas en cortezas
gomas, resinas, bálsamos
2. Destilación 2.1. Directa
aceites esenciales, y aguas aromáticas
2.2. Por arrastre con vapor (directo, indirecto, a presión, a vacío)
almendras, mostaza, ajo, hojas de abedúl 2.3. Destilación-maceración (liberación enzimática de agliconas en agua caliente)
3. Extracción con solventes
3.1.1. En caliente
infusiones y resinoides alcohólicos en caliente, oleoresinas
3.1.2. En frío
concretos y absolutos, resinoides en frío, oleoresinas
3.2.1. En caliente
pomadas en caliente, absolutos de pomadas
3.2.2. En frío
pomadas en frío, lavados y absolutos de enflorados
3.1 Solventes volátiles
lavados
y
3.2. Solventes fijos (grasas y aceites)
4. Procesos de extracción con fluidos en condiciones subcríticas y supercríticas
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Los aceites esenciales se pueden extraer de las muestras vegetales mediante diferentes métodos como: expresión, destilación con vapor de agua, extracción con solventes volátiles, enfleurage y con fluidos supercríticos. En la expresión el material vegetal es exprimido mecánicamente para liberar el aceite y este es recolectado y filtrado. Este método es utilizado para el caso de las esencia de cítricos. En la destilación por arrastre con vapor de agua , la muestra vegetal generalmente fresca y cortada en trozos pequeños, se coloca en una recipiente cerrado y sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentado, la esencia así arrastrada es posteriormente condensada, recolectada y separada de la fracción acuosa. Esta técnica es muy utilizada especialmente para esencias fluidas, especialmente las utilizadas para perfumería. Se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada. En el método de extracción con solventes volátiles , la muestra seca y molida se pone en contacto con solventes tales como alcohol, cloroformo, etc. Estos solventes solubilizan la esencia pero también solubilizan y extraen otras sustancias tales como grasas y ceras, obteniéndose al final una esencia impura. Se utiliza a escala de laboratorio pues a nivel industrial resulta costoso por el valor comercial de los solventes, porque se obtienen esencias impurificadas con otras sustancias, y además por el riesgo de explosión e incendio característicos de muchos solventes orgánicos volátiles. En el método de enflorado o enfleurage, el material vegetal (generalmente flores) es puesto en contacto con una grasa. La esencia es solubilizada en la grasa que actúa como vehículo extractor. Se obtiene inicialmente una mezcla (concreto) de aceite esencial y grasa la cual es separada posteriormente por otro medios fisico-químicos. En general se recurre al agregado de alcohol caliente a la mezcla y su posterior enfriamiento para separar la grasa (insoluble) y el extracto aromático (absoluto). Esta técnica es empleada para la obtención de esencias florales (rosa, jazmín, azahar, etc.), pero su bajo rendimiento y la difícil separación del aceite extractor la hacen costosa. El método de extracción con fluidos supercríticos , es de desarrollo más reciente. El material vegetal cortado en trozos pequeños, licuado o molido, se empaca en una cámara de acero inoxidable y se hace circular a través de la muestra un fluido en estado supercrítico (por ejemplo CO2), las esencias son así solubilizadas y arrastradas y el fluido supercrítico, que actúa como solvente extractor, se elimina por descompresión progresiva hasta alcanzar la presión y temperatura ambiente, y finalmente se obtiene una esencia cuyo grado de pureza depende de las condiciones de extracción. Aunque presenta varias ventajas como rendimiento alto, es ecológicamente compatible, el solvente se elimina fácilmente e inclusive se puede reciclar, y las bajas temperaturas utilizadas para la extracción no cambian químicamente los componentes de la esencia, sin embargo el equipo requerido es relativamente costoso, ya que se requieren bombas de alta presión y sistemas de extracción también resistentes a las altas presiones. Monoterpenos y sesquiterpenos
Los monoterpenos y sesquiterpenos son terpenos de 10 y 15 átomos de carbonos derivados biosintéticamente de geranilpirofosfato (GPP) y farnesilpirofosfato (FPP) respectivamente. La Figura 1 muestra ejemplos de monoterpenos y sesquiterpenos naturales. De acuerdo con su estructura se les clasifica según el número de ciclos como acíclicos, monocíclicos, bicíclicos, etc.
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mentano
tuyano
carano
canfano
mirceno
CH2OH CHO
geraniol
geranial
humulano bisabolano
cadinano
eremofilano
elemano
cariofilano
Figura 1. Ejemplos de mono- y sesquiterpenos naturales
Biosíntesis
Los monoterpenos y en general todos los compuestos terpenoides naturales se biosintetizan por la ruta de la acetilcoenzima a través de un intermedio común que es el ácido mevalónico. Sin embargo, recientemente se ha propuesto que algunos terpenoides no se originan por esta ruta, sino por una ruta alterna que puede involucrar piruvato, gliceraldehído-3-fosfato y un intermedio de 5 átomos de carbono, la 1-desoxi-xilulosa-5-fosfato. Secuencia biosintética 1. Biosíntesis del ácido mevalónico
Inicialmente se condensan dos moléculas de acetilCoA, con la participación hipotética de una ß-cetotiolasa y una enzima condensante. Esta unidad es atacada por otra unidad de acetilCoA que ha perdido un H- α . La hidrólisis de una de las dos Bolilla 4.- 6 de 18
funciones tioéster da lugar a la ß-hidroxi-ß-metilglutarilcoenzima-A. Una segunda hidrólisis del otro grupo tioéster seguida de dos reducciones sucesivas con una reductasa NADPH-dependiente se llega al ácido mevalónico. 2. Biogénesis de IPP y DMAPP
El ácido mevalónico es el precursor de las dos unidades básicas que dan origen a los terpenoides: Isopentenilpirofosfato (IPP) y dimetilalilpirofosfato (DMAPP). Inicialmente, una molécula de ácido mevalónico es pirofosfatada por dos unidades de ATP para originar mevalonil-pirofosfato. La molécula sufre un proceso concertado de descarbonatación con la participación de otra molécula de ATP. De esta manera se origina una molécula de Isopentenilpirofosfato (IPP). La isomerización del enlace doble del IPP da origen a la unidad de DMAPP. 3. Condensación cabeza-cola de IPP y DMAPP
Una unidad de IPP puede condensarse con muchas unidades DMAPP mediante un proceso de condensación comúnmente denominado condensación "cabeza-cola", siendo la cabeza la función pirofosfato y la cola el extremo donde están ubicados los metilos. El proceso de condensación de dos moléculas de 5 átomos de carbono (IPP y DMAPP) da origen a una molécula de 10 átomos de carbono: geranilpirofosfato (GPP). Esta sustancia es el precursor inmediato de todos los monoterpenos naturales. La condensación de geranilpirofosfato con una nueva unidad IPP da origen al farnesilpirofosfato (FPP), el cual es el precursor de todos los sesquiterpenos naturales.
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HO2C
acetil-CoA
OH
H OH
H R
Hs isopentenil PP (IPP)
ácido mevalónico
O PP
H R
DMAPP
isomerasa
O PP
dimetilalilpirofo (DMAPP)
O PP
H R HS
Hs IPP E
O
O PP geranil PP (GPP)
OPP
H R
GPP
H R
HS
O PP
OPP
OPP Hs
OPP
OPP farnesil PP (FPP) Figura 1. Biosíntesis de mono y sesquiterpenos Ejemplos de monoterpenos y sesquiterpenos naturales
La Figura 2 muestra varios ejemplos de monoterpenos naturales representantes de varias clases de esqueletos como mentano, pinano, canfano, etc. La Figura 3 muestra ejemplos de sesquiterpenos naturales con varias clases de esqueletos.
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CH2OH CHO
CH2OH
Nerol
Geraniol
Citronelal
OH
Car-3-eno
Alcohol Fenchílico
O
alfa -Pineno
O
O
Fenchona
O H O
Thuyona
O O
Alcanfor gama-Thuyaplicina
Figura 2. Ejemplos de monoterpenos
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Limoneno
Nepetalactona
HOCH2 OH
Farnesol
Nerolidol
alfa -Cadineno
gama -Bisaboleno
Cariofileno
beta-Selineno
OH HO
O
Carotol
COOH
Acido abscísico
Figura 3. Ejemplos de sesquiterpenos
Métodos de análisis Ensayos de reconocimiento
Debido a la diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en los componentes mono- y sesquiterpénicos de un aceite esencial no existe una prueba específica para su reconocimiento. Sin embargo existen unos pocos procedimientos experimentales que permiten reconocer algunos de ellos por su coloración con diferentes reactivos, su absorción de luz UV de 254 nm y su Rf en cromatografía en capa fina. A manera de ejemplo la Tabla 1 resume las características de varios monoterpenos y su comportamiento al analizarlos por cromatografía en capa fina con varios agentes reveladores. Por ejemplo, el limoneno se reconoce en las placas de TLC porque no absorbe luz UV 254 nm, adiciona bromo, no forma un derivado 2,4-dinitrofenilhidrazona y produce color pardo con el ácido sulfúrico. Otros reactivos útiles para revelar monoterpenos y sesquiterpenos son anisaldehído-ácido sulfúrico, vainillina-ácido sulfúrico y ácido fosfomolíbdico. Tabla 1. Reconocimiento de Monoterpenos por TLC Bolilla 4.- 10 de 18
TERPENO
UV
Limoneno α -Pineno Pulegona Geraniol Carvona p-Cimeno α -Terpineol 1,8-Cineol
+ + + -
ENSAYO BROMO + + + + + + -
ENSAYO 2,4-DNFH + + -
ENSAYO H2SO 4 Pardo Pardo Amarillo Púrpura Rosa Verde Verde
Métodos fundamentales de análisis de aceites esenciales
1. determinaciones físicas 1.1. aroma 1.2. peso específico 1.3. índice de refracción 1.4. desviación óptica (poder rotatorio) 1.5. solubilidad en mezclas alcohol-agua (alcoholes rebajados) 2. determinaciones químicas 2.1. índice de acidez libre 2.2. índices de saponificación y éster 2.3. determinación de aldehídos y cetonas 2.3.1. formación de fenilhidrazonas 2.3.2. formación de oximas 2.3.3. formación de semicarbazonas 2.3.4. método del bisulfito 2.4. índice de acetilo 2.5. técnicas cromatográficas: TLC, TLC/AgNO3, HRGC, HPLC 2.6. métodos espectroscópicos: UV, IR, GC-MS, 1H-, 13C-NMR Extracción y aislamiento
Como se mencionó anteriormente, la mayoría de monoterpenos y sesquiterpenos se encuentran presentes en los aceites esenciales de diversas plantas. A partir de dichos aceites es posible realizar su aislamiento mediante la utilización de uno o varios métodos cromatográficos tales como la cromatografía en columna, en capa fina y HPLC. Para las cromatografías en columna y en capa fina se utiliza ampliamente la sílica gel como fase estacionaria. Como fase móvil se emplea solventes apolares puros o mezclados. Sin embargo actualmente se utilizan técnicas de separación más eficientes y rápidas como la cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC, y la cromatografía de gases (GC), así como también combinaciones “online” HPLC-GC-MS. Bolilla 4.- 11 de 18
Esta última técnica gracias al desarrollo reciente de columnas capilares de alta resolución, permite analizar mezclas complejas presentes en aceites esenciales, e identificar los componentes a partir de los tiempos de retención a través de los denominados Indices de Retención de Kovats (IK). Estos valores son característicos para cada componente y existen bases de datos con los índices de muchos componentes de aceites esenciales. Los valores IK se determinan en dos columnas cromatográficas una polar (por ejemplo Carbowax 20M) y una apolar (por ejemplo SE-52, DB-5). Adicionalmente, la técnica acoplada Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS), permite obtener el espectro de masas de cada componente con el cual se obtiene el peso molecular e información estructural. Así mismo existen bases de datos con los espectros de masas de muchos componentes, por lo cual el índice de Kovats (determinado en dos columnas de diferente polaridad) y el espectro de masas son criterios para la asignación química de muchos componentes de aceites esenciales, no solo monoterpenos sino también otros tipos de sustancias características de dichos aceites. Más recientemente se han desarrollado columnas cromatográficas quirales para la separación de componentes ópticamente activos, y se han desarrollado métodos para el análisis combinado HPLC-MS y HPLC-NMR de mezclas de sesquiterpenos. Caracterización espectral
Los monoterpenos y sesquiterpenos en un buen número se pueden caracterizar químicamente a partir de los datos de cromatografía de gases y los espectros de masas tal como se anotó anteriormente, pero cuando existen dudas de tal caracterización se recurre a los métodos espectrales como Infrarrojo, Ultravioleta y Resonancia Magnética Nuclear. Espectro infrarrojo
El espectro infrarrojo permite detectar la presencia de grupos hidroxilo, carbonilo, anillos aromáticos, enlaces dobles C=C cis y trans, etc. Para determinar el espectro basta con colocar una gota del componente en una celda de NaCl. Espectro ultravioleta
El espectro UV de los monoterpenos y sesquiterpenos permite el reconocimiento de grupos funcionales y grupos cromóforos. Por ejemplo el limoneno presenta un máximo de absorción en 262 nm (E=6400). En general, la espectrofotometría ultravioleta tiene una utilidad limitada en el estudio de la gran mayoría de los aceites esenciales terpénicos, ya que pocos terpenos tienen grupos cromóforos. Sin embargo, en la fracción no volátil de los aceites esenciales cítricos se encuentran componentes carotenoides o con núcleos heterocíclicos oxigenados (cumarinas, furocumarinas sustituidas y polimetoxiflavonas), lo que da a estas esencias un comportamiento característico en el UV. Esta particularidad se ha utilizado para la puesta a punto de métodos que permite evaluar la calidad y la genuinidad, identificar el origen geográfico de una muestra, la tecnología empleada para su extracción o la época de producción del aceite. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear
Gracias a los desarrollos de la NMR se cuenta con bases de datos de los espectros, especialmente de 13C-NMR para los monoterpenos y sesquiterpenos más frecuentes. En la Figura 4 se presentan los desplazamientos químicos de los carbonos de varios monoterpenos y varios sesquiterpenos.
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17.6
16.1
25.6
136.9
26.8
131.1
39.8
124.4
17.6 58.6
27.7
131.5
OH
125.3
22.8
25.6
124.5
25.4
15.9
13.7
39.7
125.0
124.3
39.8
145.9 26.1
OH
124.7
30.8
FARNESOL
25.1
124.4
17.4
17.0
162.1
27.2
132.2
128.7 123.1
131.0
MIRCENO
24.4
17.4
26.3
145.1
17.1
139.0
112.9
132.9
OH
115.5
137.1 58.6
134.9 25.6
26.9
130.8
42.2
111.5
LINALOOL
GERANIOL 17.4
73.3
32.5
25.3
CHO
162.1
26.0 40.5
123.5
190.0
CHO
127.5
189.4
trans-CITRAL
cis-CITRAL
31.9 35.0
45.6
23.5
70.9
OH
50.4 25.8 21.0
120.7
MENTOL
23.6
30.6
28.0
44.6
OH 27.1
26.7
TERPINEOL
41.2 149.7 20.5
197.7 43.1
119.6
28.5
116.5
24.8 140.9 34.0
147.2 110.3
CARVONA
20.6
108.4
LIMONENO 19.5
131.5
42.7 20.2
133.2 30.9
22.2
O
31.3
120.8
25.9
15.4
143.8
132.9 30.9
71.9 16.0
135.2
23.8
23.1
22.3
20.0 46.6 30.1 27.4
9.7 57.0 43.2
O 214.7
43.2
20.6
TERPINENO
ALCANFOR
Figura 4. Desplazamientos químicos (ppm) de varios mono- y sesquiterpenos Por otra parte, el desarrollo reciente de los métodos bidimensionales homo- y heteronucleares, han permitido la determinación estructural fina de los terpenoides y demás sustancias naturales, eliminando la ambigüedad en la asignación de las señales observadas. Espectrometría de Masa
En relación con el estudio de aceites esenciales el acoplamiento del HRGC a la Espectrometría de Masa (GC-MS) es el que ha recibido mayor atención desde su introducción. La técnica acoplada GC-MS permite obtener el espectro de masas de cada componente eluído. Se obtiene el dato de su peso molecular e información estructural. Existen bases de datos con los espectros de masas de muchos componentes, por lo cual el Índice de Kovats (determinado en dos columnas de Bolilla 4.- 13 de 18
diferente polaridad) y el espectro de masas son criterios para la identificación química de muchos de los componentes de un aceite esencial, sean monoterpenos u otros tipos de sustancias características de dichos aceites. En el acoplamiento de GC-MS, la técnica de ionización más utilizada es la de impacto electrónico (EI). Sin embargo la técnica de ionización química (CI) tiene cada vez más aplicaciones, por la mayor información que permite obtener Fenilpropanos
Los fenilpropanos son sustancias naturales ampliamente distribuidas en los vegetales caracterizadas por un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del ácido shikímico. La Figura 5 muestra varios ejemplos de fenilpropanoides ampliamente distribuidos. Nótese como la cadena lateral puede presentar varios estados de oxidación (grupos metilo, hidroximetileno, aldehído y carboxilo) e insaturación. El anillo aromático generalmente está sustituido en los carbonos 3, 4 y 5, siendo estos sustituyentes grupos hidroxilo, metoxilo o metiléndioxi, principalmente. OH
OH
CHO
HO OCH3 Alcohol hidrocinamílico
O
CH3O
Cinamaldehído
Alcohol coniferílico
HO
HO
Anís-cetona
O
O
O
O
OCH3
OCH3
Eugenol
Isoeugenol CH3O O O
Isosafrol
Safrol
Isomiristicina
CH3O
OH CH3O GluO
O O Miristicina
OCH3
OH
O O
Coniferina (glicósido)
Apiol
HO HO
CH3O OH
Anetol
Elemicina
Figura 5. Ejemplos de fenilpropanos naturales presentes en aceites esenciales Biosíntesis Bolilla 4.- 14 de 18
Los fenilpropanos presentes en los aceites esenciales se originan biosintéticamente a partir del ácido shikímico. El ácido shikímico se aisló inicialmente de la planta asiática Illicium sp. (Fam. Illiciaceae) y es reconocido como un compuesto que es el punto de partida para un vasto número de compuestos naturales de muchas clases. Aunque es un discreto constituyente vegetal, no hay duda de que es un metabolito universal de las plantas superiores. El ácido shikímico es el precursor de los constituyentes vegetales que contienen anillos aromáticos diferentes a los formados por la ruta de la malonilcoenzima-A Hay en muchos casos dos patrones estructurales claros que permiten reconocer los compuestos aromáticos derivados biosintéticamente desde el ácido shikímico: el patrón de oxigenación, y la presencia de anillos aromáticos ligados a cadenas de tres átomos de carbono (patrón C6C3). Mientras que en los metabolitos aromáticos originados por la vía de la malonilcoenzima-A, los grupos oxigenados se hallan en disposición meta entre sí, en el caso de los originados a partir del ácido shikímico, los grupos oxigenados están en disposición orto ó diorto entre sí. La Figura 6 esquematiza la biosíntesis de fenilpropanoides a través de la formación del ácido shikímico. Este precursor es convertido posteriormente en los aminoácidos fenilalanina o tirosina los cuales por acción enzimática dan origen bien sea al ácido cinámico o p-hidroxicinámico (también llamado ácido p-cumárico por otros autores). Estos dos ácidos aromáticos son los precursores directos de los fenilpropanos naturales.
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O
HO
OH OH
O
CH2
Pi
OP
Pi
HO
O
OH OH
OH OH
eritrosa-4-fosfato
fosfoenolpiruvato COOH
O
O
5-dehidroquinato
OP COOH
COOH
fosfoenolpirúvico OH
HO
OH
OH
ATP
ADP
PO
OH OH
OH O
ácido shikimico
NH2 OH
O COOH
Pi
OH
O
OH
O
O
O CO2 H2O OH
ácido fenilpirúvico OH O
ácido cinámico
OH
OH
O 1) p-hidroxilación
NH3
fenilalanina
reducción
reducción
2) metilación
OMe
OMe
Figura 6. Biosíntesis de fenilpropanoides a través de la formación del ácido shikímico
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OMe anetol
Métodos de análisis Extracción y aislamiento
Los fenilpropanos presentes en aceites esenciales se extraen con la misma metodología descrita anteriormente para monoy sesquiterpenos. Sin embargo, debido a su anillo aromático presentan ventajas en su detección por TLC y HPLC pues absorben luz ultravioleta (254 nm) y no requieren ser revelados con agentes químicos, ni necesitan ser derivatizados, y por lo tanto pueden aislarse y analizarse más fácilmente. Ensayos de reconocimiento
Existen ensayos de reconocimiento para el anillo aromático como la reacción con formaldehído y ácido sulfúrico. Así mismo en el caso de fenilpropanos con hidroxilos fenólicos estos pueden reconocerse por el ensayo del cloruro férrico, el cual produce coloraciones verdes y azules con sustancias fenólicas en general. La tabla 2 presenta los valores Rf y coloraciones con dos reactivos reveladores para varios fenilpropanos. Bajaj et al. reportaron la utilidad del reactivo Cloramina-T para la detección de varios compuestos fenólicos. Tabla 2. Valores Rf en sílica gel y colores de algunos fenilpropanos Compuesto Safrol Estragol Anetol Miristicina Apiol Timol Eugenol Isoeugenol Metileugenol Metilisoeugenol Elemicina
Rf en Rf en Benceno n-hexano/CHCl3 (3 :2) 0.74 0.86 0.72 0.69 0.50 0.71 0.39 0.41 0.38 0.20 0.31 0.29 0.27 0.42 0.42 0.27
Color con VainillinaH2SO4 Rosado Rojo Pardo Pardo Rojo Pardo Rojo -
Color con R. de Gibbs Gris Pardo Pardo Pardo Amarillo Rojo pardo Púrpura Amarillo
Caracterización espectral Espectro infrarrojo
Por tratarse de sustancias con anillo aromático, sus espectros infrarrojo muestran las señales características de estos compuestos y dan información sobre el tipo de sustitución del anillo aromático además de los grupos funcionales presentes en la molécula. Por ejemplo, el espectro IR del eugenol muestra entre otras bandas en 3500 (ancha) debida al grupo hidroxilo, 1510 característica de aromáticos, y tres bandas en 990, 920 y 938 cm-1 características de un grupo vinilo monosustituído. El espectro IR del cinamaldehído muestra bandas en 3330 (débil), 3050, 2820, 2750, 1660 (intensa, debida al grupo carbonilo), 975, 740 y 695 cm-1 entre otras. Espectro ultravioleta
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A diferencia de la mayoría de mono- y sesquiterpenos, los fenilpropanos absorben luz UV con máximos alrededor de 254 nm dependiendo de los grupos cromóforos presentes en la molécula. Por ejemplo el isoeugenol muestra máximos en 260 (15850) y 305 (7000), el safrol en 286 nm, la miristicina en 276 nm, el isosafrol en 264 nm, el ácido trans-cinámico en 273 nm y el ácido cis-cinámico en 264 nm. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear
Los espectros de 1H-NMR de los fenilpropanos muestran señales de protones aromáticos alrededor de 6-8 ppm cuyas multiplicidades y constantes de acoplamiento permiten realizar una asignación estructural clara aún con espectros de baja resolución. Espectrometría de Masa
Debido también a su anillo aromático, los fenilpropanos presentan espectros de masa con iones moleculares intensos, lo que facilita la determinación de su peso molecular. En el caso de compuestos con grupos carboxilo e hidroxilo es conveniente derivatizarlos para obtener sustancias más volatilizables y térmicamente más estables, ya que esto facilita por ejemplo su análisis en mezclas mediante GC o GC-MS. Tratamientos posteriores al proceso de extracción
Posteriormente al proceso de extracción, puede ser necesario realizar una o mas de los tratamientos que se enumeran: 1. purificación de absolutos 2. eliminación de colorantes 3. desterpenación 3.1 destilación fraccionada con vacío -cabeza de destilación: hidrocarburos monoterpénicos -cuerpo de destilación: componentes oxigenados (mono y sesquiterpenos) -1a cola de destilación: hidrocarburos sesquiterpénicos -2da cola de destilación: ceras y alquitranes de destilación 3.2 extracción con solventes selectivos -mezclas etanol-agua -empleo de 2 solventes inmiscibles a contracorriente 3.3 separación por adsorción cromatográfica 4. descerado
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