1. Biotecnologia microbiana: Conceitos e Aplicações A Biotecnologia apresenta caráter inter e multidisciplinar, integrando diferentes conhecimentos e conceitos fundamentais (PEREIRA, 2008). Nesse contexto, diferentes microrganismos são utilizados para produção de substâncias de interesse comercial, como: antibióticos, ácidos orgânicos, solventes, enzimas e biocombustíveis por processos fermentativos. O produto pode ser ainda o próprio microrganismo, como a produção de produtos lácteos fermentados utilizando probióticos (WENDLING, 2013), ou as células microbianas podem ser utilizadas em processos de biotransformação, como por exemplo, para a produção de esteróides, aromas e fragrâncias. Além da produção de bens de consumo, os microrganismos são também utilizados em processos de tratamento de resíduos, na recuperação de metais, tais como cobre, chumbo e urânio, ou em processos de biorremediação de ambientes impactados (PEREIRA,2012). Todos os microrganismos produzem uma grande variedade de enzimas intracelulares em pequenas quantidades, para a catálise das suas reações metabólicas. As enzimas, também denominadas de biocatalisadores, são catalisadores protéicos com características particulares pela sua alta eficiência em condições fisiológicas e alta especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reações estereoespecíficas. Este potencial catalítico é utilizado industrialmente não só nos clássicos processos fermentativos, mas também em processos de biotransformações microbianas para a catálise de reações químicas de difícil ocorrência e de grande importância na indústria farmacêutica (PEREIRA, 2008).
2. Bioprocessos Um Bioprocesso é caracterizado pelo estudo do desenvolvimento de alguma via metabólica, ou reações mediadas por células que podem ser animais, vegetais ou microbianas e suas etapas envolvidas. A substância obtida a partir desse processo é aplicável, ou seja, possui algum valor de interesse comercial. O Bioprocesso pode ser dividido em duas etapas principais: A primeira, antes da produção, também pode ser chamada de upstream , consiste na etapa de preparo do meio, esterilização do meio de cultura e de todo material que será utilizado, bem como o desenvolvimento do inóculo e formulação do meio de cultura. A segunda etapa, denominada downstream , consiste na separação/purificação separação/purificação do produto e das células.
•Preservação do micro-organismo
•Noções de biosseparação:
•Esterilização
-Separação sólido-líquido
•Formulação do meio de cultura
-Concentração
•Desenvolvimento •Desenvolvimento do inóculo
-Purificação
Algumas transformações microbianas, analogamente às reações químicas, atingem rendimentos próximos ao máximo estequiométrico (produtos do metabolismo primário), embora apresentando taxas globais de produção baixas. Outras, como as do metabolismo secundário, resultam em baixos valores de rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanços em ambos os casos. Os progressos serão alcançados através de uma maior compreensão sobre a fisiologia celular e da interação da célula com o ambiente químico e físico no biorreator. Algumas transformações microbianas, analogamente às reações químicas, atingem rendimentos próximos ao máximo estequiométrico (produtos do metabolismo primário), embora apresentando taxas globais de produção baixas. Outras, como as do metabolismo secundário, resultam em baixos valores de rendimento e produtividade, havendo um enorme campo para avanços em ambos os casos. É esta combinação, este binômio: célula (ou enzima)/meio ambiente (ou condições reacionais), que define o êxito de um Bioprocesso.
Em processos de escala industrial, o agente biológico deve ser selecionado em função das seguintes propriedades: elevada atividade, ou seja, ser capaz de converter rapidamente o substrato em produto com altos rendimentos, conduzindo a altos valores de produtividade; estabilidade sob condições ambientais extremas, ou ter uma ampla faixa de tolerância, já que, em processos industriais, não é possível a realização de um ajuste preciso, havendo variações em condições como temperatura, pressão e pH, por exemplo. Também se recomenda o uso de um agente tolerante e resistente a substâncias tóxicas, que podem ser geradas no processo de tratamento da matériaprima ou encontradas em resíduos e efluentes.
3. Esterilização de Meios e Equipamentos Existem Bioprocessos que exigem alto grau de assepsia dos meios de cultivo, havendo, também, grande rigor não só no transporte do meio esterilizado ao biorreator, bem como no próprio sistema reacional. O processo de esterilização é geralmente levado a cabo por agentes físicos. Os mais empregados são o calor (seco e úmido), a filtração através de membranas micro porosas e as radiações (especialmente a ultravioleta).
O processo de esterilização usando estufas de ar quente está entre os mais utilizados dentre os métodos de esterilização por calor seco. Estes instrumentos são equipados com um termômetro para indicar a temperatura do interior da câmara; um termostato, onde se programa a temperatura desejada; uma lâmpada que mostra a situação de aquecimento ou a estabilização da temperatura interna da câmara; algumas com um ventilador para promover a circulação do ar, garantindo um aquecimento rápido e uniforme na câmara. Não há um controlador de tempo, este controle é feito pelo operador do aparelho.
3.2 Meios de esterilização com calor úmido
A utilização de calor úmido é um dos métodos mais eficazes no processo de esterilização. A morte das células microbianas por ação do calor úmido ocorre pela desnaturação de proteínas e da desestabilização da membrana citoplasmática. Para esse tipo de esterilização é utilizada a autoclave. O equipamento é formado basicamente por uma câmara em aço inox, com uma ou duas portas, como uma válvula de segurança, manômetros de pressão e um indicador de temperatura. Na prática industrial verifica-se o emprego da esterilização de meios de cultivo em batelada e em conjunto com o biorreator, fazendo-se passar vapor saturado sob pressão através de serpentinas ou jaquetas (aquecimento indireto), ou pela injeção de vapor saturado diretamente no meio contaminado (aquecimento direto). Na esterilização em batelada, o tempo total de esterilização é relativamente grande, podendo dar origem a decomposição de nutrientes termo sensíveis, como as vitaminas, ou provocar reações indesejáveis entre os constituintes do meio, como por exemplo, reações entre aminoácidos e açúcares (reação de Maillard) ou de caramelização (decomposição dos açúcares). Neste sentido, esta modalidade de esterilização vem sendo substituída, sempre que possível, pela esterilização contínua, na qual se preserva mais a integridade dos constituintes do meio
4. Nutrição dos microrganismos As necessidades nutricionais dos microrganismos são diversas, uma vez que estes apresentam diferenças inerentes na sua capacidade de sintetizar os constituintes celulares a partir de nutrientes simples. A demanda por água, fontes de energia, carbono, nitrogênio e elementos minerais, assim como o acesso/utilização de oxigênio, entretanto, é comum a todos os microrganismos.
Uma célula típica contém cerca de 50% de sua massa seca em carbono. Sendo assim, o uso deste elemento no meio é extremamente necessário, já que este se encontra no processo de biossíntese de diversos constituintes celulares, como carboidratos, proteínas, lipídeos, ácidos nucléicos etc. O potencial para utilizar fontes de carbono para o metabolismo varia enormemente entre os microrganismos. Desde os chamados compostos C1 (CO, CO2, formaldeído, metanol, metilamina), até macromoléculas complexas (glicogênio, amido, proteínas, celulose, ácidos nucléicos), praticamente todos os compostos orgânicos da natureza podem ser utilizados como fonte de carbono e/ou energia por microrganismos, desde que estes possuam os sistemas enzimáticos e de transporte adequados a cada fonte.
São denominados fatores de crescimento aqueles elementos indispensáveis ao microrganismo, que ele não é capaz de sintetizar. É importante destacar que já que existe uma exigência por parte do microrganismo ao composto, muitas vezes seu crescimento é limitado por ele. Isso auxilia na elaboração de meios de crescimento, com dosagens específicas.
5. Meios de cultura
Para manutenção do microrganismo em condições de laboratório, é necessária a criação de um meio que atenda às suas exigências nutricionais, e para isso é importante um conhecimento da fisiologia do organismo em estudo. Existem basicamente dois tipos de meio: Os complexos e os sintéticos, sendo os primeiros de composição não conhecida, como extrato de leveduras e o segundo tipo é utilizado principalmente por microrganismos mais exigentes, com composição bem conhecida. Os meios quimicamente definidos são formulados com compostos puros, tais como: glicose, sulfato de amônio, fosfato mono ou diácido de potássio etc. Sua composição química é conhecida e reproduzível, contendo fontes de cada elemento e dos nutrientes essenciais requeridos.
Para que as características de um microrganismo possam ser reconhecidas, ou para que a sua atividade possa ser devidamente aproveitada, ele deve se encontrar em “cultura pura”, isto é, não
deve ser misturado a outros. Para que possa separá-lo num material ou numa cultura líquida, há a necessidade de semeá-los na superfície de um meio sólido. Se o material foi adequadamente diluído e o espalhamento bem feito, cada microrganismo estará separado do seu vizinho e, multiplicandose, formará uma colônia de microrganismos iguais a ele, visível macroscopicamente e facilmente transferível para o novo meio, onde crescerão em cultura pura (livro).
Microrganismos anaeróbios podem ser mantidos em jarras de anaerobiose , e alguns podem crescer em meios de cultura apropriados, como o caso do meio Robertson, composto por carne, peptona e cloreto de sódio o meio é esterilizado por autoclavação e mantido em frascos com tampa de rosca. Para os microrganismos aeróbios, é possível a utilização de técnicas de aeração, sendo ela natural ou forçada. Na primeira modalidade, o oxigênio é fornecido pelo ambiente. Na aeração forçada, o ar esterilizado é geralmente borbulhado para o seio do meio, onde se dissolve parte do oxigênio para o agente de transformação. Também é utilizado o meio de agitação, que além de facilitar a incorporação do O 2, facilita a dispersão de metabólitos, promove a homogeneização do meio, dentre outros fatores.
6. Desenvolvimento do Inóculo Para que seja feita a transferência do microrganismo para o meio de produção, é necessário que ele esteja no estado fisiológico adequado, e isso é encontrado essencialmente na fase exponencial de crescimento. No crescimento em batelada, ou seja, onde não há acréscimo nem retirada de meio ou de microrganismo, existem 4 fases de crescimento: O crescimento microbiano pode ser medido por diversas formas: a) Gravimetria ou análise gravimétrica: A análise gravimétrica é um tipo de técnica laboratorial usada para determinar a massa ou concentração de uma substância, medindo alterações na massa. A substância química que estamos tentando quantificar é chamada também de analito . A separação do constituinte pode ser efetuada por: precipitação química, eletrodeposição, volatilização ou extração.
b) Turbidimetria: É uma medida indireta de crescimento e consiste na medida de turvação de uma suspensão microbiana, aferindo a absorbância em espectrofotômetro. É um processo extremamente simples, onde a amostra não é destruída. Entretanto, não pode ser realizada em certos tipos de meio, como por exemplo, em fungos que formam micélios ou que contenham esporos. Para obtenção dos resultados, é necessária a construção de curvas de calibração: Lei de Lambert-beer - concentração do composto na célula de fluxo – absortividade molar (coeficiente de extinção molar) – mede a intensidade de absorção.
- comprimento da célula de fluxo
Contagem de microrganismos: O número de indivíduos também pode ser contabilizado através de duas técnicas principais. A primeira é a contagem de indivíduos, independentemente de estarem vivos ou mortos. Já a contagem de microrganismos viáveis é o método mais utilizado, onde geralmente são realizadas uma série de diluições da suspensão, semeando-se alíquotas na superfície de meio sólido. Após um período de incubação, a contagem das colônias é realizada. Para expressar os resultados, utilizamos a unidade UFC/mL Diluição Utilizado para reduzir o número de microrganismos em uma amostra, este método é realizado pipetando-se uma fração da amostra em um tubo contendo outro líquido, geralmente água destilada ou solução salina isotônica (NaCl, 8,5g/L) esterilizadas. O cálculo do fator de diluição é feito dividindo o volume inicial da amostra pelo volume total, após a mistura da mesma com o diluente. Assim:
7. Método de quantificação do substrato e produto
A cromatografia é uma técnica físico-química de separação de componentes de uma mistura através da distribuição dos componentes entre duas fases que estão em contato entre si. Essa separação é chamada de diferencial, pois há migração através dos poros de partículas esféricas da fase estacionária.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é um tipo de líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel que é eluída sobre altas pressões(COLLINS,1997). É chamada de alta eficiência por possuir partículas reduzidas, perfeitamente esféricas e com poros. Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.
Neste tipo de cromatografia, utiliza-se uma coluna fechada, reaproveitável, logo, centenas de separações individuais podem ser realizadas em uma mesma coluna. Apesar de serem muito eficazes, estas colunas apresentam uma grande resistência à vazão da fase móvel, ou seja, sofre uma grande perda de carga. Por isso, é necessário a aplicação de um sistema de bombas de alta pressão, que fazem a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna(COLLINS,1997)
A cromatografia líquida de alta eficiência, bem como qualquer método, apresenta vantagens e limitações (COLLINS,1997). A seguir, serão citadas abaixo algumas:
As bomba de alta pressão apresenta as seguintes características:
Alta pressão e fluxo constantes; Vazões de 0,5 a 2mL/min Eluição isocrática ou gradiente Reciprocidade
Referências
BRUNO, Alessandra Nejar. Biotecnologia I: Princípios e Métodos. Artmed Editora, 2014. COLLINS, Carol H.; BRAGA, Gilberto Leite. Introdução a métodos PEREIRA JÚNIOR, N.; BON, EPS; FERRARA, M. A. Tecnologia de bioprocessos (Séries em Biotecnologia). v. 1, Escola de Química/UFRJ. Rio de Janeiro: UFRJ Ed, 2008. PEREIRA, Aline Ramalho Brandão; DE FREITAS, Diego Antônio França. Uso de micro-organismos para a biorremediação de ambientes impactados. Electronic Journal of Management, Education and Environmental Technology (REGET), v. 6, n. 6, p. 995-1006, 2012. WENDLING, Luana Katzuke; WESCHENFER, Simone. Probióticos e alimentos lácteos fermentados-uma revisão. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, v. 68, n. 395, p. 49 -57, 2013.
