Universidad de Santiago de Chile Facultad de Química y Biología Laboratorio Análisis Instrumental II
LaboratorioNº1: Aplicación Aplic ación de los principios princi pios de florescencia molecular mediante técnicas analíticas (fluorimetría)
Nombre: Felipe Vilches Profesor: Mauricio Escudey Fecha de Entrega: 12/10/18 Muestra Problema: FV-2
Resumen En este práctico se aplicarán los principios básicos de la fluorimetría y características de un espectro de fluorescencia a partir de una molécula altamente fluorescente como los es la riboflavina (vitamina B), en solución de ácido acético al 5%. Para ello se confeccionara una curva de calibrado, de distintas concentraciones ( 0 a 1 ppm en intervalos de crecimiento de 0.2), para así poder trabajar una muestra problema, la cual se lograra identifica mediante este método analítico su concentración.
I ntroducción
La fluorimetría es un método analítico que principalmente corresponde a la determinación de concentraciones basado en la medida de la intensidad de la radiación emitida por la excitación de un material fluorescente, la cual es proporcional a la concentración de dicho material en una muestra dada. (1) La fluorescencia molecular es un proceso fotoluminiscente en donde la molécula se éxito por medio de la absorción de radiación electromagnética (luz), de este modo se produce un salto de un estado fundamental a un estado de mayor energía, y el electrón es capaz de poblar niveles energéticos superiores, donde posteriormente esta se relaja llegando nuevamente a su estado fundamental dando paso a la emisión de fotones produciéndose la fluorescencia. Esta técnica es particularmente una de las técnicas mayormente utilizadas si la molécula es altamente fluorescente, ya que su característica más atractiva es el tipo de sensibilidad que presenta, habitualmente de uno a tres ordenes de magnitud mayore que la espectroscopia de absorción. [2] Las transiciones fluorescentes más importantes, son aquellas que presentan las moléculas orgánicas con sistemas Pi conjugados o grupos funcionales con pares electrónicos libres, generalmente Nitrógeno, Oxigeno y Azufre .Presentando así transiciones
*
para
moléculas con sistemas conjugados pi o n * para moléculas con grupos funcionales (O,N,S), las cuales son de más baja energía y las transiciones más probables .
Figura N°1: Diagrama de transiciones energéticas * y n * donde se evidencia que estas transiciones son las menos energéticas. HO
HO
H
HO
H
HO
H
H
H
H3C
N
H3C
N
N
O NH
O
Figura N° 2: estructura de la riboflavina, donde podemos evidencias sus sistemas pi conjugados, y la presencia de grupos funcionales (N y O)
La riboflavina es una molécula altamente fluorescente en solución de ácido acético al 5%, la cual es posible cuantificar ya que la fluorimetría permite relacionar linealmente la intensidad de emisión con la concentración del analito en estudio. Para que se cumpla esto se debe trabajar con soluciones de concentraciones bajas, ya que a altas concentraciones el comportamiento lineal se ve afectado, esto se debe a que la potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la p otencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema. F = K' (P0 - P) (ec.1) Con objeto de relacionar F con la concentración c, la ley de Beer se escribe: P/ P0 = 10-ε bc (ec.2) Sustituyendo: F = K' P0 (1 - 10-εbc) Si se desarrolla el término exponencial como una serie; F = K' P0 [2,303ε bc – (2,303 ε bc)2/ 2! + (2,303 εbc)3 / 3! - …. ]
(ec.3)
Siempre que A = ε bc < 0,05 se puede decir que: F = K'P0 2,303εbc
(ec.4)
Al dejar P0 constante: F = Kc
(ec.5)
De esta forma es posible obtener una representación gráfica donde existe una relación lineal entre la potencia de emisión fluorescente con la concentración de las especies. Cuando la concentración aumenta lo suficiente como para que la absorbancia sea mayor a 0.05 ( εbc > 0.05) la relación que corresponde a la (ec.5) pierde su linealidad y a esto se le conoce como absorción primaria.[2]
Objetivos
Estudiar los principios de la fluorimetría y las características de un espectro fotómetro de fluorescencia. Analizar y determinar la concentración de una muestra problema de Riboflavina por el método de curva de calibración.
E quipos, Materiales y R eactivos
Fluorímetro y celdas. Solución stock de riboflavina de 100 ppm en ácido acético al 5% vol/vol (se debe mantener en lugar oscuro y fresco). Solución de ácido acético al 5%. Matraces volumétricos y pipetas.
Procedimiento E xperimental 1.-A partir de una solución estándar de 250 ppm de riboflavina, se preparó una solución que contenga 10 ppm (solución I) 2.-A partir de la solución I se preparó soluciones de riboflavina de 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8 y 1,0 ppm utilizando ácido acético al 5% como solvente, se preparó también un blanco de ácido acético. 3.- Se encendió el equipo el cual ya estaba calibrado para realizar las medidas con longitudes de onda de absorción de 450 nm y emisión de 528nm . 4.- se leyó la intensidad de la fluorescencia tanto para la muestra problema como para los estándares. 5.- Se graficó la intensidad de emisión vs concentración y se determinó la concentración de la muestra problema
Resultados Las mediciones se realizaron en un espectrofotómetro de fluorescencia, el que se ajustó a una longitud de onda de 450nm, produciéndose una emisión a 528nm. A partir de la solución de riboflavina de 250 ppm se preparó una solución de 10ppm en ácido acético al 5% de ella, se prepararon soluciones estándares además de una curva de calibrado que se resumen en las siguientes tablas con sus respectivas señales.
Tabla N°1: medidas de blanco, obteniendo promedio y desviación estándar
Medidas de blanco (nm) 1.- 6.718 2.- 6.556 3.- 6.722 4.- 6.661 5.- 6.722 6.- 6.744 7.- 6.775 8.- 6.655 9.- 6.667 10.- 6.527 X= 6.680 DE:0.084
Tabla N°2: Concentración e intensidad de emisión (nm) de diferentes soluciones de una muestra de riboflavina.
Concentración (ppm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Intensidad de emisión (nm) 6.680 139.000 278.485 414.719 545.010 665.603
Gráfico 1: Concentración e intensidad de emisión de diferentes soluciones de una muestra de riboflavina.
700 )
m 600 n( ai
c 500 n e c s er
o 400 ul f e
d 300 d
Equation
a
y = a + b*x
Adj. R-Square
di
0.99892 Value
s 200 n et ni
100 0.2
0.4
Intensidad de fluore scencia
Intercept
Intensidad de fluore scencia
Slope
0.6
0.8
Standard Error
12.645
7.18178
659.861
10.82694
1.0
Concentracion (ppm)
Ecuacion de la Recta: y = 659.861x + 12.645
Luego de realizada la curva de calibrado se midió la intensidad de emisión de la muestra problema, obteniéndose los resultados de la Tabla 3
Tabla N°3: Intensidad de emisión obtenidas para la muestra problema MF-2.
Intensidad de emisión muestra Concentracion (ppm) problema (nm) 247.137 0.358 252.306 0.364 X = 249.722 0.361
Tratamiento de datos Con los valores obtenidos podemos evidenciar de este modo primero los límites de detección y de cuantificación que el equipo puede entregar, sabiendo que el límite de detección será la concentración mínima que el equipo puede medir, mientras que el límite de cuantificación será la concentración mínima de analito que se puede detectar en donde se tendrá: Señal Límite de detección (LD): X + 3 DE Señal Límite de cuantificación (LC): X + 10DE De este modo obtenemos las señales tanto del límite de detección y de cuantificación: SLD: 6.932 nm SLC: 7.52 nm De este modo se tienen las señales mínimas, para luego ser interpoladas en la curva de calibrado obteniendo así las concentraciones mínimas a las cuales se puede medir (límite de detección) y la señal mínima a la cual se produce la mayor cantidad de emisión por parte del equipo (límite de cuantificación). LD: 8.6 x 10 -3 ppm LC : 7.7 x 10-3 ppm Luego de tener este intervalo de confianza se procede a realizar los cálculos pertinentes para la obtención de la concentración de una muestra problema, a través de la curva de calibrado que se realizó, utilizando nuestra ecuación de la recta y los datos recogidos de la muestra problema se tiene que: Ecuación de la Recta: y = 659.861x + 12.645
De este modo cuantificamos a través de la ecuación de la recta por medio de las señales obtenidas de nuestra muestra problema, en donde tendremos las concentraciones mencionadas en la tabla N°3 , las cuales a través de tratamientos matemáticos se obtiene la concentración real la cual esta descrita en el apéndice
Discusión En base a los datos obtenidos podemos presenciar que las leyes para esta espectroscopia se cumplen, ya que se trabajó a concentraciones pequeñas para así poder obtener una linealidad al momento de graficar como podemos ver en la grafica N°1 esto se cumple ya que la potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema, evidenciándose por el desarrollo de las ecuaciones 1 a 5 mencionadas en la introducción, también se debe destacar que la molécula era altamente fluorescente, de tal modo que a concentración bajas era posible cuantificarla, esto debido a su estructura y la composición que presentaba la cual esta descrita en la introducción, siendo de apoyo la figura N°2.
Conclusiones Se cuantificó la concentración del analito en la muestra por comparación de la señal obtenida con la de los estándares mediante la interpolación en la curva de calibrado. Siendo la concentración de la muestra problema de 1.8 ppm.
El método de la fluorimetría desarrollado es rápido, sensible y preciso, el cual conlleva una óptima medición para la cuantificación de riboflavina en la muestra.
Se logro un óptimo aprendizaje de esta técnica, comprobando la teoría menciona en la bibliografía
Bibliografía
(1) J.M Costa.”Diccionario de Química Física.” Editorial Universidad de Barcelona y Díaz de Santos. Primera Edición año 2005 (2)Skoog, West Holler, fundamento de química analitica, quinta edición, p.841 y 846.
Apéndice
I.
Calculo los límites de detección y cuantificación:
Sabemos por las expresión de señales de limites de detección y de cuantificacion a través de nuestra señales de blanco: Señal Límite de detección (LD): X + 3 DE Señal Límite de cuantificación (LC): X + 10DE De este modo se calcula a través de los datos de nuestra curva de calibrado las señales: SLD: 6.932 nm SLC: 7.52 nm Luego estas son interpoladas en nuestra ecuación de la recta: 6.932 nm = 659.861x + 12.645 ( LD) = | 8.6 x 10 -3 ppm | 7.52 nm = 659.861x + 12.645 ( LC) = | 7.7 x 10-3 ppm | De esta manera es posible ver que las concentraciones mínimas para medir y las concentraciones mínimas donde se producen las primera señales son del orden de ppb.
II.
Calculo concentración de la muestra problema:
Una de las señales obtenidas de la muestra problema MF-2 es 247.137 nm. Según la ecuación de la recta: y = mx + b; reemplazando se obtiene: 247.137 nm = 659.861x + 12.645 x = 0,36 debido a que la muestra problema fue diluida en un factor de 5, se procede a realizar los cálculos para obtener la concentración real de riboflavina. C1 x V1 = C2 x V2 0.36 ppm X 25 mL = C2 x 5 mL C2 = 1.8 ppm x = [riboflavina]= 1.8 ppm (concentración real de la muestra problema MF- 2 )
