. FLUORIMETRÍA FLUORIMETRÍA Principios
El fenómeno de fluorescencia se encuentra dentro de los fenómenos llamados de “luminiscencia” que incluye además de éste, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Todos ellos son resultantes de la interacción de la luz con la materia que acaa con !emisión" de ener#$a radiante.
Ao % &.'(
A)
Ao % &.'*
Siendo: Ao: absorbente en estado fundamental
&.'(+ ener#$a de e,citación A*: absorbente en estado ecitado
&.'*+ ener#$a de emisión -e#n el tipo de ener#$a asorida por la mol/cula se !ueden clasificar los distintos fenómenos luminiscentes en: Fotoluminiscencia+ cuando la fuente de ecitación electrónica es una radiación luminosa" son fenómenos de este ti!o la 0luorescencia y la 0os0orescencia . 1uimioluminiscencia+ cuando es una reacción qu#mica la que !roduce la ener$#a ca!a% de ecitar la molécula. Eisten otros ti!os de luminiscencia como son: bioluminiscencia, termoluminiscencia, radioluminiscencia etc. Los tipos de luminiscencia que tienen ma2or aplicación en ioqu$mica cl$nica son la 0luorescencia 2 la quimioluminiscencia . &a 0luorescencia se !roduce cuando una molécula absorbe lu% 'lon$itud de onda de ecitación(, !asa a un estado ecitado y al retornar a su estado fundamental, emite lu% 'lon$itud de onda de emisión(" la 0luorescencia ser3 por tanto la emisión de esa radiación . &a ener#$a de la radiación emitida es menor 2 por tanto4 la lon#itud de onda es ma2or que la de la radiación absorbida. La di0erencia o aumento entre estas * lon#itudes de onda se denomina des'iación de -to5es y, de forma $eneral, los me)ores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con com!uestos que tienen $randes diferencias entre las lon$itudes de onda de ecitación y de emisión. Sólo ciertas sustancias !oseen la !ro!iedad de ser fluorescentes: son los fluorocromos '0luoró0oros(. +om!uestos que no son en s# mismo fluorescentes o sólo débilmente, !ueden conertirse en deriados muy fluorescentes mediante reacciones qu#micas como condensaciones, sustituciones, des-idrataciones u oidaciones, o sim!lemente modificando su ! !articular. &a fluorescencia es emitida !or los com!uestos en todas direcciones , !ero sólo se mide una !eque/a !arte que lle$a al detector. El tiempo transcurrido entre la absorción de la radiación electroma$nética y la emisión de la fluorescencia es mu2 peque6o , del orden de 01 23 se$undos '01 23 2 0124( 'es más lento el fenómeno de fluorescencia que el de absorción ya que la absorción se !roduce en 01 205 se$( &a fluorescencia emitida !uede cuantificarse" la luz 0luorescente se !uede utilizar !ara cuanti0icar la cantidad de compuesto 0luorescente que la emite. Se !uede a!licar al fenómeno de fluorescencia la &ey de 6eer, siem!re que se traba)e con soluciones diluidas: se$7n ella, la intensidad de la radiación fluorescente es !ro!orcional a la concentración de la sustancia en solución 'esta relación es sólo álida !ara soluciones diluidas donde la absorbancia es 89 de la radiación ecitante ya que si es mayor a!arece el efecto de “filtro interno”(.
Factores que a0ectan a las mediciones 0luorim/tricas &os más im!ortantes son los si$uientes:
7ispersión de la luz+ la radiación incidente no sólo es absorbida o transmitida !or la muestra, sino que también es dis!ersada en todas direcciones" !arte de esta lu% dis!ersada !uede ser detectada )unto con la radiación fluorescente contribuyendo a elear el ruido de fondo y ocasionando una p/rdida de sensiilidad metroló#ica 'esto tiene es!ecial im!ortancia cuando se utili%an fluoróforos con un des!la%amiento de Stoes !eque/o, es decir, cuando la radiación fluorescente tiene lu$ar a unas lon$itudes de onda cercanas a las de la radiación de ecitación(. ;ara disminuir esta interferencia se !ueden utili%ar filtros de interferencia o sitemas monocromadores tanto en la !arte de emisión como en la de ecitación.
E0ecto de 0iltro interno+ en aquellos casos en que el 0luoró0oro est3 a concentraciones mu2 ele'adas !odr#a a!arecer el efecto de filtro interno, detect3ndose menos 0luorescencia que la correspondiente al mismo 0luoró0oro en una solución m3s diluida " este efecto !aradó)ico es debido a lo si$uiente: sólo se mide la fluorescencia de una !eque/a !orción de la muestra, un elemento de olumen colocado eactamente en el centro de la cubeta" !ara que la lu% lle$ue al elemento de olumen del centro de la cubeta, !reiamente -a de atraesar una !arte de la muestra que a su e% absorber#a lu% de ecitación, !or lo que la intensidad de lu% incidente que lle$a al elemento de olumen central será tanto menor cuanto mayor sea la concentración de fluoróforo y, como consecuencia, menor será la emisión fluorescente. A este efecto se le conoce como de filtro interno y &a de ser e'itado -asta donde sea !osible" !ara ello lo aconse8ale es disminuir la concentración de la muestra : normalmente !ara transmitancias mayores del <59, lo cual si$nifica alores de absorbancia inferiores a 1,1, el efecto de filtro interno es !rácticamente des!reciable.
Atenuación de la 0luorescencia+ la florescencia es bastante susce!tible a ciertas ariables en la solución como son: &a naturale%a del solente El !: !rooca alteraciones de car$a molecular modifican la fluorescencia &a tem!eratura: las ariaciones de la tem!eratura afectan a la iscosidad de la matri% y !or tanto al n7mero de colisiones de las moléculas fluorescentes con las moléculas de la matri% &a !resencia de im!ure%as &a !resencia de iones: aniones como = 2, 6r 2 y +l2 tienen un marcado efecto de atenuación de la fluorescencia de ciertos com!uestos
Impurezas 0luorescentes+ ;ueden eistir im!ure%as fluorescentes propias de los sol'entes , tampones , reacti'os, al#unos materiales de 'idrio o pl3stico , residuos de deter#entes para limpieza de material etc que !ueden absorber la lu% de ecitación o la de emisión y ser ca!aces de emitir fluorescencia. >o es recomendable utili%ar me%cla crómica !ara lim!iar material de idrio. Se debe -acer un blanco de es!ectro 'en el cual la cubeta conten$a el solente y todo aquello que se utilice en la determinación, sin el fluoróforo(. Asimismo, las muestras de suero u orina !ueden contener sustancias 0luorescentes distintas de las que se quiere in'esti#ar que también contribuyen a la fluorescencia de fondo: las !rote#nas y la bilirrubina son las que con mayor frecuencia contribuyen a esta fluorescencia no deseada 'sin
embar$o las !rote#nas tienen una ? de ecitación máima entre @1 y <1 nm, y su interferencia es menor cuando se utili%an radiaciones de ecitación !or encima de los 11 nm(.
Instrumentación ;ara la medida de la fluorescencia se em!lean 0luor$metros o espectro0luor$metros " la diferencia entre ellos es el sistema de selección de la ? de ecitación y de emisión: Bluor#metro: em!lea filtros interferenciales o de idrio Es!ectrofluor#metro: em!lea !rismas o redes de difracción &os componentes 3sicos de estos a!aratos son: fuente de lu% de ecitación rendi)as de ecitación y de emisión selector de la ? de ecitación com!artimento !ara la muestra: cubeta selector de la ? de emisión detector re$istro &a lu% !rocedente de la lám!ara de ecitación se -ace !asar !or el filtro o monocromador de ecitación, que selecciona la ? adecuada que incide sobre la cubeta con el es!écimen" !arte de la lu% se absorbe y como consecuencia del !roceso de fluorescencia, se emite lu% de mayor ? " ésta se -ace !asar !or el filtro o monocromador de emisión colocado !er!endicularmente al !rimero, !ara eitar interferencias de la lu% de ecitación 'si no se colocase as#, se detectar#a no sólo la lu% emitida !or fluorescencia sino también aquella transmitida(. Binalmente la lu% lle$a al detector, donde se transforma en ener$#a eléctrica.
Fuente de ener#$a+ &as lám!aras que se em!lean deben emitir ener$#a radiante de intensidad ele'ada !orque !ara detectar la emisión fluorescente será necesario !reiamente ecitar el mayor n7mero de flluoróforos !osible 'la intensidad de la radiación fluorescente es directamente !ro!orcional a la intensidad de la radiación de ecitación(. El es!ectro de absorción de la mayor#a de los com!uestos fluorescentes de interés se sit7a entre los 112511 nm" !or ello es con'eniente una l3mpara intensa capaz de emitir ener$#a radiante en una re#ión espectral amplia . &as fuentes de lu% que me)or se a)ustan a este criterio son: La l3mpara de arco de ,enón+ !roduce un es!ectro continuo entre 51 y @11 nm con un máimo en 4C1 nm. La l3mpara de mercurio de alta presión+ !roduce un es!ectro discontinuo con l#neas de emisión entre los @5 y C4 nm. Dtras fuentes: l3mparas &aló#enas y combinación de las l3mparas de mercurio9,enón , a eces también el l3ser.
Rendi8as+ &as rendi)as de entrada y salida son similares a las de un es!ectrofotómetro.
-electores de la de e,citación 2 emisión+ ediante: Biltros: interferenciales o de idrio coloreado
onocromadores. !rismas o redes de difracción Fe todos ellos, los filtros interferenciales son los más utili%ados, !ues los filtros transmiten más lu% y son menos costosos que los monocromadores. &os selectores se colocan antes 2 despu/s del compartimento de la muestra . Fin+ los de e,citación, seleccionar la ? de la radiación de ecitación y los de emisión, seleccionar la ? de la radiación de emisión 'eliminar las no deseadas( antes de que la lu% incida en el detector.
:ompartimento para la muestra+ Forma : las cubetas utili%adas son #eneralmente rectan#ulares , !or lo menos con caras adyacentes trans!arentes" las caras restantes !ueden ser también trans!arentes o !ueden tener una su!erficie reflectante !ara diri$ir la emisión fluorescente -acia el detector. También !ueden ser cil$ndricas.
Material: #eneralmente de cuarzo !ara GH2isible. &as de 'idrio sólo !ara la %ona del isible, a eces de pl3stico !ara la %ona del isible, !ero !ueden causar fluorescencia adicional, lo que !roducir#a !érdida de sensibilidad
;. 7etector+ &os más utili%ados son los tuos 0otomultiplicadores 'ya que son ca!aces de cuantificar la !eque/a se/al fluorescente, lo$rando as# el deseado niel de sensibilidad en la medida(.
Aplicaciones en ioqu$mica cl$nica Gna $ran ariedad de com!uestos se !ueden determinar mediante métodos fluorimétricos, tanto de 0orma directa !orque sean ellos fluorescentes, como de 0orma indirecta , aco!lando una sustancia no fluorescente a un reactio fluorescente. Estos !rocedimientos tienen interés !orque debido a su enorme sensibilidad metroló$ica y ba)o l#mite de detección, !ueden determinarse sustancias que est3n presentes en concentraciones mu2 a8as en los distintos fluidos bioló$icos como: 'itaminas, enzimas 'oidoreductasas, !eroidasasJ.(, &ormonas 'estró$enos urinariosJ(, 03rmacos 'fenito#na,
fenobarbitalJ(. &a utili%ación de marcadores 0luorescentes en inmunoan3lisis 'fluoroinmunoanálisis( 'Acs monoclonales marcados( -a su!uesto una alternatia im!ortante a los marcadores radiactios" en este cam!o es donde la es!ectrometr#a de fluorescencia molecular tiene mayor interés en bioqu#mica cl#nica.
