FERMENTACION EN ESTADO SÓLIDO
TEMAS 1. Introducción 2. Escala de laboratorio 3. Escalas piloto e industrial 4. SSF SSF co conn aire aireac ació iónn for forza zada da 5. SSF SSF si sinn aire aireac ació iónn for forza zada da 6. SSF SSF mez mezcla clado do cont continuo inuo 7. SSF in inte term rmit iten ente te
A D A R D R A
FERMENTACION EN ESTADO SÓLIDO (SSF) ³Es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles´
Viniegra-González (1997)
INTRODUCCION an eg egip ipci cio, o, pr prot oteí eína na co come mest stib ible le ja japo pone nesa sa Objetivos: Aumentar el contenido proteico alimentos, mejorar su conservación, cambiar sus características físicas, el color, el olor o el sabor de los mismos. Ejemplos: P
Aspergillus lus oryza oryzaee so ± Koji ( Aspergil sobr bree ce cere real ales es co coci cido dos) s) Penicilliu lium m roque roquefort fortii en leche de oveja) ± Queso Roquefort ( Penicil ± Shoyu, Miso y Ontjom
Necesidades: ± Pol oluc ució iónn de su suel elos os ± Us Usoo po potten enci cial al de bi bior orre rem med ediiac ació iónn ± Al Altter erna nati tiva vass de al alim imen ento toss pa para ra an anim imal ales es
CARACTERISTICAS Contenido bajo de agua Fase de gas entre las partículas Baja conductividad eléctrica (aire vs. agua) Gran cantidad de matrices (Composición, tamaño, resistencia mecánica, porosidad
Hongos (Crecimiento actividades enzimáticas)
apical,
VENTAJAS Medios de cultivo simples (Subproductos agrícolas con alto contenido de nutrientes) Baja actividad del agua (Evita contaminación de bacterias y levaduras) Reactores más pequeños (Concentración del sustrato mayor al igual que la productividad volumétrica) Aireación forzada facilitada por la porosidad del soporte (Alta transferencia de O2) Conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos (menores costos y manipulaciones en el inóculo) Tecnología limpia Calidad de enzimas superior ± Glucosidasa (Calor) ± Fitasa (Estabilidad en peletización) ± Proteasa (Digestión de proteínas)
DESVENTAJAS La transferencia de oxigeno puede ser limitante según el diseño del
reactor Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad Temperatura y humedad del medio Morfología de los microorganismos (en especial de los hongos) debido a su resistencia a la agitación Esterilidad Escalado (Generación de calor y heterogeneidad) Extracción del calor metabólico a gran escala sin control Medición de pH, T, contenido de humedad y concentraciones Procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión. Diseño de reactores y el escalado poco caracterizados. Tiempo de fermentación mayor (microorganismos con bajas velocidades específicas de crecimiento)
ROCESO SSF
P
APLICACIONES Abono orgánico Ensilado Maduración de quesos Cultivo de champiñones
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Humedad y actividad del agua (aw).
orcentaje de humedad entre 30 y 80%, según el sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación de producto, crecimiento de la biomasa).
P
Actividad del agua ( aw): Caracteriza las interacciones agua-medio sólido.
Humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el sustrato. Ejerce influencia sobre el crecimiento, la formación de productos y el crecimiento celular.
aw:
pH
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES
Af ecta el desarrollo de los procesos SSF Imposible de controlar, debido a la ausencia de instrumentos
capaces de medir el pH en la capa de líquido que rodea el sólido.
El pH cambia por dif erentes razones: ± Disminuye por la secreción de ácidos orgánicos (acético y láctico) durante el proceso. ± La f uente de nitrógeno utilizada inf luye mucho en la
tendencia que sigue el pH
Investigaciones para f ormular medios de cultivo que permitan
mantener, de manera natural, el pH en un intervalo deseado durante el proceso. ± Raimbault y Alazard (1980): Crecimiento de Aspergillus niger en harina de yuca y una mezcla de sulfato de amonio - urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) para mantener el pH en el intervalo de 5 a 6.2 (favorable para el crecimiento del microorganismo).
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Temperatura Ejerce una acción determinante en el con junto de actividades celulares (crecimiento y la f ormación de productos) Control crítico por la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y la ba ja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido líquido - gas, lo que f avorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y el aumento de la temperatura del cultivo que f avorece tres
aspectos negativos:
± La actividad microbiana se desacelera o se detiene. ± Se deshidrata el medio sólido. ± El metabolismo se desvía como un mecanismo de def ensa ante el calor o ante la deshidratación.
Intercambio de calor por convección f orzada con elevadas tasas de aireación que con f recuencia deshidratan al medio.
Utilización del
calor latente de vaporización del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y ef ectiva.
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Concentración y disponibilidad del sustrato Nutrientes necesarios balanceados para favorecer el crecimiento del microorganismo, la eficiencia de conversión energética y la respiración.
± Conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado ± Conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento para establecer los requerimientos de las fuentes de carbono.
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES Aireación Microorganismos aerobios Suministrar oxígeno, extraer CO2 f ormado y calor metabólico
evolucionado Flu jo óptimo de aire debe considerar:
± Naturaleza del microorganismo ± R equerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la f ormación del ± ± ±
producto deseado Velocidad de generación de calor metabólico Concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles Espesor de la masa de sólido
La aireación en SSF es fácil porque la superf icie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las partículas
INFLUENCIA DE FACTORES AMBIENTALES El inóculo Tipo de inóculo ± Micelio: Mejor competitividad del hongo, reducción de posibles colonizaciones del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización más rápida del hongo debido por los bajos tiempos de incubación ± Esporas: Reducción de los costos en la etapa de propagación del microorganismo.
»TI POS DE REAC TO RES«
ESCALA LABORAT OR I O Los primeros reactores en estado sólido eran cajas de Petri y Erlenmeyers. Un equipo de ORSTOM diseñó el modelo de columnas para estudios en SSF.
Reactor usado en escala de laboratorio patentado por ORSTOM.
NUEVA GENERACIÓN Control computarizado Muestreo sin contaminación Permite elaborar perfiles de crecimiento vs. Variables asociadas
1- Tapa 2- Termómetro en el medio 3- Cilindro de acero 4- Termómetro para aire de ingreso
5- Medidor de humedad 6- Resistencia calefactora 7- Medidor de temperatura en agua 8- Medidor de flujo
9- Medidor de nivel 10- Aislante
REACTORES SSF CON MEZCLADO REACTOR DE TAMBOR ROTATORIO Mejora la transferencia de masa y calor Permite la homogenización de las variables Puede generar inconvenientes asociados a aglomeración
1- Entrada de aire 2- Junta rotatoria 3- Acople 4- Toberas de aire
5- Línea de aire 6- Rodillos 7- Tambor rotatorio 8- Medio sólido 9- Llantas
REACTOR DE TAMBOR PERFORADO Incrementa la distribución de oxígeno Puede generarse taponamiento por el medio sólido y el microorganismo
MEZCLADOR DE PALAS osee el mezclado más eficiente
P
1- Entrada de aire 2- Termocuplas 3- Chaqueta 4- Palas
5- Salida de aire 6- Motor 7- Reactor 8- Medio sólido 9- Eje de agitación
BIOREACTOR ZYMOTIS LAB Usado en fermentaciones estáticas Alta transferencia de calor Pueden haber inconvenientes para la transferencia de Oxígeno
ESCALAS PILOTO E INDUSTRIAL oca diversidad
P
± Transferencia de calor ± Acanalamientos de aire ± Hinchamiento del medio ± Resistencia mecánica de microorganismos a la agitación ± Requerimientos de oxigeno ± Rango de temperatura ± Métodos apropiados de inoculación ± Necesidad del pretratamiento del sustrato ± Esterilidad ± Facilidad de llenado, vaciado y limpieza del reactor
ESCALAS PILOTO E INDUSTRIAL Clasificación:
± Aire circulando alrededor del sustrato ± Aire circulando a través del sustrato Sin mezclado Intermitentes Camas mezcladas continuas
B I OREAC TO RES SSF CON A I REAC IÓ N FORZADA Se introduce aire a través de un tamiz, que soporta al sustrato. Es un reactor simple que puede procesar unos pocos kilogramos de medio sólido seco. Herramienta para:
Analizar empíricamente la evolución global de un proceso y determinar parámetros como temperatura y humedad relativa del medio. Estudiar la difusión del oxígeno y los fenómenos de transferencia de masa y calor.
Son muy útiles en ausencia de modelos matemáticos para el escalado. No tienen agitación mecánica. Agitación manual. Están limitados por la producción metabólica de calor. Inevitables gradientes de T.
(1)
La mayoría del calor es eliminado por convección y por la evaporación del agua que hay en el medio. Por lo cual se debe adicionar agua de manera uniforme.
(1)
BIOREACTOR ZYMOTIS Es una torre con platos perforados en los cuales se coloca el medio sólido. Aire estéril pasa a través de cada plato. Debajo de cada plato hay un intercambiador de calor.
(1)
BIOREACTOR ZYMOTIS Los platos son esterilizados previamente con aire seco o con vapor. Cada plato funciona como una enorme caja de petri. Los platos son incubados en amplios cuartos, que tienen un filtro de aire (0.2 m o menor). Hay una dispersión de agua sobre los cuartos para mantener la atmósfera saturada.
LAFRACTOR
P
Diseñado por Biocon (compañía India) El aire que entra y sale del sistema es filtrado para retirar microorganismos. El reactor esta sellado, de manera que está libre de contaminantes externo. Remoción de calor por medios conductivos. Como el aire es mal conductor se usa agua como fluido de enfriamiento.
Canales de cultivo:
± Fluidos para esterilización ± Ajuste de humedad y O2. ± Extracción de sustancia de interés después del cultivo. (1)
Canales sin cultivo:
Fluidos de enfriamiento o calentamiento.
Dentro de cada módulo tiene un brazo de mezcla que gira alrededor del eje central del módulo. Se usa principalmente para producción de metabolitos.
La matriz que soporta los nutrientes se esteriliza y enfría dentro del reactor. El inóculo es adicionado y mezclado de forma aséptica después de que el medio se ha esterilizado.
B I OREAC TO RES SSF S I N A I REAC IÓ N FORZADA Es la más sencilla y practicada desde siglos atrás. El micro organismo puede ser transferido al reactor como un molde insertado en el medio de cultivo. Corresponde a la mayoría de sistemas de fermentación en bandejas, aplicados en fermentación de quesos. Requiere grandes áreas para el proceso. Es difícil mantener aséptico el proceso
REACTOR KOJI
1- Ca ja K o ji 2- Válvula de agua 3- Lámpara UV 4-8-13- Sopladores de aire
5- 11- Filtros de aire 6- Salida de aire 7- Humidif icador 9- Calentador
10- R ecirculación de aire 12- Entrada de aire 14- Bande jas 15- Soportes
REACTOR DE MEZCLA CONTINUA CON AIREACIÓN. Es un tambor rotatorio que sirve para maximizar la exposición de cada partícula con el aire circulado. Se usa en laboratorio y en escala pre-piloto. Micelio y partículas de sustrato pueden aglomerarse impidiendo una buena transferencia de masa, calor y oxígeno. Incrementar la velocidad de rotación del tambor, afecta el crecimiento del micelio debido a efectos cortante.
TAMBOR ROTATORIO DISCONTINUO Opera igual que el anterior. Entre una agitación y la otra actúa como un reactor de platos.
Hay diseños en los cuales hay un control de temperatura (termocoupla en el medio) con el cual se aumenta o se disminuye la rotación del tambor de acuerdo al aumento o disminución de la T.
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Lechos empacados con aire acondicionado fluyendo a través de ellos. Agitación periódica Rocío de agua cuando se requiera Alto rango de capacidades (Kg ± Ton) según esterilidad
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA ROCESOS NO ESTÉRILES Koji rotatorio automático P
± Usado en Asia para la fabricación de salsas de soya ± Control computacional de T y flujo de aire y agitación ± Inoculación ex-situ ± Rectangular con circulación de aire a través del medio con agitación periódica ± Simple y básico
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Koji rotatorio automático
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Grupo INRA en Dijon (Francia)
± T y humedad del medio reguladas con T, humedad relativa y flujo de aire ± Rocío de agua y agitación periódica ± Mediciones on-line de la masa de medio ± Estimación automática de la perdida de masa debido a la respiración ± Bomba de inoculación y agua de suministro. ± Software especializado para el control del acondicionamiento del aire ± Modelo matemático para mantener la humedad del medio ± Pasterización in-situ ± Facilidad de escalado
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA ROCESOS ESTÉRILES Pequeños sin aplicación industrial publicada Necesarios por: P
± Legislación en algunas industrias ± Altos tiempos de cultivo por bajas velocidades de crecimiento de los microorganismos utilizados
Wageningen University (Holland ) ± Escala piloto ± Para biopesticida ± Sustrato de granos de cereales húmedos ± Recipiente cónicomezclado con una cinta en la pared ± Esterilizable in-situ con vapor ± Sensores de temperatura a lo largo del lecho
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Durand
± Planetary mixing device ± Manejado con un micro-computador ± Fed-Batch ± Produccion de conidios para control biologico ± No existen escalados
SSF INTERMITENTE MEZCLADO CON AIREACION FORZADA Durand
DIFERENCIAS ENTRE REACTORES SSF
REFERENCIAS 1. 2. 3.
4.
Durand A., Bioreactor designs for solid state fermentation, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 113±125 Pandey Ashok, Solid-state fermentation, Biotechnology Division, Regional Research Laboratory, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 81±84 Raghavarao K.S.M.S, Ranganathan T.V, Karanth N.G, Some engineering aspects of solid-state fermentation, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 127±135 Suryanarayan Shrikumar, Current industrial practice in solid state fermentations for secondary metabolite production: the Biocon I ndia experience, Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 189±195
