Cromatografía y Vigilancia de la Fermentación Maloláctica
VIGILANCIA DE LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA
Al terminar las fermentaciones, el vino no está protegido por SO2. El desprendimiento de gas carbónico que se produce durante la fermentación maloláctica o no se percibe o se confunde con el exceso de gas carbónico que resulta de la fermentación alcohólica. Son necesarios controles analíticos y gustativos regulares para detectar toda la desviación nefasta para la calidad del producto. El conocimiento del pH del vino final de la fermentación alcohólica permite prever las dificultades de multiplicación de las bacterias indígenas. La determinación de la acidez volátil permite revelar desviaciones e intervenir a tiempo. La cromatografía de los ácidos orgánicos es interesante para darse cuenta del comienzo de la fermentación maloláctica e indispensable para confirmar la desaparición completa del ácido málico. La determinación enzimática del ácido málico es más precisa. En caso de duda sobre el final de una fermentación maloláctica, puede ser juicioso hacer la determinación en un laboratorio enológico. Al final de la fermentación maloláctica, los azúcares residuales pueden ser atacados por las bacterias lácticas, provocando un aumento de la acidez volátil; es el picado láctico. En este estadio, las levaduras patógenas del género Brettanomyces pueden desarrollarse. Producen aromas muy desagradables a cuadra y aminas biógenas susceptibles de provocar alergias. En cuanto haya desaparecido desaparecido el ácido málico, se trasiega el vino con aireación a una cuba fría y se le añade anhídrido sulfuroso para estabilizarlo. CROMATOGRAFÍA DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS
Material necesario: - Papel Whatman nº1: una hoja de 20cm x 20cm aproximadamente. - Una cubeta par cromatografía o un tarro de dos litros que cierre herméticamente (bote de conservas). - Micro-pipetas: tubos de vidrio afilados a la llama o, en su defecto, cerillas cortadas por el extremo.
- Un secador de pelo. - Vasos de precipitados de 50 ml. Productos necesarios: - n-butanol 1g de azul de bromofenol por litro. - Ácido acético al 50%. Se mezcla 50 ml de n-butanol con 1 g/l de azul bromofenol con 25 ml de ácido acético al 50%. El disolvente así constituido se coloca en la cubeta de cromatografía. (Es utilizable durante varios días). Principio de la cromatografía de los ácidos orgánicos: Se deposita una pequeña cantidad de vino sobre un papel especial (papel Whatman) en forma de mancha de diámetro limitado (5 mm). Un lado de la hoja de papel está sumergido en el disolvente. Éste asciende por el papel y arrastra los diferentes constituyentes del vino con una velocidad propia de cada uno de ellos. De esta forma, los ácidos fijos del vino acaban separándose unos de otros: - El ácido tartárico, fuertemente retenido por el papel, se desplaza poco. Se queda, pues, en la base de la hoja. - Los ácidos láctico y succínico, por el contrario, son fácilmente arrastrados por el disolvente y migran hacia lo alto del papel. - El ácido málico presenta un comportamiento intermedio. Los diferentes ácidos son después revelados por un reactivo: el azul de bromofenol. Método opertativo: El disolvente preparado como se ha indicado anteriormente (butanol-acético) se coloca con anterioridad en la cubeta con el fin de saturar la atmósfera. La cubeta se mantiene hermáticamente cerrada. Se trazan finalmente con lapicero la línea de depósito de las manchas y las marcas. A 4 cm del borde inferior de la hoja de papel, se depositan las gotas de las distintas muestras que se van a analizar. En el centro de las diferentes muestras, también se deposita una gota de disolución de ácido málico que servirá como testigo. El depósito de líquido se hace con la ayuda de miro-pipetas. Hacen falta tantas micro-pipetas como muestras de vino, más una para el ácido málico, con el fin de evitar cualquier contaminación de una muestra por otra. El volumen depositado es pequeño con el fin de que las manchas tengan un diámetro que no sobrepase los 5 mm. Un secador de pelo sirve para secar rápidamente la hoja de papel y repetir el depósito encima de la misma mancha; así de ocho a diez veces. La hoja de papel Whatman es entonces enrollada en forma de cilindro sin que los bordes se toquen y se coloca delicadamente en la cubeta sin que toque las paredes. Ni las manchas de muestras de vino ni de ácido málico deben sumergirse en el disolvente. Se cierra herméticamente la cubeta. El disolvente mugra hsta 1 ó 2 cm del borde superior de la hoja. Esto necesita de tres a cuatro horas. Seguidamente, se retira el papel de la cubeta y se cuelga de un hilo para que se seque; su color pasa de amarillo a azul y se revelan manchas amarillas, que corresponden a los ácidos orgánicos del vino. Cuando hay ácido málico en el vino, aparece una mancha amarilla sobre la hoja al mismo nivel que la mancha del testigo. Si esta mancha no aparece, es que la fermentación maloláctica ha
terminado. Interpretación: - Presencia de ácido tarárico y de ácido málico; no hay fermentación maloláctica. Aunque aparece una ligera mancha de ácido láctico, éste ha podido formarse en el transcurso de la fermentación maoláctica. - Presencia de los ácidos tartárico, málico y láctico: la fermentaicón maloláctica ha comenzado. Las cantidades de ácidos málico y láctico pueden ser evaluadas por el tamaño de las manchas, pero esta evaluación es sólo aproximada.
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla. La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente: - Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis). - Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas. La cromatografía en papel: Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el disolvente.
Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo. Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro.
