Extração, Purificação e Caracterização da Leucina Aminopeptidase de Spinacia oleracea Gonçalo Figueiró 1 1
Departamento Ciências da Vida, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade de Coimbra.
Abstract A leucina Aminopeptidase Aminopeptidase (LAP) é uma protease serínica que pode ser encontrada encontrada em diferentes organismos, organismos, tais como o Spinacia oleracea (espinafre) (espinafre) e o Solanum tuberosum (batata). Utilizando folhas de espinafre e com o objetivo Solanum tuberosum (batata). de purificar esta proteína, procedeu-se à precipitação das proteínas presentes no extrato inicial com sulfato de amónia a 75% e à diálise. Após isto, de forma a obter a proteína purificada realizou-se uma cromatografia de troca aniónica em QAE-Sephadex. Caraterizou-se esta proteína procedendo a uma eletroforese em gel de poliacrialamida 12.5% (SDS-PAGE), (SDS-PAGE), na qual obteve-se uma banda com massa molecular aparente de 60kDa, que permitiu confirmar que a proteína em estudo é homohexamérica; e a uma zimografia, em que não obteve-se qualquer degradação da gelatina, já que a proteína era muito pesada (360 kDa) e possuía uma reduzida densidade de carga. A utilização da L-leucina p-nitroanilina (Leu-pNa) como substrato da leucina Aminopeptidase, possibilitou a realização do estudo da atividade catalítica da enzima, do qual não se conseguiu obter o Km e Vmáx. Por último, a purificação desta enzima teve um rendimento de 1,5 e um grau de pureza máximo de 0,98.
Palavras-chave: Leucina Aminopeptidase,
Spinacia oleracea ,
espinafre, extração, purificação, caracterização,
cromatografia de troca aniónica Introdução As aminopeptidases aminopeptidases (EC 3.4.11.1-15) pertencem ao grupo das exopeptidases, e, portanto, catalisam a hidrólise da ligação peptídica no terminal amínico (Nterminal) de proteínas ou peptídeos. Estas enzimas encontram-se amplamente distribuídas pelo reino das plantas e animal, sendo importantes em diversas funções ao nível celular, como por exemplo a maturação de proteínas e degradação hormonal e nãohormonal de peptídeos. A classificação das diferentes aminopeptidases é feita de acordo com o número de aminoácidos clivados a partir do N-terminal do substrato; a sua especificidade pelo substrato; a localização da enzima; a suscetibilidade a certos inibidores (por exemplo a bestatina); a necessidade de iões metálicos como cofatores; e, por fim, com o pH a que a enzima possui maior atividade catalítica, isto é, o seu pH ótimo [1, 3, 5 e 16]. Das várias aminopeptidases, a leucina aminopeptidase (LAP; 3.4.11.1) catalisa a hidrólise de resíduos de leucina no N-terminal das proteínas e peptídeos. No entanto, a esta enzima não é específica para o aminoácido de leucina, já que também catalisa a hidrólise de outros aminoácidos hidrofóbicos, como por exemplo a arginina e a metionina. Esta enzima é considerada, estruturalmente, um homohexâmero (Figura 1) com uma massa molecular de 360 kDa, pelo que cada subunidade possui um peso molecular de 60 kDa [3 e 7]. Em diferentes organismos, a estrutura
primária das subunidades é muito semelhante, nomeadamente no terminal carboxílico (C-terminal), onde o zinco se encontra ligado, desta forma esta enzima apresenta uma elevada conservação quer ao nível estrutural (especificidade do substrato) quer ao nível catalítico (mecanismo de reação catalisada).
Estrutura tridimensional da LAP e representação a Figura 1 – 1 – Estrutura cores das 6 subunidades subunidades ue a constituem.
Nas plantas a caracterização da LAP, ao nível estrutural e funcional, tem sido realizada durante anos, assim sendo que ela encontra-se melhor caraterizada no tomate [7]. Esta enzima, na maioria das plantas, participa em diversas funções fisiológicas tais como na defesa, no transporte de recetores de auxina e na meiose. No entanto a sua principal função é sintetizar novas proteínas, organizando de forma diferente os aminoácidos de uma dada proteína, e degradar proteínas não-funcionais (processo conhecido como turnover ). Devido a esta função estas enzimas são, Página 1|7
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muitas vezes, designadas como enzimas de manutenção celular [7 e 11]. Neste trabalho efetuado, utilizou-se folhas de espinafre da espécie Spinacia oleracea de forma a extrair a enzima LAP, que encontra-se localizada no citosol, mais precisamente no estroma dos cloroplastos desta planta. Neste organismo, a atividade catalítica da LAP é máximo a pH 8,5 possuindo também um ponto isoelétrico de 6,2. Ao possuir uma temperatura ótima no intervalo 4 – 60ºC, esta enzima pode ser considerada termoestável. A ativação desta enzima pode ser feita na presença de catiões metálicos como o Mn2+ e Zn2+. Sendo, portanto, uma metaloenzima, esta pode ser inibida por agentes quelantes como o EDTA, a amastatina e a betastina [14]. Utilizando compostos sintéticos, principalmente amino acil-p-nitroanilina, como por exemplo a Alanina p-nitroanilina, a Leucina p-nitroanilina e a Lisina p-nitroanilina é possível estudar cineticamente esta enzima [14]. Durante o processo de extração e purificação desta enzima a partir da Spinacia oleracea , pensa-se que os pigmentos poderão ser os principais contaminantes. Materiais e Métodos Material. As folhas de espinafres frescos ( Spinacia ) foram fornecidas pela docente responsável oleracea pela cadeira de Laboratórios de Enzimologia e Química de Proteínas, a Professora Paula Veríssimo. As soluções tampão utilizadas no decorrer deste projeto, nomeadamente, tampões 50 mM e 100 mM Tris-HCl pH 8, foram preparadas pelo grupo de trabalho, enquanto que as restantes soluções, reagentes e materiais de laboratório foram disponibilizados pelo Departamento de Ciências da Vida da Universidade de Coimbra. Preparação do extrato inicial. Fez-se a lavagem das folhas escolhidas, e a tiragem das nervuras. No final deste procedimento a massa total obtida foi de 221.5 g. Após isto, procedeu-se à trituração das folhas em 170 mL de tampão 100mM Tris-HCl pH 8, de forma obter uma solução homogénea, que foi filtrada através de 8 camadas de gaze. Posteriormente à realização de uma centrifugação a 8000 x g durante 10 minutos a 4ºC, desprezou-se o pellet, já que nele se encontravam células intactas e organelos densos. Desta mesma centrifugação obteve-se um sobrenadante com, aproximadamente, 248 mL, dos quais 50 mL foram armazenados para ensaios enzimáticos e, cerca, de 198 mL utilizados para os restantes passos de purificação da enzima.
Purificação aminopeptidase.
da
enzima
Leucina
Com o objetivo de purificar a enzima em estudo iniciou-se por precipitar as proteínas existentes no extrato inicial, de volume 198 mL, e por realizar uma diálise, de acordo com Noriyuki Ogiwara et al [12]. Nesta referência a precipitação foi feita a uma saturação 70%, no entanto adicionou-se 102.2 g de (NH4 )2SO2 ao extrato inicial, sob agitação constante, obtendo, assim, uma saturação de 75%. Seguidamente efetuou-se uma centrifugação a 10000 x g durante 12 minutos, na qual o pellet obtido foi recolhido e guardado a 4ºC, para posterior utilização. Em seguida, o precipitado foi ressuspenso em 15 mL de tampão 100 mM Tris-HCl pH 8 e dialisado overnight . Para a execução da diálise foi usado uma membrana de celofane semi-permeável, na qual continha a nossa ressuspensão, num gobelé com, cerca de, 1 L de tampão 100 mM Tris-HCl pH 8, para que a nossa proteína não sofresse um choque osmótico. A suspensão dialisada foi centrifugada a 7000 x g durante 10 minutos, com finalidade de remover o material insolúvel na mesma. O sobrenadante resultante desta centrifugação foi recolhido e apresentava um volume de 25 mL. Deste volume, 10 mL foram guardados para ensaios enzimáticos e os restantes 15 mL foram aplicados na cromatografia de troca aniónica, que representa o passo seguinte do processo de purificação. A cromatografia de troca aniónica foi efetuada utilizando uma coluna de 50 x 10 mm de QAESephadex, que é um trocador forte, e o seu equilíbrio foi realizado com tampão 50 mM Tris-HCl pH 8. Após este equilíbrio foram aplicados os 10 mL de dialisado e recolheu-se um volume de 12 de mL, que designou-se por carregamento. Ao realizar lavagens com o mesmo tampão foram recolhidas frações de 2 mL. Paralelamente, fez-se a leitura das absorvâncias a 280 nm destas frações usando um espectrofotómetro UV/visível. Iniciou-se a eluição com um gradiente crescente de NaCl (0-1M) depois de se observar que valor de absorvância era inferior a 0,1. Para tal, usaramse, cerca de, 16 mL de solução de NaCl (com concentração 1 M) e um volume igual de tampão de equilíbrio. Durante esta eluição, continuou-se a recolher frações 2 mL e a realizar as leituras da absorvância a 280 nm. Ensaios Enzimáticos. Com o objetivo de estudar a atividade proteolítica da LAP monitorizou-se espectrofotometricamente, durante 2 minutos a 405 nm, a formação do produto da reação catalisada. Este Página 2|7
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procedimento ocorreu em conformidade com Bernard Erlanger et al [6]. O substrato usado nos diversos ensaios enzimáticos foi a L-leucina p-nitroanilina, e portanto a libertação p-nitroanilina foi detetada por espectrofotometria [15]. Para cada passo de purificação (extrato inicial, precipitação com (NH4 )2SO2 e cromatografia de troca aniónica) realizou-se um ensaio enzimático. No extrato inicial, na precipitação e no carregamento utilizou-se 40 µL de amostra e 10 µL de substrato, enquanto para as pools usou-se um volume superior de amostra, 200 µL. Tal como Bernard Erlanger et al [6], considerou-se que o coeficiente de extinção molar, a 405 nm, para pNa é de 8800 M-1cm-1, valor este usado nos cálculos da atividade específica e total. Estudo da Cinética Enzimática. Foram, igualmente, realizados ensaios enzimáticos, nos quais variou-se a concentração de substrato, com o objetivo de calcular os parâmetros cinéticos da enzima (Km e a Vmáx), tal como Zoran Vujcic et al [15]. Tendo em conta que a solução de Leu-pNa usada possuía uma concentração de 10 mg/mL, as concentrações utilizadas variaram entre os 884 µM e 72.2 µM. Quantificação. A concentração das proteínas nas amostras foi determinada através do método do Bio-Rad, que é baseado no método de Bradford (1976) [2]. No entanto alterou-se o comprimento de onda de absorção para o valor mais próximo da 595 nm a que espectrofotómetro conseguia ler, a 655 nm. Optou-se como proteína padrão a IgG, já que abrange uma maior gama de concentrações que a BSA e a nossa proteína encontrava-se a concentrações relativamente elevadas. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Tabela 1: Passos
A eletroforese SDS-PAGE foi efetuada segundo o método de Laemmli modificado (1970) [9], utilizando uma concentração de 12,5% em poliacrilamida no gel de separação, e 4% no gel de concentração. As amostras a aplicar no gel foram preparadas com uma solução desnaturante (8M Ureia, 4% SDS, 200mM Tris-HCl pH 8.0, 2% β mercaptoetanol, 0,01% Bromofenol azul) numa diluição de 1:1. A corrida eletroforética decorreu durante aproximadamente 1 hora, tendo sido aplicado uma voltagem de 180V. Após a eletroforese, o gel foi revelado com Coomassie Blue R-250, de forma a verificar a eficácia da purificação. Zimografia. Paralelamente à eletroforese, foi realizada também uma zimografia para as mesmas amostras, de acordo com Lebber [10]. Foi utilizado nesta técnica um gel de poliacrilamida a 12,5% e uma concentração final de gelatina (substrato de proteases) de 1 mg/mL. Como o objetivo principal desta técnica é detetar atividade proteolítica, as amostras foram aplicadas no gel numa diluição 1:1 com tampão de carregamento (125 mM Tris-HCl pH 6,8 contendo 4% SDS (v/v) e 20% glicerol (v/v)). A zimografia ficou a correr juntamente com a eletroforese, a 180 V durante 1 hora, em tampão de eletroforese. Posteriormente à corrida, o gel foi lavado duas vezes com tampão de renaturação (0,25% (v/v) Triton X-100 em tampão 100 mM Tris-HCl pH 7,5). Cada lavagem durou, cerca de, 15 minutos e utilizou 50 mL de tampão de renaturação. Após isto, o tampão de renaturação foi substituído por tampão fresco e procedeu-se à incubação overnight . No final, lavou-se o gel com água destilada e revelou-se com Coomassie Blue R-250, de modo análogo ao efetuado para a eletroforese.
purificação da Leucina Aminopeptidase de folhas de espinafre Spinacia
a
A utilização do Método de Bradford permitiu determinar a concentração proteica. b A utilização da Leu-pNa como substrato da enzima LAP permitiu detetar a atividade enzimática, a pH 8. 1 Unidade de atividade = 1 μmol pNa formada/min. ε pNA (λ=405nm)=8800 M-1cm-1 Página 3|7
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Resultados e Discussão Purificação da Leucina Aminopeptidase
O processo de purificação da enzima LAP encontra-se sumariado na tabela 1. A partir de 221,5 g de folhas de espinafre extraiuse a enzima, obtendo uma concentração proteica de 8,57 mg/mL (tabela 1). A fase seguinte consistiu na precipitação com (NH4 )2SO2 a 75%, seguida de uma centrifugação e diálise. A adição do sal permitiu a precipitação de proteínas, diminuindo as interações entre estas e a água (processo designado por salting-out ), enquanto a diálise promoveu saída do sal, utilizando uma membrana semipermeável. Este passo de purificação teve como objetivo principal concentrar a nossa proteína e podemos verificar, pela tabela 1, isso mesmo (C =23.9 mg/mL). No entanto, devido à grande descida de rendimento (100% para 14.4%) pode-se considerar que esta etapa foi o passo limitante do processo de purificação da LAP. Esta diminuição deveu-se à precipitação da grande parte das proteínas, incluindo a LAP. Finalmente, seguiu-se a cromatografia de troca aniónica, em que utilizou-se como matriz a QAE Sephadex. Esta matriz sendo um quaternário aminoetil (QAE), isto é, que possui carga positiva, permitiu a ligação forte de proteínas com carga oposta. O equilíbrio da coluna foi feita com tampão 50 mM TrisHCl pH 8, e a este pH a nossa proteína apresenta carga negativa, já que o seu ponto isoeléctrico é 6,2. A interação da proteína com a nossa coluna possibilitou que ficasse retida, facilitando a eliminação de outras
proteínas. Para retirar a LAP da coluna efetuou-se uma eluição com NaCl em tampão de equilíbrio por gradiente continuo (0 – 1 M). Ao analisarmos o perfil cromatográfico (Figura 2) apercebemo-nos que com as lavagens com tampão 50 mM Tris-HCl pH 8 existiu a diminuição da absorvância a 280 nm, ou seja a saída de proteínas que não se fixaram à coluna da matriz. Após aplicação do gradiente de sal, a absorvância a 280 nm aumentou existindo, portanto, a saída da nossa proteína. Podemos também notar que os valores de absorvância ultrapassaram o limite a que o espectrofotómetro conseguia ler (Abs (280nm) = 3), não sendo possível observar a existência de um pico de absorção. Obtiveram-se estes valores, porque possivelmente existia contaminação com pigmentos. Assim, tornou-se necessário efetuar cálculos de atividade total para cada fração para concluir onde se encontrava a nossa proteína (Figura 2). Após os cálculos de atividade total, resolveu-se formar duas pools: a 1ª Pool foi formada a partir frações 48 – 54 mL, dando um volume total de 8 mL; enquanto a 2ª Pool foi formada a partir das frações 56 e 58 mL, dando um volume total de 4 mL. Pela tabela 1, verificamos que a junção das frações não permitiu a purificação da proteína, originando um grau de pureza 0,98 para a 1ª pool e 0,68 para 2ª pool. Estes valores não foram superiores a 1, já que existia contaminação com outras proteínas. Pela tabela 1, pode-se ver, ainda, que existiu uma perda significativa de proteínas ao longo do processo de purificação, pois a 1ª Pool e 2ª Pool apresentaram, respetivamente, um rendimento de 1.5% e 0,2%, valores estes muito baixos.
3,5
60
3
50
2,5
40
m n 0 2 8 2 a s 1,5 b A
30 20
1
) U 3 0 1 x ( l a t o t e d a d i v i t A
10
0,5 0
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70
Figura 2 – Cromatograma
da Cromatografia de troca aniónica QAE-Sephadex do extrato proteico obtido da precipitação com Volume em de eluição (mL) sulfato de amónia a 75% e da diálise. As absorvâncias a 280 nm das frações foram medidas na lavagem tampão 50 mM Tris-HCl pH 8 ( ) e após o gradiente de sal 0 – 1 M ( ). A atividade total ( ) foi calculada graças à degradação do substrato de Leu-pNa, que foi monitorizada a 405 nm. Os ensaios enzimáticos realizados durante 3 minutos possuíam: 200 µL de amostra, 20 µL de substrato e 800 µL de tampão 50mM Tris-HCl pH8. Página 4|7
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No carregamento, os valores de rendimento (8,8%) e do grau de pureza (1,35) foram superiores aos das pools, o que significa que nem toda a LAP aplicada na coluna interagiu com a matriz da QAE-Sephadex, sendo, por isso, recolhida logo ao início da cromatografia. Este acontecimento pode ser explicado devido à existência de uma grande quantidade proteica no precipitado (239 mg) comparativamente aos número de locais de ligação na matriz, que não foram os suficientes. Assim, seria necessária aplicar um volume menor de precipitado na coluna, ou fazer um coluna com um volume maior de matriz, para que fosse possível a retenção de toda a proteína aplicada. Pensase, ainda, que a existência dos principais contaminantes (os pigmentos fotossintéticos) possa ter influenciado estes valores, pois estes podem ocupar os locais de ligação, impossibilitando a interação da LAP com a nossa matriz. Para verificar a eficácia do processo de purificação fez-se uma SDS-PAGE, e os resultados desta encontram-se na Figura 3.
em condições desnaturantes (SDS) das amostras enzimáticas nos diferentes passos de purificação de LAP. Poço A – Padrão de pesos moleculares: 5 µL; Poço B – Extrato inicial: 10 µL; Poço C – Precipitado com sulfato de amónia 75%: 10 µL; Poço D – Carregamento: 10 µL; Poço E, F – 1ª Pool: 10 µL e 5 µL, respetivamente; Poço G, H – 2ª Pool: 10 µL e 5 µL, respetivamente.
encontra presente em todos os passos de purificação, incluindo o carregamento, pelo que houve perdas da LAP ao longo deste processo. Portanto conseguiu-se purificar de forma parcial a proteína LAP. Se compararmos a intensidade das bandas do poço B com as de E, por exemplo, observamos que a concentração proteica diminuiu ao longo do processo de purificação, nomeadamente de 8.57 mg/mL para 1.63 mg/mL. Para além da banda da LAP, conseguimos observar outras bandas correspondentes a outras proteínas que não se conseguiram eliminar. As bandas que se encontram na zona dos 32 kDa poderão corresponder à proteína light-harvesting chlorophyll a (LHCPa) (36 kDa) e à proteína light-harvesting chlorophyll b (LHCPb) (32 kDa), que são complexos que possuem clorofilas e outras moléculas fotossensíveis e, por isso, apresentam um máximo de absorção nos 400-500 nm [4]. De forma avaliar atividade proteolítica da LAP efetuou-se uma zimografia, e os resultados desta encontram-se na Figura 4.
Figura 3 – Eletroforese
Como dito anteriormente a enzima em estudo possui uma estrutura homohexamérica, e cada monómero tem um peso molecular de 60 kDa. Quando a enzima se encontra num ambiente desnaturante, neste caso na presença de SDS, esta dissocia-se nas suas subunidades. Podemos, então, corresponder na Figura 3 a banda de peso molecular aparente de 60kDa ao monómero da enzima. Podemos, também, constatar que a nossa enzima se
Figura 4 – Zimograma obtido em gel de 12,5% de poliacrilamida co-polimirizado com gelatina. Poço A – Extrato inicial: 10 µL;
Poço B - Precipitado com sulfato de amónia 75%: 10 µL; Poço C - Carregamento: 10 µL; Poço D - 1ª Pool: 10 µL; Poço E – 2ª Pool: 10 µL.
Com o objetivo de estudar a atividade da LAP a zimografia utiliza condições não-desnaturantes, desta forma a LAP não se dissocia nas suas formas monoméricas, mantendo, por isso, a estrutura homohexamérica (360 kDa). Ao analisarmos os resultados, podemos verificar que nossa enzima não degradou a gelatina, como devia. Isto poderá ter ocorrido devido ao seu grande peso molecular de 360 kDa e à sua baixa densidade de carga a pH 8,8, retendoPágina 5|7
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se nos poços. A utilização de um gel com uma concentração 12,5% de poliacrilamida (um pequeno tamanho dos poros relativamente ao tamanho da proteína), também, poderá ter dificultado a migração da nossa proteína, o que permite explicar as bandas transparentes no início dos poços. Pode-se confirmar, pela Figura 4, a existência de uma protease capaz de degradar a gelatina no precipitado com sulfato de amónia a 75% (poço B). A grande concentração proteica no precipitado (23.9 mg/mL) comparativamente ao resto das amostras, poderá ser a razão pela qual só conseguimos assistir a degradação da gelatina no precipitado. Parâmetros cinéticos.
Para determinar os parâmetros cinéticos da enzima LAP, nomeadamente o Km e a Vmáx, foram realizados vários ensaios enzimáticos em que se variou as concentrações de substrato (884 µM; 710 µ M; 180 µM; 72,2 µM). Sabe-se que a enzima em estudo segue uma cinética de Michealis-Menten, desta forma para obtenção dos parâmetros utilizou-se um gráfico de Eadie-Hofster (y=mx+b), que permite retirar o Km da enzima pelo declive da reta (m=-Km) e o Vmáx pela ordenada na origem (b=Vmáx). Podemos observar na Figura 5 que o declive da reta é positivo, pelo que nos dá um Km negativo (-21,769). Este valor não corresponde à realidade, já que não é possível existir uma concentração negativa de substrato a que a enzima possua metade da velocidade máxima. Pode-se, portanto, afirmar, pelos resultados obtidos, que não foi possível determinar nem o Km e nem o Vmáx da enzima em estudo. 1,6 1,5 ) 1,4 n i m / 1,3 l o m 1,2 n ( v
esculentum e na Gonyaulax polyedra , a enzima foi descrita por possuir um Km igual a 140 µM [8 e 13]. Admitindo que o Km da LAP da Spinacia oleracea ronda estes
valores, as concentrações utilizadas foram maiores que o Km, pelo que a enzima podia estar a catalisar a reação de degradação à sua velocidade máxima, neste caso aproximadamente a 1,26 nmol/min. Conclusão Através dos resultados obtidos é possível observar que a LAP do espinafre foi parcialmente purificada, devido a uma grande perda ao longo do processo de purificação e à existência de alguns contaminantes após a cromatografia, nomeadamente as proteínas lightharvesting chlorophyll. Na cromatografia efetuada, o carregamento apresentou um maior grau de pureza e rendimento que as pools devido ao reduzido tamanho da coluna, pelo que seria necessário utilizar um maior volume de matriz, de forma a permitir uma maior retenção da LAP e melhores resultados. É de referir que não foi possível determinar os parâmetros cinéticos da enzima, mas comparativamente com outras LAP de outros organismos o Km poderá ser muito pequeno e portanto, seria necessário um espectrofotómetro mais sensível para esclarecer esta questão. Por fim, foi possível, a partir deste trabalho, comprovar afirmações iniciais, como por exemplo a estrutura homohexamérica da LAP e a sua capacidade de hidrolisar o substrato sintético Leu-pNa. Desta forma, este trabalho contribuiu uma melhor compreensão da LAP, o que poderá ser importante para futuros estudos relacionados com as suas funções e possíveis aplicações. 2
y = 21,769x + 1,0879 R² = 0,8004
1,1 1 0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
v/[S] (nmol/ min/µM)
Figura 5 – Gráfico de Eadie-Hofster da atividade LAP da Spinacia oleracea.
enzimática da
A Leucina Aminopeptidase pode ser encontrada em outros organismos que não a Spinacia oleracea , como referido anteriormente. Esta enzima já foi caracterizada na Solanum tuberosum , onde possui um Km igual a 9,25 µM [15]. Enquanto que na Fagopyrum Página 6|7
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