EL ESTRÉS CRÓNICO COMO ELEMENTO POTENCIADOR DE LA DEGENERACIÓN DE LAS NEURONAS DEL HIPOCAMPO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN. POSIBLE IMPLICACIÓN EN ENFERMEDADES NEURODEGENE NEURODEGENERATIVAS RATIVAS
AUTORA: ANA MARÍA ESPINOSA OLIVA
EL ESTRÉS CRÓNICO COMO ELEMENTO POTENCIADOR DE LA DEGENERACIÓN DE LAS NEURONAS DEL HIPOCAMPO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN. POSIBLE IMPLICACIÓN EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
ANA MARÍA ESPINOSA OLIVA
EDITA: CSI – F ENSEÑANZA SEVILLA
© Ana María Espinosa Oliva e – mail: mail:
[email protected] Diseño de portada e imágenes: Ana María Espinosa Oliva. Todas las imágenes que aparecen en esta obra han sido elaboradas por el autor o son de dominio público. EDITA: CSI – F Enseñanza Sevilla. Impreso en España – Printed in Spain ISBN: 978-84-693-3572-7 Depósito Legal: SE 4175-2010 Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorización escrita del autor, la reproducción total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, bajo las sanciones establecidas en las leyes, incluidos la reprografía y el tratamiento informático.
PRÓLOGO Los resultados publicados en este libro han sido la base de mi tesis doctoral, realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. La tesis, dirigida por el Doctor D. Alberto Machado de la Quintana y codirigida por las Doctoras Dª. Rocío Martínez de Pablos y Dª. Ruth Fernández Villarán, fue defendida el 30 de enero de 2009 y obtuvo una calificación de sobresaliente cum laude por unanimidad. Además, estos resultados han sido publicados en la revista Neurobiology of Aging, y presentados en el XIII Congreso de la Sociedad Española de Neurociencia celebrado en Tarragona. El punto de partida de este libro son las evidencias de que la neuroinflamación juega un papel crítico en la progresión de la enfermedad de Alzheimer, patología que se caracteriza por un patrón claro de cambios neuropatológicos que incluyen la activación de astrocitos y microglia y el aumento de citoquinas proinflamatorias. De las diferentes áreas del cerebro afectadas en esta enfermedad, el hipocampo juega un papel central por la degeneración de sus neuronas. Sin embargo, se ha demostrado que el hipocampo es altamente resistente a la muerte celular inducida por inflamación, por lo que sería necesario algún otro factor para el desarrollo de esta enfermedad. En este libro se presenta el estudio realizado para ver si el estrés crónico variable podría aumentar la susceptibilidad del hipocampo a la inflamación inducida por el lipopolisacárido (LPS) de membrana de las bacterias Gram (-). Los resultados obtenidos muestran que el estrés crónico interactúa sinérgicamente con el estímulo inflamatorio para llevar finalmente a la muerte celular, pudiendo conferir mayor susceptibilidad al daño neuronal en pacientes que sufren enfermedad de Alzheimer. Esto indica que el estrés puede ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas que tengan como base la pérdida de neuronas del hipocampo, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer. Ana María Espinosa Oliva Doctora en Ciencias Biológicas por la Universidad de Sevilla
A mis padres
.
ABREVIATURAS
Ach
Acetilcolina
AchE
Acetilcolinesterasa
ACTH
Hormona adrenocorticotropa
AINEs
Agentes antiinflamatorios convencionales no esteroideos
Akt
Proteína kinasa B
AMPA
ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico
APOE
Apolipoproteína E
AVP
Arginina-Vasopresina
Aβ
Péptido β-amiloide
BDNF
Factor neurotrófico derivado de cerebro
CaMKII
Proteína kinasa dependiente de Ca 2+-calmodulina tipo II
CE
Corteza entorrinal
COX
Ciclooxigenasa
CPF
Corteza prefrontal
CREB
Proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc
CRH
Factor liberador de corticotropina
CRH-R
Receptor del factor liberador de corticotropina
DA
Dopamina
DE
Desviación estándar
DMSO
Dimetilsulfóxido
EA
Enfermded de Alzheimer
EAE
Enfermedad de Alzheimer esporádica.
EAF
Enfermdad de Alzheimer familiar
ECSIT
Intermediario evolutivo conservado de señales en la vía Toll
EP
Enfermedad de Parkinson
ERK
Kinasas reguladas por señales extracelulares
GABA
Ácido γ-aminobutírico
GAD
Ácido glutámico descarboxilasa
GCs
Glucocorticoides
GFAP
Proteína ácida fibrilar de glía
HPA
Eje hipotalámico-pituitario-adrenal
i.p.
Intraperitoneal
IL
Interleukina
iNOS
Óxido nítrico sintasa inducible
Iκ B
Proteína de inhibición del NF-κ B
JNK
Proteinkinasas del factor de transcripción c-jun
KDO
Ácido 2-ceto-3-desoxioctanoico
LB
Medio de crecimiento Luria
LBP
Proteína de unión al LPS
LTD
Depresión a largo plazo (del inglés Long-term depression )
LTP
Potenciación a largo plazo (del inglés Long-term potentiation )
LPS
Lipopolisacárido
MAPKs
Proteínas kinasas activadas por mitógenos
NeuN
NF-κ B
NMDA
NO
NPV
Núcleos neuronales Factor nuclear κ B N-metil-D-aspartato Óxido nítrico Núcleo paraventricular
PBS
Tampón fosfato salino
PK
Proteinkinasas
PLA2
Fosfolipasa A2
PLC
Fosfolipasa C
POMC
Proopiomelanocortina
PPA
Proteína precursora amiliode
PPT
Proteínfosfatasas
PSEN
Presenilina
RG
Receptor de glucocorticoide
RLO
Radicales libres de oxígeno
RM
Receptor mineralocorticoide
s.c.
subcutáneo
SMA
Eje simpático-médulo-adrenal
SN
Sustancia negra
SNC
Sistema nervioso central
SSC
Citrato sódico salino
T6BP
Proteína de unión a TRAF6
TAB
Proteínas de unión a TAK-1
TAK
Kinasa activada por el factor de crecimiento transformante β
TBS
Tampón Tris salino
TK
Tirosinkinasas
TLRs
Receptores Toll
TNF
Factor de necrosis tumoral
TRAF-6
Factor 6 asociado al receptor de TNF
TTBS
Tampón Tris salino con Tween
INDICE
INTRODUCCIÓN
1
1. El sistema límbico.
1
1.1. Historia.
2
1.2. Anatomía.
4
1.3. Función.
6
1.4. Principales sistemas neurotransmisores relacionados con el sistema límbico.
9
2. El hipocampo.
11
2.1. Anatomía.
11
2.1.1. Capas hipocampales.
12
2.1.2. Subcapas hipocampales
15
2.2. Circuito básico hipocampal.
16
2.3. Funciones del hipocampo.
19
2.3.1. Papel en la memoria general.
21
2.3.2. Papel en la memoria espacial y en la navegación.
25
3. Enfermedades neurodegenerativas.
26
4. Enfermedad de Alzheimer.
29
4.1. Tipos de EA: familiar y esporádica.
30
4.2. Placas seniles y ovillos neurofibrilares.
32
4.2.1. Las placas seniles.
33
4.2.2. Los ovillos neurofibrilares.
34
4.3. Hipótesis de la cascada amiloide.
35
4.4. Inflamación y enfermedades neurodegenerativas.
37
4.5. Asociación entre S100β, interleukina 1 y la EA.
39
4.5.1. Efecto del S100β.
39
4.5.2. Efecto de la IL-1.
40
4.6. El tratamiento farmacológico de la EA. 5. Modelos de neurodegeneración. El lipopolisacarido. 5.1. Estructura del LPS.
42 48 49
5.2. Interacción entre el LPS y proteínas solubles de membrana.
50
5.3. Transducción de señal inducida por el LPS.
51
5.4. LPS como modelo de enfermedad de Parkinson y de sepsis. 6. El estrés y su historia.
54 56
6.1. Características de los estímulos estresantes.
59
6.2. Respuesta al estrés.
61
6.3. El eje hipotalámico-pituitario-adrenal.
66
6.3.1. El hipotálamo.
66
6.3.2. La hipófisis.
67
6.3.3. Las glándulas adrenales.
69
6.4. Receptores corticosteroides.
71
6.5. Mecanismo de retroinhibición de los glucocorticoides.
73
6.6. Estrés crónico y adaptación.
75
6.7. Cambios en el hipocampo relacionados con el estrés.
77
6.8. Neurobiología del estrés y neuroinflamación.
80
OBJETIVOS
83
MATERIALES Y MÉTODOS
87
1. Animales.
87
2. Operaciones quirúrgicas.
87
3. Tratamientos.
88
3.1. Controles.
89
3.2. Controles con estrés.
89
3.3. Tratamiento con LPS.
89
3.4. Tratamiento con LPS y estrés.
89
3.5. Tratamiento con LPS, estrés y RU486.
90
4. Modelo de estrés.
90
5. Perfusión de los animales.
92
6. Medida de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. 7. Inmunohistoquímica.
92 93
7.1. Inmunohistoquímica de OX-6, GFAP y NeuN
93
7.2. Análisis de los datos obtenidos por inmunohistoquímica.
94
8. Fluoro Jade B.
95
9. Hibridación in situ.
96
9.1. Obtención de la ribosonda.
96
9.2. Reacción de hibridación.
97
9.3. Análisis y cuantificación de la señal de hibridación.
99
10. Deshidratación y montaje de las secciones.
100
11. Cuantificación relativa de PCR a tiempo real.
101
12. Análisis de proteínas por Western blot .
102
13. Análisis estadístico.
105
14. Reactivos.
105
RESULTADOS
109
1. Cambios en el peso corporal.
109
2. Cambios en los niveles de corticosterona y progesterona en sangre.
110
3. Efecto del LPS y el estrés en la microglía.
112
4. Efecto del LPS y el estrés en la astroglía.
113
5. Efecto del LPS y el estrés en las poblaciones neuronales.
118
6. Efecto del LPS y el estrés en la expresión del ARNm de BDNF.
125
7. Efecto del LPS y el estrés en los niveles totales y fosforilados de JNK, p38, ERK, Akt, CREB y GSK-3β.
128
8. Efecto del LPS y el estrés en los niveles de TNF-α e IL-1β.
130
9. Efecto del LPS y el estrés en los niveles de iNOS y nNOS.
131
DISCUSIÓN
138
1. Efectos del estrés en las características inflamatorias inducidas por la inyección intrahipocampal de LPS. 2. Efectos del estrés y acción de los glucocorticoides sobre el
141
cerebro. 3. Prevención del daño producido por el estrés.
148 150
4. Posibles explicaciones al efecto sinérgico del estrés y la inflamación en los daños producidos en el hipocampo.
152
5. Posible relación entre el estrés y la enfermedad de Alzheimer.
153
CONCLUSIONES
156
BIBLIOGRAFÍA
158
INTRODUCCIÓN
Introducción
1. EL SISTEMA LIMBICO.
En nuestro cerebro hay varias estructuras primitivas que nos dan importantes habilidades necesarias para la supervivencia de las especies. Sistema límbico es el nombre que se le da a este conjunto de estructuras localizadas encima y alrededor del tálamo y bajo la corteza cerebral (ver imagen de localización del sistema límbico en el cerebro en http://en.wikipedia.org/wiki/Limbic_system). Es la parte más interna del cerebro y está cubierto por el fluido cerebroespinal y varios grupos de materia blanca, que no juegan un importante papel en la cognición. Al sistema límbico se le llama el “sistema mamífero viejo” o el “cerebro mamífero” en el popular modelo de cerebro triple, que divide al cerebro en tres partes dependiendo de su localización y funciones. Las otras partes son el cerebro reptil o el tallo cerebral y la corteza cerebral o neocorteza. El sistema límbico es el centro de las emociones y las motivaciones (particularmente aquellas que están relacionadas con la supervivencia, como el miedo, la cólera y las emociones relacionadas con el comportamiento sexual), los sentimientos de placer, la regulación de memorias, la interfase entre los estados emocionales y las memorias de estímulos físicos, los reguladores fisiológicos autónomos, las hormonas, las respuestas del tipo “luchar o huir”, la excitación sexual, los ritmos circadianos y algunos sistemas de decisiones. Entre las estructuras que forman parte del sistema límbico se incluyen el hipocampo, la amígdala, el giro cingulado, el fórnix, el hipotálamo, el cuerpo mamilar, el epitálamo, el núcleo accumbens, la corteza orbitofrontal, el giro parahipocampal y el tálamo. Algunas de estas estructuras y su localización se muestran en la imagen en
1
Introducción
http://www.stanford.edu/group/hopes/basics/braintut/ab5.html.
Pueden
encontrarse
estructuras análogas en casi todos los mamíferos como perros, gatos y ratones. No sucede lo mismo en el caso de los reptiles, los cuales tienen solamente un grupo cerebral. Encima del sistema límbico está la corteza cerebral, el “cerebro pensante”; el tálamo actúa como un enlace entre ellos dos. La evolución de la corteza fue dependiente del sistema límbico, ya que éste estuvo presente antes. Cada adaptación beneficiosa en la neocorteza tuvo que interoperar eficientemente con el sistema límbico para justificar su propia retención, mejorando la buena forma general del organismo. Al ser nuestro “cerebro de la emoción”, el sistema límbico es vulnerable a enfermedades en la química del cerebro y en la actividad eléctrica cerebral. Algunas de estas enfermedades son de origen genético y otras son adquiridas al desarrollarse un daño cerebral (por ejemplo, las drogas o el alcohol usados durante el embarazo, o un nacimiento difícil). Una enfermedad en el “cerebro de la emoción” puede producir emociones que están fuera de control como actos extremos de violencia, comportamiento suicida, agitación y cambios de humor.
1.1. Historia Desde una perspectiva histórica, el conocimiento de la anatomía regional del hemisferio cerebral nos ha ayudado a entender los substratos anatómicos de la emoción, el aprendizaje y la memoria. En el siglo XIX, el neurólogo francés Pierre Paul Broca fue el primero en señalar que las estructuras en forma de C de la superficie cerebral medial desempeñaban un papel importante en las emociones. En 1878 Broca denominó a esta región del cerebro “le grande lobe limbique” (Broca, 1878), porque estas estructuras rodeaban el diencéfalo y bordeaban así la corteza (en latín, limbos significa borde).
2
Introducción
También en el siglo XIX, el neuroanatomista alemán Alois Alzheimer había reconocido ya cambios patológicos característicos en el encéfalo que estaban asociados a la demencia. Estos cambios eran especialmente notables en la formación hipocampal. Así, durante este período, se establecieron las bases que implicaban a ciertas estructuras del lóbulo límbico en diversas funciones cerebrales, tales como el pensamiento, la memoria y aspectos de nuestra personalidad. Pero la mayoría de su papel funcional en la emoción fue desarrollado en 1937 cuando el neuroanatomista americano James Papez describió su modelo anatómico de emoción, el circuito de Papez (Papez, 1995). En exámenes post mortem de los cerebros de víctimas de enfermedades psiquiátricas, Papez observó cambios degenerativos en estructuras tales como el hipocampo y los cuerpos mamilares, así como en el tálamo y la corteza cingulada. A partir de estos estudios y otras consideraciones Papez propuso que la emoción no era una función de un centro del cerebro específico (como era considerada anteriormente por Cannon-Bard) sino de un circuito que implicaba cuatro estructuras básicas, interconectadas a través de haces nerviosos: el hipotálamo con sus cuerpos mamilares, el núcleo talámico anterior, el giro cingulado y el hipocampo. Este circuito sería responsable de las funciones centrales de la emoción y de sus expresiones periféricas. Más recientemente, Paul D. Maclean, aceptando las bases esenciales de la propuesta de Papez, creó la denominación de sistema límbico y añadió nuevas estructuras al circuito: las cortezas orbitofrontal y medialfrontal (área prefrontal), el giro parahipocampal e importantes agrupaciones subcorticales como la amígdala, el núcleo talámico medial, el área septal, el núcleo basal prosencefálico (el área más anterior del cerebro) y una pocas formaciones del tallo cerebral (Maclean, 1952).
3
Introducción
Desde que el término fue introducido por MacLean en 1952, el concepto del sistema límbico ha sido ampliado y desarrollado por Nauta, Heimer y otros, aunque aún queda mucha controversia sobre el uso de dicho término. Cuando se acuñó por primera vez, fue planteado como el centro emocional del cerebro, mientras que por el contrario, la cognición era tarea de la corteza. Sin embargo, esto inmediatamente fue un problema cuando se mostró que un daño en el hipocampo, una estructura límbica primaria, daba como resultado un déficit cognitivo severo. Así que, desde su principio, los límites del sistema límbico se han cambiado una y otra vez por la comunidad científica. Recientemente se han hecho intentos para salvar el concepto a través de una definición más precisa, pero todavía no hay un criterio aceptado de forma general para definir sus partes. Por esto, al ser un concepto basado más en la tradición que en los hechos, muchos científicos han sugerido que el concepto sea abandonado (Ledoux, 2003).
1.2. Anatomía. El sistema límbico incluye muchas estructuras de los hemisferios cerebrales, el diencéfalo y el mesencéfalo. Como se ha visto anteriormente, existe mucha controversia a la hora de definir sus componentes. Cada autor considera unos u otros componentes, pero los que sí son comunes en todos los autores son la amígdala, el hipocampo y la corteza de asociación límbica. En la tabla 1 se exponen las funciones que desempeñarían las estructuras que son, o han sido consideradas, parte del sistema límbico.
4
Introducción
Amígdala
Juega un importante papel en la mediación y control de las principales actividades afectivas como amistad, amor y afecto, en la expresión de humor y, principalmente en el miedo, cólera y agresión. También es responsable de determinar qué memorias son almacenadas y donde se almacenan en el cerebro.
Hipocampo
Particularmente implicado en el fenómeno de la memoria, especialmente es requerido para la formación de la memoria a corto y largo plazo
Giro parahipocampal
Papel en la formación de la memoria espacial y es parte del hipocampo
Giro cingulado
Funciones autónomas que regulan la velocidad del corazón, la presión sanguínea y el proceso cognitivo y de atención. También participa en la reacción emocional ante el dolor y en la regulación del comportamiento agresivo.
Fórnix
Lleva señales desde el hipocampo a los cuerpos mamilares y al núcleo septal
Hipotálamo
Regula el sistema nervioso autónomo mediante la producción y liberación de hormonas. Afecta y regula la presión sanguínea, la velocidad del corazón, el hambre, la sed, la excitación sexual y los ciclos del sueño
Tálamo
Es la “estación de relevo” a la corteza cerebral. Juega un papel importante en la regulación del comportamiento emocional por sus conexiones con otras estructuras del sistema límbico
Cuerpo mamilar
Importante para la formación de la memoria
Glándula pituitaria
Secreta hormonas que regulan la homeostasis.
Giro dentado
Se piensa que contribuye a las nuevas memorias y regula la felicidad.
Cortezas entorrinal y piriforme
Reciben aferencias del sistema olfativo
Bulbo olfativo
Núcleo de entrada sensorial olfativo
Núcleo accumbens
Implicado en recompensa, placer y ambición.
Corteza orbiofrontal
Requerida para tomar decisiones
Tabla 1. Estructuras que son, o han sido consideradas, parte del sistema límbico y sus funciones.
5
Introducción
1.3. Función. La función de las estructuras denominadas colectivamente sistema límbico es clave para la conducta humana normal. Las diversas funciones del sistema límbico incluyen importantes papeles en la memoria, la emoción, el control de las funciones viscerales y la olfación. El hecho de que seamos tal como somos (con nuestros recuerdos, nuestra propia personalidad, nuestros pensamientos) depende en gran medida de las funciones de las distintas regiones cerebrales que forman el sistema límbico. De hecho, la disfunción de muchas de estas estructuras subyace a prácticamente la totalidad de las enfermedades psiquiátricas. El sistema límbico es difícil de estudiar, en parte por el número increíblemente grande de interconexiones entre sus muchas estructuras. Opera por influencia del sistema endocrino y del sistema nervioso autónomo. Está altamente interconectado con el núcleo accumbens, el centro del placer del cerebro, que juega un papel en la excitación sexual y la debida a drogas. Estas respuestas son moduladas por las proyecciones dopaminérgicas desde el sistema límbico. El sistema límbico está también fuertemente conectado con la corteza prefrontal (CPF). Algunos científicos sostienen que esta conexión está relacionada con el placer obtenido tras la resolución de problemas. Para curar enfermedades emocionales severas, esta conexión fue cortada quirúrgicamente por un procedimiento de psicocirugía llamado lobotomía prefrontal. Los pacientes que experimentaron este procedimiento a menudo llegaron a ser pasivos y carentes de motivación. Veamos con más detalle estas conexiones entre componentes del sistema límbico y los sistemas efectores. ¿Cuál podría ser la función de las incontables interconexiones que existen dentro del sistema límbico? Muchas de las conexiones del
6
Introducción
sistema límbico guardan relación con la expresión conductual de las emociones. En última instancia, unas complejas vías polisinápticas vinculan las estructuras del sistema límbico con los tres sistemas efectores para la expresión conductual de la emoción: los sistemas motores endocrino, autónomo y somático (Fig. 1).
A.
Control neuroendocrino Amígdala (central, corticomedial)
Hipotálamo medial (núcleo medial ventral)
Hipotálamo periventricular (núcleo arqueado)
Hipófisis anterior
B.
Control autónomo
Amígdala (central)
Hipotálamo (medial y lateral)
Órganos diana periféricos
C.
Tronco encefálico y núcleos autónomos espinales
Neuronas postganglionares
Control motor somático Amígdala (central)
Sustancia gris periacueductal Hipotálamo lateral
Musculatura esquelética
Fig. 1. Relaciones entre el sistema límbico y los sistemas efectores.
7
Formación reticular
Médula espinal
Introducción
Las vías por las que el sistema límbico podría influir en la secreción de la hormona hipofisaria implican conexiones indirectas entre la amígdala y el hipotálamo periventricular. Una de estas vías, por ejemplo, implica la proyección desde la amígdala corticomedial al núcleo ventromedial. Este núcleo, a su vez, proyecta a un componente clave del sistema neurosecretorio parvocelular, el núcleo arqueado. Las consecuencias viscerales de las emociones están mediadas por conexiones directas e indirectas a núcleos del sistema nervioso autónomo. El núcleo amigdaloide central proyecta directamente al tronco encefálico y a centros autónomos espinales. La amígdala afecta también indirectamente a la función autónoma, a través de proyecciones al hipotálamo. Las conexiones con el hipotálamo lateral influyen en la función autónoma a través de diversos mecanismos, incluidos los circuitos neurales de la formación reticular y otras partes del hipotálamo. La mayoría de los signos conductuales de la emoción que se manifiestan, como las reacciones de lucha o huída, están mediados por las acciones del sistema límbico sobre los sistemas motores somáticos, especialmente los tractos reticuloespinales. Por ejemplo, hay proyecciones directas (e indirectas) desde el hipocampo, los núcleos septales y la amígdala al hipotálamo lateral el cual, a su vez, puede influir en el sistema reticuloespinal. Estas conexiones podrían ser importantes para desencadenar reacciones estereotipadas de defensa. Estudios experimentales con animales han demostrado igualmente que la sustancia gris periacueductal media conductas motoras que son típicas de especies concretas, tales como el gruñido y el silbido de los carnívoros. La sustancia gris periacueductal recibe aferencias del núcleo central de la amígdala, así como del hipotálamo. El sistema límbico puede influir igualmente en las funciones motoras somáticas, en formas mucho más complejas y flexibles conductualmente, a través del circuito límbico de los ganglios basales, que incluye al estriado ventral, al 8
Introducción
globo pálido ventral y al tálamo dorsal medial. Las aferencias corticales de este circuito provienen de áreas límbicas de asociación y de la formación hipocampal. La salida del circuito límbico se dirige a las áreas límbicas de asociación del lóbulo frontal.
1.4. Principales sistemas neurotransmisores relacionados con el sistema límbico. Mientras que la mayoría de las regiones del cerebro reciben inervación por parte de uno o más de los principales sistemas de neurotransmisores de regulación, la inervación del sistema límbico parece ser particularmente importante para el pensamiento, el estado de ánimo y la conducta normal. Se establece esta conclusión debido a que muchas de las drogas utilizadas para tratar enfermedades psiquiátricas, trastornos del pensamiento y estados de ánimo, afectan selectivamente a uno de los sistemas neurotransmisores. Estos sistemas neurotransmisores tienen conexiones directas y amplias con el sistema límbico: ● Las proyecciones
dopaminérgicas del mesencéfalo se originan en el área ventral
tegmental y la parte compacta de la sustancia negra (SN). Desplazándose a través del haz prosencefálico medial y del tracto nigrostriatal, las fibras dopaminérgicas sinaptan con neuronas en el área de asociación prefrontal, la corteza de asociación límbica del lóbulo frontal medial, la circunvolución del cíngulo, el estriado, la amígdala y la formación hipocampal. Muchas drogas antipsicóticas bloquean a los receptores de la dopamina (DA), y una excesiva concentración de dopamina en las estructuras límbicas podría contribuir a la esquizofrenia. ●
Las proyecciones serotoninérgicas a estructuras del sistema límbico del
telencéfalo y el diencéfalo se originan en el núcleo del rafe dorsal y medio.
9
Introducción
Recorriendo tres tractos, el fascículo medial del prosencéfalo, el fascículo longitudinal dorsal y el fascículo longitudinal medial, la proyección serotoninérgica ascendente sinapta con neuronas de la amígdala, la formación hipocampal, el estriado y la corteza. Las drogas que bloquean los mecanismos de recaptación de la serotonina son efectivas para tratar los trastornos del estado de ánimo, incluidos los trastornos de ansiedad y obsesivo-compulsivos. ●
La proyección noradrenérgica, que se origina en el locus coeruleus, influye en
toda la corteza, incluidas las áreas de asociación límbica, así como en las estructuras límbicas y otras estructuras subcorticales. Junto con el serotoninérgico, este sistema podría desempeñar un papel en la depresión. ●
La proyección colinérgica se origina en grandes neuronas localizadas cerca de la
superficie telencefálica ventral. Las neuronas se hallan en el núcelo basal, el núcleo
septal medial y el núcleo de la banda diagonal (de Broca). Hay grupos adicionales de células colinérgicas, con proyecciones corticales amplias, en el tronco encefálico, cerca del núcleo tegmental pedunculopontino y el hipotálamo lateral. Las dianas de esta proyección incluyen toda la neocorteza (incluida la corteza de asociación límbica), la amígdala y la formación hipocampal. La enfermedad de Alzheimer (EA), caracterizada por una demencia progresiva, se inicia con una pérdida de estas neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal. A medida que avanza la enfermedad, resultan también afectados otros sistemas de neurotransmisores.
10
Introducción
2. EL HIPOCAMPO.
En 1564, el anatomista italiano Giulio Cesare Aranzi fue el primero en utilizar el término hipocampo para describir una zona cerebral que guardaba gran semejanza física con el caballito de mar. Este órgano se relacionó inicialmente con el sentido del olfato, más que con su conocida función en la adquisición de la memoria, por su localización próxima a la corteza olfativa. El ruso Vladimir Bekhterev ya señaló la importancia del hipocampo en la memoria alrededor de 1900, basándose en observaciones sobre un paciente con un problema grave de amnesia. Sin embargo, durante muchos años, el conocimiento convencional del hipocampo era que, como el resto del sistema límbico, era responsable de la emoción. El hipocampo es una de las partes filogenéticamente más antiguas y, como se discutirá más adelante, juega un papel principal en la memoria a corto y largo plazo y en la navegación espacial. En la EA, es una de las primeras regiones del cerebro en sufrir daño; problemas de memoria y de desorientación aparecen entre los primeros síntomas. El daño al hipocampo puede resultar también por la falta de oxígeno (anoxia), encefalitis o epilepsia del lóbulo temporal.
2.1. Anatomía. El hipocampo es una parte del cerebro localizada en la región inferior del lóbulo temporal. Tiene una apariencia generalmente similar a través de la gama de especies mamíferas. Los humanos y otros mamíferos tienen dos hipocampos, uno a cada lado del cerebro. En los roedores, donde se ha estudiado más extensamente, el hipocampo tiene forma de un par de bananas unidas por los cabos; mientras que en los humanos tiene
11
Introducción
forma curvada y convoluta que recordaba a los primeros anatomistas a un caballo de mar. De hecho, el nombre deriva de la palabra griega que significa caballo de mar (hippos = caballo; campos = monstruo del mar). Su forma también se ha comparado con los cuernos del dios egipcio Amun, de la mitología griega, quien tenía la cabeza de un carnero.
2.1.1. Capas hipocampales. El hipocampo está compuesto por múltiples capas y subcapas. Aunque la terminología varía entre los autores, los términos más frecuentemente utilizados son giro dentado y el cornu ammonis (literalmente “cuernos de Amun”, abreviado CA). El giro dentado contiene la fascia dentata y el hilus (también denominado CA4), mientras que el CA se diferencia en capas CA1, CA2 y CA3 (ver imagen en http://wapedia.mobi/es/Hipocampo_(anatom%C3%ADa)?t=3). Cortado en sección transversal, el hipocampo es una estructura en forma de C que, como ya se ha mencionado, se parece a los cuernos de un carnero. El aspecto en forma de cuerno del hipocampo es causado por las diferentes densidades celulares y por la existencia de diferentes grados de fibras neuronales. Como se muestra en la imagen anterior, la estructura es curvada y, a lo largo de ella, se definen subcapas o regiones que van desde CA4 hasta CA1. Las regiones CA están todas llenas de células piramidales densamente empaquetadas parecidas a las de la corteza, y están también estructuradas en estratos o capas claramente definidos (ver atlas de cerebro de Paxinos y Watson, 1986):
12
Introducción
•
El alveus es la capa más superficial y contiene los axones de las neuronas
piramidales que se dirigen hacia la fimbria/fórnix, una de las principales eferencias del hipocampo. Stratum oriens (str. oriens)
es la siguiente capa debajo del alveus. Los cuerpos
celulares de las células cesta inhibitorias y las células trilaminares horizontales están localizados en este estrato. Las dendritas basales de las neuronas piramidales se encuentran también aquí, donde reciben aferencias de las otras células piramidales, de fibras septales y de fibras comisurales del hipocampo contralateral. En roedores los dos hipocampos están altamente conectados, pero en primates esta conexión comisural es mucho más escasa. Stratum pyramidale (str. pyr.)
contiene los cuerpos celulares de las neuronas
piramidales que son las principales neuronas excitatorias del hipocampo, y también los cuerpos celulares de muchas interneuronas, incluyendo las células axo-axónicas, las células biestratificadas y las células trilaminares radiales. Este estrato tiende a ser uno de los más visibles a simple vista. Stratum lucidum (str. luc.)
es uno de los estratos más finos en el hipocampo. Las
fibras musgosas de las células granulares del giro dentado pasan a través de este estrato en CA3, aunque también se pueden encontrar sinapsis de estas fibras en la región CA3. Stratum radiatum (str. rad.),
como el str. oriens, contiene fibras septales y
comisurales. Contiene también fibras colaterales de Schaffer que son la proyección de CA3 a CA1. Algunas interneuronas que se encuentran en capas más superficiales también se pueden encontrar aquí, incluyendo las células en cesta, las células biestratificadas y las células trilaminares radiales.
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Introducción
• Stratum lacunosum (str. lac.) es un estrato delgado que contiene fibras colaterales
de Schaffer, así como fibras de la vía perforante de las capas superficiales de la corteza entorrinal (CE). Debido a su pequeño tamaño, a menudo se agrupa con el stratum moleculare en un stratum único llamado stratum lacunosum-moleculare (str. l-m.).
Stratum moleculare (str. mol.)
es el estrato más profundo en el hipocampo. Aquí
las fibras de la vía perforante forman sinapsis con las dendritas distales, apicales de las células piramidales. El surco hipocampal (sulc.) o fisura es una región libre de células entre la CA1 y el giro dentado.
El giro dentado es realmente una estructura separada, una capa empaquetada de pequeñas células granulares envueltas alrededor del final del propio hipocampo, formando una cuña puntiaguda en algunas secciones, y un semicírculo en otras. Está compuesto también por una serie de estratos similares: La capa polimórfica es la capa más superficial del giro dentado y a menudo se considera una subcapa separada (ver CA4/hilus más abajo). Esta capa contiene muchas interneuronas y los axones de las células granulares dentadas pasan a través de este estrato hasta la CA3. Stratum granulosum (str. gr.)
contiene los cuerpos celulares de las células
granulares del giro dentado. Stratum moleculare 1/3 (str. mol. 1/3) es por donde las fibras comisurales del giro
dentado contralateral discurren y forman sinapsis y allí donde las aferencias del septum medial terminan, ambos en las dendritas proximales de las células granulares.
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Introducción
Stratum moleculare 2/3 (str. mol. 2/3)
es el más profundo de los estratos,
hallándose justo superficial a la fisura hipocampal a través del stratum moleculare en las capas CA. Las fibras de la vía perforante corren a través de este estrato, haciendo sinapsis excitatorias en las dendritas apicales distales de las células granulares.
2.1.2. Subcapas hipocampales. La fascia dentata es la etapa más temprana del circuito hipocampal. Sus neuronas principales son diminutas células granulares que dan origen a axones desmielinizados llamados fibras musgosas. La fascia dentata de la rata contiene aproximadamente 1.000.000 de células granulares. Ésta y el hilus forman el giro dentado.
Región CA4 es llamada a menudo hilus o región hilar cuando se considera parte del giro dentado, ya que las neuronas aquí no tienen morfología piramidal como las de las áreas CA1 y CA3 (sugerido por Lorente de No, 1934, y verificado por David G. Amaral, 1978). Esta región contiene células musgosas que primeramente reciben aferencias de las células granulares localizadas cerca del giro dentado en forma de fibras musgosas.
Región CA3 contiene células piramidales, de las que aproximadamente hay unas 200.000 en cada hemisferio de la rata.
Región CA2 es una pequeña región localizada entre CA3 y CA1. En la rata recibe aferencias de la capa II de la CE, pero no recibe fibras musgosas del giro dentado. Sus células piramidales son más similares a las de CA3 que a las de CA1, por lo que se agrupa como una región separada. Debido a su pequeño tamaño, es a menudo ignorada en las discusiones del hipocampo, pero su alta resistencia al daño epiléptico la hace notable.
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Introducción
Región CA1 es la primera región en el circuito del hipocampo que produce una ruta de eferencia significativa, la cual va a la capa V de la CE. También envía una eferencia significativa hacia el subiculum. En la rata, CA1 contiene aproximadamente 250.000 células piramidales. El subiculum es el punto final del circuito del hipocampo. Como CA1, manda eferencias a la capa V de la CE.
2.2. Circuito básico hipocampal. Empezando por el giro dentado atravesaremos una serie de zonas estrechas. A continuación del giro dentado vienen una serie de áreas CA: primero CA4 (que se sitúa bajo el giro dentado), luego CA3, luego una zona muy pequeña llamada CA2, y a continuación CA1. Después de CA1 viene un área llamada el subiculum, tras la cual vienen un par de áreas mal definidas llamadas presubiculum y parasubiculum, y a continuación una transición a la propia corteza (principalmente al área entorrinal de la corteza). La mayoría de los anatomistas usan el término “propio hipocampo” para referirse a las cuatro capas CA, y “formación hipocampal” para referirse al propio hipocampo más el giro dentado y el subiculum (Amaral y Lavenex, 2006). Las principales vías de señalización que fluyen a través del hipocampo se combinan para formar un lazo (Fig. 2). La aferencia más externa viene desde la CE contigua, a través de los axones de la llamada vía perforante (llamada así porque los axones penetran a través del subiculum y el espacio que lo separa del giro dentado). Estos axones surgen de las capas II/IV (principalmente de la capa II) de la CE y terminan en las células granulares del giro dentado y en las células piramidales de la región CA3. Hay también una vía distinta desde las capas III/V de la CE directamente a
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Introducción
las células piramidales de CA1 y al subiculum. La vía perforante se puede dividir en vías lateral y medial, dependiendo de si las fibras surgen de la CE medial o lateral. Fue en esta vía donde se descubrió por primera vez la potenciación a largo plazo o LTP. Las células granulares del giro dentado mandan sus axones (llamados fibras
musgosas) a las células piramidales de CA3, formando su principal aferencia. Las células piramidales de CA3 combinan esta aferencia con señales de la capa II de la CE y mandan sus axones (llamados colaterales de Schaeffer) a la región CA1. Las células piramidales de CA1 mandan sus axones al subiculum y a las capas profundas de la CE, formando la principal eferencia del hipocampo. La conexión desde CA1 al subiculum permite una disposición anatómica estricta: el final distal de la región CA1 proyecta al final proximal del subiculum, es decir, aquellas células más cerca de la unión CA1- Sub están conectadas, y aquellas más lejanas están conectadas. Las proyecciones a la CE permiten un modelo similar, de tal manera que CA1 distal/ Sub proximal proyectan a la CE lateral, mientras que CA1 proximal/ Sub distal proyecta a la CE medial. La aferencia a estas células de la CE permite el mismo modelo, es decir, CA1 distal/ Sub proximal recibe aferencia de la CE lateral mientras que CA1 proximal/ Sub distal recibe aferencia de la CE medial. El subiculum es la etapa final en la vía y es también responsable de la eferencia del hipocampo: las neuronas subiculares combinan la información de la proyección de CA1 y de la capa III de la CE y mandan sus axones principalmente a la CE (a la capa V), pero también proyecta a muchas otras áreas, incluyendo el núcleo accumbens, el núcleo talámico anterior, el núcleo mamilar medial, el septum lateral y el presubiculum.
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Introducción
CA1
Sb
CS CE FM
VP GD
CA3
Fig. 2. Esquema representativo de las aferencias y eferencias del hipocampo. CE, corteza entorrinal; GD, giro dentado; VP, vía perforante; FM, fibras musgosas; CS, colaterales de Schaeffer; Sb, subiculum.
Dentro de este circuito básico existen otras muchas proyecciones al hilus, a CA2 y conexiones recurrentes en CA1 y CA3 (conexiones que salen de una capa y terminan en la misma capa). Es esencialmente una vía continua que empieza en la corteza sensorial, atraviesa el hipocampo y regresa a la corteza sensorial. De esta manera, en algún lugar, nace la memoria. Además de la CE, el hipocampo también recibe un número de aferencias subcorticales, proyecciones monosinápticas directas del núcleo cerebellar fastigial (Heath y Harper, 1974) y aferencias GABAérgicas y colinérgicas desde el septum medial y la banda diagonal de Broca. La vía perforante que va al giro dentado, de ahí a CA3 y luego a CA1 recibió el nombre de “circuito trisináptico” por Per Andersen, quien anunció que se podían cortar capas delgadas del hipocampo perpendiculares a lo largo de su eje, de manera que se conservan todas estas conexiones. Esta observación fue la base de su hipótesis lamelar, 18
Introducción
que propuso que se puede pensar en el hipocampo como una serie de tiras paralelas, que operan de una manera funcionalmente independiente (Andersen y col., 1971). El concepto lamelar es considerado todavía a veces como un principio de organización útil, pero se ha modificado sustancialmente por datos más recientes que muestran las extensas conexiones longitudinales dentro del sistema hipocampal (Andersen y col., 2000).
2.3. Funciones del hipocampo. Como ya se ha mencionado anteriormente, quizás la idea más temprana fue que el hipocampo estaba implicado en el sentido del olfato, pero actualmente esta idea se ha abandonado. En todos los años, tres ideas principales de la función del hipocampo han dominado la literatura: inhibición, memoria y espacio. La teoría de la inhibición conductual fue muy popular en los años 60. Su fuerza derivó mucho de dos observaciones: primero, los animales con daño en el hipocampo tienden a ser hiperactivos; segundo, los animales con daño hipocampal tienen a menudo dificultades para aprender a inhibir respuestas que les han sido enseñadas previamente. Jeffrey Gray desarrolló esta línea de pensamiento en una teoría del papel del hipocampo en la ansiedad (Gray y McNaughton, 2000). Sin embargo, la teoría de la inhibición no es muy popular en la actualidad. La segunda línea importante de pensamiento relaciona al hipocampo con la memoria. Aunque tiene precursores, la principal fuerza de esta idea derivó de un informe muy conocido de Scoville y Milner (Scoville y Milner, 1957) sobre los resultados de la destrucción quirúrgica del hipocampo en el paciente H.M. A este
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Introducción
paciente se le eliminaron, de forma bilateral, varias estructuras del lóbulo temporal medial (incluyendo la eliminación de su hipocampo) para aliviarle los frecuentes ataques epilépticos que sufría. A partir de esta intervención, H.M. sufrió deterioros de memoria anterógrada (pérdida de la habilidad de formar nuevos recuerdos) y retrógrada (pérdida del acceso a los recuerdos anteriores al daño) parcialmente graduada (tales deterioros son el tema de la película Memento). De particular importancia fue el hecho de que HM fue todavía capaz de aprender tareas procedimentales (las cuales están asociadas con el estriado) y tenía un coeficiente intelectual por encima de la media, por lo que HM demostró una impresionante disociación entre inteligencia y memoria declarativa. Este caso ocasionó tal interés que H.M. es conocido hoy en día como el caso médico más intensamente estudiado en la historia. En los siguientes años, otros pacientes con niveles similares de daño hipocampal y amnesia (causados por accidente o enfermedad) han sido también estudiados, y miles de experimentos han estudiado la fisiología de la plasticidad neuronal en el hipocampo. Actualmente hay un acuerdo casi universal de que el hipocampo juega alguna clase de papel importante en la memoria episódica o autobiográfica (formación de nuevos recuerdos asociados a la experiencia); sin embargo, la naturaleza exacta de este papel permanece en extenso debate (Squire y Schacter, 2002; Eichenbaum y Cohen, 1993). La tercera línea importante de pensamiento relaciona al hipocampo con el espacio. La teoría espacial fue defendida originalmente por O’Keefe y Nadel, quienes fueron influenciados por las teorías de Edward Chace Tolman acerca de los “mapas cognitivos” en humanos y animales. O’Keefe y su estudiante Dostrovsky descubrieron, en 1971, neuronas en el hipocampo de la rata que parecían mostrar actividad confinada con la localización de la rata dentro de su ambiente. O’Keefe y sus colaboradores, especialmente Lynn Nadel, continuaron investigando esta cuestión, en una línea de 20
Introducción
trabajo que finalmente les llevó en 1978 a su influyente libro llamado “El hipocampo como un mapa cognitivo” (O’Keefe y Nadel, 1978). Como con la teoría de la memoria, actualmente no hay un acuerdo universal de esta función del hipocampo, pero los detalles son extensamente debatidos.
2.3.1. Papel en la memoria general. Debido a la falta de consenso sobre el papel exacto del hipocampo en la memoria, algunos investigadores prefieren considerar al hipocampo como parte del lóbulo temporal medio, un sistema más grande responsable de la memoria declarativa (memorias que pueden invocarse de forma explícita; éstas incluirían, por ejemplo, la memoria semántica de hechos además de la memoria episódica) (Squire, 1992). Algunas evidencias apoyan la idea de que, aunque los recuerdos a menudo permanecen toda una vida, el hipocampo deja de desempeñar un papel crucial en la retención de la memoria después de pasado el período de consolidación de la misma (Squire y Schacter, 2002); por lo que esta permanencia de memorias más viejas lleva a la idea de que la consolidación en el tiempo implica la transferencia de memorias fuera del hipocampo a otras partes del cerebro. Según esto, el hipocampo es crítico para la formación de nuevas memorias, por lo que puede que funcione como una “puerta” para la memoria, a través de la cual las nuevas memorias deben pasar antes de entrar en el almacén permanente en el cerebro. Por tanto, el daño al hipocampo puede resultar en amnesia anterógrada, es decir, en una pérdida de la habilidad para formar nuevas memorias, aunque las memorias más viejas pueden ser salvadas. Así, alguien que sufre un daño en el hipocampo puede tener una buena memoria de su niñez y de los años antes del daño, pero relativamente poca memoria de todo lo que ocurrió a partir del daño. Pero el daño al hipocampo normalmente también puede afectar al acceso a los 21
Introducción
recuerdos anteriores al daño (amnesia retrógrada), por lo que su papel en el mantenimiento de estas viejas memorias permanece incierto . El daño al hipocampo no afecta a algunos aspectos de la memoria tales como la capacidad de aprender nuevas habilidades (tocar un instrumento musical, por ejemplo), lo que sugiere que tales habilidades dependen de un tipo diferente de memoria (memoria procesal) y de diferentes regiones del cerebro. Dado que las neuronas se comunican vía sinapsis químicas y que las memorias se creen que se almacenan en estas sinapsis, hoy en día se consideran dos procesos como los mecanismos moleculares que subyacen en el aprendizaje y la memoria. Estos procesos son: 1) la potenciación a largo plazo (LTP) y 2) la depresión a largo plazo (LTD), proceso opuesto de la LTP.
1) LTP. El sistema nervioso necesita modificar continuamente su estructura y su función para adaptarse a las necesidades del medio ambiente. Estas modificaciones es lo que se denomina plasticidad neuronal. Un aspecto de la plasticidad neuronal es el aprendizaje, que se puede definir como la modificación de la conducta del organismo debido a la experiencia previa. Durante el aprendizaje, se producen cambios en las sinapsis, tanto funcionales como anatómicas. Estos cambios consisten, en gran parte, en que las sinapsis cuya actividad presináptica se asocia con la activación postsináptica, se hacen más potentes. A esta potenciación sináptica que puede durar un tiempo prolongado (horas o días), es a lo que se le denomina LTP. Este tipo de LTP se denomina asociativa, porque precisa de la asociación entre la activación de la terminación presináptica y de la neurona postsináptica. También se denomina potenciación de tipo hebbiano, por D.O. Hebb que en 1949 predijo la
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Introducción
existencia de este fenómeno y propuso que podría ser el mecanismo subyacente en el aprendizaje y la memoria. Aunque la LTP fue descrita por primera vez en el hipocampo en 1973, posteriormente se ha demostrado en otras regiones del cerebro, incluyendo zonas neocorticales. Sin embargo, donde se ha estudiado más extensamente es en tejidos del hipocampo. Actualmente no se poseen todos los datos necesarios que permitan perfilar una imagen clara del proceso que subyace al fenómeno de la LTP, pero sí existen consensos generales que permiten dar una descripción de este mecanismo: lo que parece que sucede es que cuando los axones que hacen conexiones con las neuronas piramidales del hipocampo son expuestos a un estímulo de alta frecuencia, la amplitud del potencial excitatorio medido en estas neuronas aumenta por un largo período (durante varias semanas). El neurotransmisor liberado en estas sinapsis es el glutamato. Éste se une a varios subtipos diferentes de receptores en la neurona postsináptica. Dos de estos subtipos, los receptores AMPA (acido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazolpropiónico) y NMDA (N-metil-D-aspartato), son especialmente importantes en la LTP. El receptor AMPA está emparejado con un canal iónico, de manera que cuando el glutamato se une a este receptor, este canal permite la entrada de iones sodio en la neurona postsináptica. Este influjo de sodio hace que la dendrita postsináptica se despolarice localmente, y si esta despolarización alcanza el nivel crítico para desencadenar un potencial de acción, el impulso nervioso se transmite a la próxima neurona. El receptor NMDA también está emparejado con un canal iónico, pero este canal admite la entrada de iones calcio en la célula postsináptica. Cuando esta célula está en potencial de reposo, el canal de calcio está bloqueado por iones magnesio, de manera 23
Introducción
que incluso si el glutamato se une al receptor, el calcio no puede entrar en la neurona. Para que estos iones magnesio se retiren del canal, el potencial de membrana de la dendrita debe estar despolarizado. ¿Y qué es exactamente lo que sucede durante la estimulación de alta frecuencia que causa el LTP? Que la neurona postsináptica se despolariza por la activación sostenida de sus receptores AMPA. El magnesio entonces se retira del receptor NMDA y permite que entre un gran número de iones de calcio a la célula. Esta concentración aumentada de calcio en la dendrita hace que se den varias reacciones químicas que hacen a esta sinapsis más eficiente durante más tiempo. Estos iones de calcio son mensajeros intracelulares extremadamente importantes que activan muchas enzimas alterando la conformación de éstas. Una de estas enzimas es la calmodulina, que se activa cuando se le unen 4 iones Ca 2+, formándose el principal segundo mensajero para la LTP: la Ca2+-calmodulina. Ésta activa a otras enzimas que juegan papeles claves en este proceso, tales como la adenilato ciclasa y la proteína kinasa dependiente de Ca 2+calmodulina tipo II (CaMKII). Estas enzimas modifican la conformación espacial de otras moléculas, normalmente añadiéndoles un ión fosfato, por lo que el resultado final es la fosforilación de otras proteínas, algunas de las cuales hacen que los receptores AMPA permanezcan abiertos durante más tiempo o dan lugar a la creación de nuevos receptores AMPA, y otras son translocadas al núcleo (Dudai, 1989) de modo que se activan determinados genes, los cuales codifican a proteínas destinadas a modificar (de forma transitoria o permanente), la constitución de la célula. Todo esto contribuye a aumentar la eficiencia de las sinapsis (ver imagen del mecanismo responsable de la LTP en http://thebrain.mcgill.ca/flash/a/a_07/a_07_m/a_07_m_tra/a_07_m_tra.html). Para permitir la entrada de calcio a la célula, el receptor NMDA debe ser activado por glutamato y sometido a despolarización simultáneamente. La necesidad de 24
Introducción
estas dos condiciones simultáneas da a este receptor propiedades asociativas. Esto le permite detectar la coincidencia de dos sucesos y hacerlo el elemento clave en la LTP. Pero si este receptor es bloqueado por una droga o si el gen implicado en su construcción no es válido, la LTP no puede suceder.
2) LTD. En el hipocampo se piensa que el papel de la LTD es volver las sinapsis que han sido potenciadas por LTP a niveles normales y así poderse almacenar nueva información. La LTD parece presentarse en respuesta a un incremento más pequeño de calcio en la célula postsináptica, por una activación de la neurona presináptica a baja frecuencia, lo que se acompaña por una sensibilidad menor en los receptores de la membrana. En este caso se activan fosfatasas que desfosforilan a los receptores AMPA. En el hipocampo, el efecto de esta desfosforilación de los receptores AMPA sería reducir la amplitud del potencial postsináptico al nivel normal al que estaba antes de que sucediera la LTP. En resumen, sucede lo opuesto a lo que sucedía en el caso de la LTP (ver
imagen
del
mecanismo
responsable
de
la
LTD
en
http://thebrain.mcgill.ca/flash/a/a_07/a_07_m/a_07_m_oub/a_07_m_oub.html).
2.3.2. Papel en la memoria espacial y en la navegación. Las evidencias sugieren que el hipocampo almacena y procesa la información espacial. Ciertas células del hipocampo, silenciosas la mayor parte del tiempo, presentan dosis de descarga eléctrica repentinas cuando el animal se encuentra en ciertos emplazamientos de su entorno. Estas son las “células de lugar”, cuya actividad eléctrica está relacionada con la posición del animal en el espacio. Algunas de estas células 25
Introducción
presentan descargas eléctricas cuando el animal se encuentra a sí mismo en una ubicación en particular, sin tener en cuenta la dirección del recorrido; mientras que la mayoría son al menos parcialmente sensibles a la dirección de la cabeza y del recorrido. Actualmente se han visto células de lugar en humanos implicadas en encontrar su camino en una ciudad de realidad virtual. Los encuentros resultaron de la investigación con individuos con electrodos implantados en sus cerebros como una parte diagnóstica de un tratamiento quirúrgico para epilepsias serias. El descubrimiento de las células de lugar llevó a la idea de que el hipocampo podría actuar como un mapa cognitivo, una representación neural de la disposición del entorno. Una evidencia reciente ha lanzado la duda de esta perspectiva, indicando que el hipocampo podría ser crucial para procesos más fundamentales dentro de la navegación. A pesar de todo, estudios con animales han demostrado que se requiere un hipocampo intacto para las tareas de memoria espacial simple (por ejemplo, encontrar el camino de vuelta a una meta oculta). Sin un hipocampo completamente funcional, los humanos no podrían recordar dónde han estado ni cómo conseguir llegar a donde van. Los investigadores creen que el hipocampo desempeña un papel particularmente importante en encontrar atajos y nuevas rutas entre lugares familiares. Algunas personas exhiben más destreza en esta clase de navegación que otras, y las imágenes del cerebro muestran que estos individuos tienen los hipocampos más activos al navegar.
3. ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS.
En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las llamadas “demencias degenerativas primarias”, de especial importancia por su
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Introducción
alta frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un índice de envejecimiento creciente, típicas de los países desarrollados. Se trata de un grupo heterogéneo de enfermedades caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables de pérdida de memoria, alteraciones del juicio, el cálculo, el lenguaje, la orientación, las habilidades y la conducta, y trastornos psiquiátricos. Los hallazgos anatomopatológicos de este grupo de enfermedades consisten en la pérdida de neuronas, localizadas preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios degenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteración vascular y de la glía. La localización de la pérdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y de las inclusiones son los factores que diferencian a las distintas afecciones (Bird y Miller, 2005). Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas serían las demencias frontotemporales, la demencia con cuerpos de Lewy difusos y la EA. Esta última es el prototipo de enfermedad demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la más frecuente y la mejor estudiada (Sarasa, 2006). Sin embargo, a medida que el interés por el estudio de las funciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobado que existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neurológicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebelosas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofias musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson (EP) (Campos-Romo, 2008; Ostrosky-Solís, 2000), el temblor esencial (Benito-Leon y col., 2006), la enfermedad de Huntington (García-Ramos y col., 2007; Ward y col., 2006), la parálisis supranuclear progresiva (Millar y col, 2006), las ataxias hereditarias (Mantovan y col., 2006), la esclerosis lateral amiotrófica (García-Moreno y col., 2001) y las miopatías (D’Angelo y Bresolin, 2006). 27
Introducción
Es de destacar que prácticamente todas las enfermedades neurológicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, incluidas las traumáticas, vasculares, infecciosas,
inflamatorias,
desmielinizantes,
tumorales,
iatrogénicas,
tóxicas,
metabólicas o psiquiátricas, se han asociado con deterioro intelectual o demencia (Caselli, 2004). También algunas enfermedades sistémicas, como el dolor crónico (Branca, 2006) o las afecciones reumáticas (Hanly y col., 2005) y digestivas (Lackner y col., 2006a, b), se han asociado con la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la ubicuidad de la disfunción intelectual en la patología humana, junto con el hecho de que la alteración cognitiva es siempre una causa importante de incapacidad para el paciente, y de estrés y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la sociedad en general, subraya la importancia del problema y la necesidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los mecanismos patogénicos y el tratamiento de estos trastornos. Pese al espectacular avance de las técnicas y los conocimientos en neuroimagen, neuroquímica, neurogenética, neuropsicología, neurofisiología y neurofarmacología, la investigación con pacientes presenta importantes limitaciones que hace imprescindibles los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfunción. El hipocampo es particularmente vulnerable a varias enfermedades entre las que se incluyen la isquemia (que es cualquier obstrucción del flujo sanguíneo o deprivación de oxígeno), la EA y la epilepsia. Estas enfermedades atacan selectivamente a la región CA1, por lo que cortan el circuito hipocampal. Pero debe haber un daño bilateral de los hipocampos para que la memoria se afecte. Por lo tanto, solamente situaciones que reduzcan el flujo sanguíneo o de oxígeno al cerebro entero producirán un déficit de memoria. La epilepsia del lóbulo temporal severa parece muy similar al daño isquémico. La EA, aunque afecta al cerebro entero, es particularmente dura sobre la región CA1.
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Introducción
4. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. En 1901 ingresó una paciente de 51 años de edad en el hospital de Francfurt con un llamativo cuadro clínico de 5 años de evolución que tras comenzar con un delirio celotípico había sufrido una rápida y progresiva pérdida de memoria, alucinaciones, desorientación espaciotemporal, paranoia, trastornos de la conducta y un grave trastorno del lenguaje. Alois Alzheimer, neurólogo alemán de finales del siglo XIX, estudió las características clínicas de la enfermedad que sufría la paciente y además, una vez fallecida ésta, realizó estudios histológicos del cerebro. En ese estudio describía en la paciente lo que él denominó “degeneración neurofibrilar”. El nombre “enfermedad de Alzheimer” fue acuñado posteriormente por Kraepelin, maestro de Alois, en su Manual de Psiquiatría escrito en 1910. La EA fue considerada durante muchas décadas una anomalía rara de escasa presencia en la población. Este concepto sobre la EA se mantuvo durante casi 70 años. Al cabo de ese tiempo se observó que la demencia que afectaba a la mayoría de personas de edad avanzada con declive cognitivo global era equivalente clínica y patológicamente a la descrita por Alois Alzheimer. Hoy en día la EA es la forma más común de demencia; concretamente, del 50% al 70% de los casos de aparición tardía de demencia se deben a esta enfermedad. Clínicamente se puede definir como una enfermedad neurodegenerativa progresiva, de aparición tardía, dependiente de la edad, caracterizada por un empeoramiento de las funciones cognitivas y por cambios en el comportamiento y la personalidad (Selkoe, 2001; Mattson, 2004; Reddy y McWeeney, 2005; Tanzi y Bertram, 2005). La alteración de la memoria es una característica necesaria para el diagnóstico de ésta o de cualquier otro tipo de demencia. También se deben presentar cambios en una de las siguientes
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Introducción
áreas: lenguaje, capacidad de toma de decisiones, juicio, atención y otras áreas de la función mental y la personalidad. Está causada por una degeneración progresiva y bastante específica de ciertas poblaciones neuronales del sistema nervioso central. Patológicamente se caracteriza por la presencia de un gran número de placas neuríticas y de ovillos neurofibrilares. Un hecho esperanzador es que es la enfermedad mejor conocida, con mayores avances de la clave patológica. Sin embargo, a pesar de estos avances no se conoce la razón fundamental para la degeneración de las neuronas y conexiones sinápticas que conducen a la demencia. La prevalencia de la enfermedad es difícil de determinar de forma definitiva porque la medida depende de varios factores, pero aproximadamente es del 1% en las personas entre 65 y 69 años y del 40-50% entre personas de 95 años o más (Hy y Keller, 2000). Sin embargo, también puede afectar a gente más joven.
4.1. Tipos de EA: familiar y esporádica. Clásicamente se distinguen dos tipos de EA según la edad de inicio. Cuando la enfermedad aparece antes de los 65 años de edad se denomina EA de inicio temprano o precoz (“presenil”), mientras que la forma de EA de inicio tardío (“senil”) se da en pacientes mayores de 65 años (Fig. 3). En la forma de inicio precoz se produce un deterioro cognitivo acelerado en comparación con la de inicio más tardío. Existen casos de EA presenil que presentan herencia autosómica dominante. A esta forma de EA se le denomina EA familiar (EAF). Se han identificado tres genes con una prevalencia cercana al 100% cuyas mutaciones causan la EAF. Estos genes codifican para la proteína precursora amiloide (PPA), la presenilina 1 (PSEN 1) y la presenilina 2 (PSEN 2). La PPA es una proteína integral de membrana cuya función no
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Introducción
se conoce muy bien. Las presenilinas son las unidades catalíticas del complejo enzimático γ-secretasa, el cual cataliza la proteolisis de la PPA para generar el llamado péptido β-amiloide (Aβ). De todas formas este tipo de EAF sólo representa el 5% del total de los casos de EA (Shastry y Giblin, 1999). La mayoría de los casos de EA son no familiares de inicio tardío que se presentan de forma esporádica. Este tipo de EA esporádica (EAE) muestra una etiología compleja debida a factores ambientales y genéticos que individualmente serían insuficientes para desarrollar la enfermedad. El gen de la apolipoproteína E (APOE) se ha identificado como el mayor factor de riesgo para estas formas complejas de EA, aunque sólo el 50% de los casos no familiares de EA son portadores del alelo ε4, la variante genética que predispone a padecer la EA (Fig. 3).
PSEN 25-60 años EAF
PPA 40-65 años
Presenil (<65 años)
PSEN 45-84 años EA No Familiar
EA
EAF senil Alelo ε4 APOE
Senil (>65 años) EA esporádica
Factores no identificativos
Fig. 3. Tipos de EA. La EA se clasifica en senil o presenil según la edad de inicio. Los genes descritos han permitido la caracterización de la EA familiar (EAF). PSEN, presenilina; PPA, proteína precursora amiloide; APOE, apolipoproteína E. Esquema adaptado a partir del de St George-Hyslop 2000.
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Introducción
No existen rasgos clínicos o patológicos que distingan la EAF de la EAE, exceptuando la edad de inicio. Esta falta de rasgos distintivos indica que la influencia de diferentes factores ocasiona un proceso patogénico similar.
4.2. Placas seniles y ovillos neurofibrilares. Las dos características patológicas fundamentales del cerebro de un paciente con EA son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. Estas dos agregaciones proteicas permiten un diagnóstico definitivo de la EA en la autopsia. El papel de las placas y de los ovillos en la etiología de la EA no está totalmente aclarado, pero juntos constituyen los marcadores clásicos de la enfermedad. Las placas y los ovillos se hallan predominantemente en los lóbulos temporal y frontal, incluyendo el hipocampo. En casos muy avanzados de EA estas modificaciones se extienden a otras regiones de la corteza, incluyéndose entonces los lóbulos parietal y occipital. La patofisiología de la enfermedad es compleja, sobretodo en su forma esporádica, y muy probablemente implica diferentes vías de daño neuronal que se solapan. La prueba de que este hecho puede ser así es que además de las placas y ovillos, el cerebro de un paciente con EA muestra en mayor o menor medida otra serie de alteraciones: pérdida sináptica, gliosis, activación de microglía, señales de inflamación y daño oxidativo (Masliah, 2000). La neurodegeneración y la pérdida sináptica características de la EA se observan principalmente en las regiones que contienen gran cantidad de placas y ovillos (Ray y col., 1998).
32
Introducción
4.2.1 Las placas seniles. Las placas seniles son depósitos extracelulares insolubles formados por la agregación del péptido A β. Las placas seniles pueden ser difusas o clásicas; las difusas son agregados amorfos de péptido A β que no se encuentran asociados con neuronas distróficas o neuritas anormales. Las placas neuríticas clásicas contienen densos agregados fibrilares de péptido A β y generalmente están asociadas a degeneración y pérdida de células neuronales. También se ha indicado que estos dos tipos de placas reflejan el estadio de la enfermedad: las placas difusas se encuentran en estados iniciales de la enfermedad y las clásicas son placas “maduras”, consecuencia del avance de la enfermedad (Behl, 1999). El péptido Aβ es una combinación heterogénea de péptidos que van de 39 a 43 aminoácidos de tamaño, siendo los de 42 y 43 aminoácidos las especies primarias del péptido amiloide depositado en las placas seniles. El péptido Aβ deriva del procesamiento de la PPA llevado a cabo por una serie de proteasas, las secretasas β y γ (Hutton y col., 1998). En condiciones normales una proteasa llamada α secretasa, corta la PPA de manera que libera un fragmento extracelular, soluble, de unos 695 aminoácidos. La parte que queda integrada en la membrana es procesada después mediante la acción de una segunda enzima, la γ secretasa, que libera la parte carboxilo terminal de la proteína, posiblemente dentro de vesículas lisosomales para su posterior degradación. Esta vía es conocida como la vía no amiloidogénica, porque la acción de la α
secretasa previene la formación del péptido A β, con lo que impide la formación de
depósitos. Sin embargo, una parte de la PPA es procesada de manera diferente. Otra secretasa, la β secretasa, corta la PPA liberando un fragmento carboxilo terminal más largo, que tras ser procesado por la γ secretasa, libera el péptido A β. La clave en esta ruta de procesamiento es la posición en donde la γ secretasa corta, pues puede dar como 33
Introducción
resultado un péptido A β40 corto con poca capacidad para formar agregados, o un péptido Aβ42-43 largo bastante más insoluble que el otro. Por ello la γ secretasa parece ser la responsable directa del origen del péptido A β de 42-43 aminoácidos que tiene gran importancia patogénica, puesto que puede formar agregados fibrilares tóxicos insolubles cuya acumulación da lugar a las placas seniles (ver imagen de la representación
esquemática
del
procesamiento
de
la
APP
en
http://svneurologia.org/fc/app.htm). La agregación del péptido A β es considerada por muchos autores la principal causa de la EA. El papel del péptido A β parece ser fundamental en la EA y es objeto de las principales hipótesis que explicarían su desarrollo. Al menos en la EAF su contribución parece decisiva, ya que los genes descritos se encuentran implicados en los mecanismos de producción del péptido A β. Sin embargo, el mecanismo por el cual el péptido A β causaría la neurodegeneración está en discusión. En la figura 4 se muestra la hipótesis de la cascada amiloide que explicaría el proceso de neurodegeneración a partir de la acumulación del péptido A β. Por otro lado la controversia sobre si las placas y los ovillos son causa o efecto ha propiciado diversas teorías, como la que propone que la acumulación de péptido A β en la EAE sería una respuesta protectora al daño oxidativo originado por una disfunción mitocondrial (Smith y col., 2002).
4.2.2. Los ovillos neurofibrilares. Son depósitos intracelulares compuestos principalmente por la proteína asociada a microtúbulos tau (Strittmatter y col., 1996). Los ovillos se forman debido a la hiperfosforilación de tau mediante mecanismos que provocan la disociación de tau de los microtúbulos y la formación espontánea de depósitos de filamentos insolubles. Se
34
Introducción
han podido inducir marcadores antigénicos de hiperfosforilación de tau y depósitos limitados de tau en neuronas in vitro mediante tres vías diferentes: aumento de la concentración intracelular de calcio, reducción de la energía disponible y aumento de la concentración de glutamato. Para los autores esto indica que los ovillos aparecen secundariamente al estrés neuronal (Mattson, 1994).
4.3. Hipótesis de la cascada amiloide. Muchos procesos celulares se rompen en la EA. Estos procesos son iniciados por diferentes eventos. Cualquier hipótesis que explique la EA tiene que incorporar la idea de múltiples lesiones primarias para llegar a un único modo de patogénesis. Por ello se propuso la hipótesis de la cascada amiloide en 1991 por John Hardy y David Allsop. Esta hipótesis explicaría el proceso de neurodegeneración a partir de la acumulación del péptido A β. Por ello esta hipótesis sugería que las mutaciones en los genes PPA, PSEN1 o PSEN2 producirían el metabolismo erróneo de la APP, el cual era el evento inicial para la patogénesis de la EA, que provocaría el aumento y la acumulación del péptido A β; esto a su vez provocaría la oligomerización del péptido A β con efectos sutiles de los depósitos en la sinapsis, lo que a su vez produciría la activación microglial y astrocítica que iría causando lesiones sinápticas y neuríticas progresivas; éstas causarían una homeostasis iónica neuronal alterada y daño oxidativo, con actividades kinasa/fosfatasa alteradas (formación de ovillos), produciéndose una amplia disfunción neuronal/neurítica y la muerte celular que finalmente desencadenaría la demencia característica de la EA (Hardy y Allsop, 1991).
35
Introducción
Mutaciones en los genes PPA, PSEN1 o PSEN2 Aumento en la producción y acumulación péptido A β42 Oligomerización del péptido Aβ42 y deposición en placas difusas Efectos sutiles de los depósitos en las sinapsis Activación microglial y astrocítica (factores del complemento, citoquinas, etc) Lesiones sinápticas y neuríticas progresivas Homeostasis iónica neuronal alterada; daño oxidativo Ovillos
Actividades kinasa/fosfatasa alteradas
Amplia disfunción neuronal/ neurítica y muerte celular
Demencia-EA
Fig. 4. Hipótesis de la casacada amiloide.
Desde que el péptido A β fuera identificado por primera vez en 1984 como el principal componente de las placas amiloides (Glenner y Wong, 1984), las evidencias acumuladas sugieren que este péptido es de hecho el daño primario neuropatológico en la EA. Un punto importante en esta hipótesis es la observación de que la mayoría de las mutaciones implicadas en la EA familiar incrementan la cantidad de A β42 fibrilogénico. Además, los modelos de ratones transgénicos que expresan mutaciones patogénicas de APP (Hsiao y col., 1996) y de PSEN1 incrementan los niveles de A β y de placas amiloides. Además, los individuos con la trisomía 21 (Síndrome de Down) tienen 3 copias de APP y normalmente desarrollan una EA avanzada en la cuarta década de su vida. 36
Introducción
4.4. Inflamación y enfermedades neurodegenerativas. Los procesos patológicos de la neurodegeneración observados tanto en la EA como en la EP van acompañados por una reacción inflamatoria que parece contribuir a su patogénesis (Akiyama y col., 2000). Existen claras evidencias de la implicación de las reacciones inflamatorias en la degeneración del sistema negro-estriado que lleva a la EP (Castaño y col., 1998; Herrera y col., 2000; Castaño y col., 2002). Esta reacción inflamatoria está precedida por una fuerte activación microglial en la SN sugiriendo la posible relación entre ambos procesos. De igual manera existen evidencias de la existencia de una reacción inflamatoria crónica y especialmente intensa en los cerebros de pacientes con Alzheimer (McGeer y McGeer, 2004) que cursa con toda la complejidad de una respuesta inflamatoria periférica. En los cerebros de enfermos de Alzheimer las neuronas y neuritas dañadas, los grandes depósitos de péptidos A β altamente insolubles y los ovillos neurofibrilares proporcionan un estímulo obvio para la inflamación. Como estos estímulos son discretos y están microlocalizados y presentes desde fases preclínicas tempranas hasta estadios terminales de la EA, la estimulación local del complemento, de citoquinas, de proteínas de fase aguda y de otros mediadores inflamatorios es también discreto y crónico y está microlocalizado. En la EA se ha observado gliosis, que se manifiesta por una gran activación de astrocitos y microglía que se encuentran en abundancia cerca de las neuronas y de las placas. Esta característica ya se vio en 1911 cuando se describió la EA por primera vez. Esto sugiere que la inflamación podría estar implicada en la EA, puesto que las células gliales median la respuesta de inmunidad innata en el sistema nervioso central. Cuando se produce la activación, los astrocitos y la microglía liberan
37
Introducción
varias moléculas de señalización proinflamatoria, incluyendo citoquinas S100 β, que se produce por los astrocitos, e interleukina 1 (IL-1) que es principalmente producida por la microglía activada. Trabajos recientes sugieren que la activación de la microglía en respuesta al daño, a la enfermedad, a la edad o a otras causas inicia una cascada de eventos que puede caracterizarse como un proceso inflamatorio. Esta cascada es mediada inicialmente por la citoquina proinflamatoria interleukina 1, que se sobreexpresa en la microglía activada. A través de varias rutas la interleukina 1 causa la muerte neuronal, la cual activa más microglía, que a su vez libera más interleukina 1 en un proceso automantenido y autoamplificado. Se cree que la acumulación durante muchos años de daños directos y de los mecanismos inflamatorios en los cerebros con EA exacerban significativamente los procesos patogénicos que dieron origen a dicha enfermedad, destrozándose suficientes neuronas para causar las señales clínicas de la EA. Por lo tanto, los modelos animales y los estudios clínicos, aunque todavía en estadios iniciales, sugieren que la inflamación en la EA contribuye a la patogénesis de dicha enfermedad. Con este descubrimiento han surgido nuevos retos y nos hemos formulado nuevas preguntas, de las que sólo estamos comenzando a encontrar la respuesta. ¿Son los mecanismos inflamatorios los causantes del daño en la EA o sólo están presentes para retirar los detritos y no como un proceso patológico primario? ¿Se podrían considerar los antiinflamatorios una opción terapéutica viable para la EA? Existen evidencias directas e indirectas del papel de la neurodegeneración en los procesos inflamatorios producidos en la EA proporcionadas por estudios e investigaciones clínicas; aunque todavía inconclusos, en ellos se sugiere que los fármacos antiinflamatorios convencionales no esteroideos (AINEs) podrían retrasar la aparición y enlentecer la progresión de la EA. Una mejor comprensión de los procesos 38
Introducción
inflamatorios e inmunoreguladores de la EA es necesaria para el desarrollo de acercamientos antiinflamatorios que, aunque no curasen la EA, probablemente ayudarían a retrasar su progresión o retrasar la aparición de esta devastadora enfermedad.
4.5. Asociación entre S100 , interleukina 1 y la EA.
4.5.1. Efecto del S100β. Bajo circunstancias normales, S100 β promueve el crecimiento de las neuritas, estimula la proliferación de los astrocitos e incrementa las concentraciones de calcio libre tanto en neuronas como en astrocitos. Sin embargo, la sobreexpresión de S100 β podría tener consecuencias deletéreas, incluyendo un excesivo crecimiento de las neuritas distróficas que caracterizan las placas neuríticas β-amiloides cuya presencia ayudan al diagnóstico de la EA. Marshak y col, en 1992 informaron que S100 β se sobreexpresa en los cerebros de los pacientes con EA, especialmente en el lóbulo temporal, donde las placas neuríticas están concentradas. Se ha visto que la expresión de S100 β muestra una elevada correlación con el número de neuritas distróficas encontradas en las placas en diferentes estadios de evolución. Finalmente, diversos estudios han concluido que la activación de los astrocitos y la expresión de S100 β están implicadas en la inducción y el mantenimiento de las neuritas distróficas en los depósitos amiloides.
39
Introducción
4.5.2. Efecto de la IL-1. La IL-1 es una citoquina proinflamatoria muy bien caracterizada que está implicada en diversos procesos de enfermedades crónicas neurodegenerativas, incluyendo el desarrollo de arteriosclerosis y artritis reumatoide. En la EA está asociada tanto con las placas β-amiloides como con la formación de neuritas distróficas. Según algunos experimentos, la IL-1 contribuye a la rápida sobreexpresión de Aβ después de un traumatismo craneoencefálico. Además sabemos que en la EA, las placas con neuritas y neuronas que contienen tau se encuentran en las mismas áreas del cerebro en donde también se encuentra microglía expresando IL-1. Curiosamente, la presencia de astrocitos activados que expresan S100 β también se correlaciona con la microglía activada que expresa IL-1. Mientras las placas se desarrollan, el número de microglía activada que expresa IL-1 asociada a cada placa también cambia y sigue un patrón similar al seguido por los astrocitos que expresan S100 β. Estos resultados forman una evidencia poderosa aunque circunstancial del desarrollo y la progresión de la EA. Sin embargo, para demostrar que es la fuerza impulsora en la EA y no simplemente una consecuencia del desajuste neuronal se debería demostrar que la inflamación precede al desarrollo de las placas. Las evidencias señalan hacia un papel central de la inflamación en la EA, mediada por citoquinas proinflamatorias, de manera que se crea una interacción crónica automantenida entre microglía activada y astrocitos, neuronas estresadas y placas βamiloides. Un factor de iniciación clave parece ser la sobreexpresión de IL-1, que podría ser el resultado de varios eventos, incluyendo enfermedad, traumatismos, polimorfismos genéticos o simplemente el desgaste generado con la edad.
40
Introducción
Una vez que la IL-1 está presente en exceso, comienza la cascada de eventos que incluyen varios ciclos de retroalimentación, resultando finalmente en un ciclo de autosustentación que lleva hasta una progresiva muerte neuronal. La IL-1 activa los astrocitos, por lo que produce un incremento de la expresión de S100 β. La sobreexpresión de S100 β causa crecimiento de neuritas distróficas, que estimula a las neuronas a producir APP (que estimula la expresión de S100 β). Esto incrementa las concentraciones de calcio intracelular, lo cual conlleva al daño celular. Por otro lado la sobreexpresión de S100 β también induce la expresión de IL-6 y promueve la expresión de IL-1. Por su parte la IL-1 estimula directamente la síntesis neuronal de APP, lo que lleva a la producción de β-amiloide que a su vez activa directamente a la microglía e incrementa la expresión de IL-1. Finalmente, la IL-1 promueve directamente la proliferación microglial e incrementa la expresión de IL-1 e IL-6. Todos estos procesos actúan para incrementar el estrés en las neuronas (estimulándolas a producir todavía más PPA), lo que termina por retroalimentar el ciclo. Esta es la deletérea y poderosa interacción entre las citoquinas, neuronas y glía que se ha denominado “ciclo de la citoquina”. Sin embargo, la gran cantidad de funciones de la IL-1 no se detiene aquí. Un elemento central en la EA es la disfunción colinérgica, que se ha atribuido al incremento, inducido por estrés, de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa (AChE). Estos incrementos son de hecho la diana para la única terapia establecida posible para la EA, los bloqueantes de la AChE. Diversos estudios han mostrado que la AChE se sobreexpresa en las neuritas de las placas en la EA y regula el procesamiento de APP, lo que sugiere una relación entre la AChE y la formación de las placas. Existen estudios in
41
Introducción
vitro
e in vivo que demuestran que la IL-1 esta implicada en la raíz de la disfunción
colinérgica en la EA. La IL-1 también está implicada en la hiperfosforilación de tau, principal componente de los ovillos neurofibrilares que son tan característicos de la EA. Todo esto nos trae de vuelta al ciclo de la citoquina: la disfunción neuronal y la muerte dan como resultado la pérdida cognitiva y la demencia, elementos característicos de la EA, y también perpetúa el ciclo mediante la estimulación de la sobreexpresión de IL-1 por la microglía activada. Esto coloca de nuevo a la IL-1 como centro de la patogénesis de la EA. Pero la IL-1 no solamente causa daño neuronal, sino que de forma directa e indirecta potencia su automantenimiento y se llega a un círculo vicioso. Estimula directamente su propia producción; el β-amiloide, producido desde el APP, estimula también su producción; S100 β estimula su producción; y finalmente, la muerte de las neuronas dirigen al incremento de la activación microglial y todavía producen más expresión de IL-1.
4.6. El tratamiento farmacológico de la EA. Hoy por hoy no existe ningún tratamiento que pueda curar la EA. La enfermedad progresa de forma más o menos rápida, hacia un deterioro severo que precisa de ayuda para todas las actividades básicas. Sin embargo, en algunas personas en las fases tempranas y medias de la enfermedad, algunos medicamentos pueden prevenir el empeoramiento
de
algunos
síntomas
durante
un
tiempo
limitado.
El
uso de fármacos para tratar los síntomas o para evitar el progreso de la EA se inició en la década de los 90 con la comercialización de los inhibidores de la enzima
42
Introducción
colinesterasa. Estos medicamentos aumentan la concentración de acetilcolina (Ach) en el cerebro. Los cuatro fármacos comerciales más usados actualmente (tacrina, donepezilo, galantamina y rivastigmina) se basan en este principio. El inconveniente de estos tratamientos es que su administración no puede proporcionar la solución definitiva al problema (Palmer, 2002) y, además, tienen efectos secundarios importantes. Estos compuestos representan tratamientos sintomáticos que han demostrado que contribuyen a mejorar la función cognitiva, el estado general y la realización de actividades de la vida diaria. El cese en su administración provoca el empeoramiento clínico. No existen datos clínicos convincentes que indiquen que estos fármacos son capaces de modificar el desarrollo de la enfermedad. También se han usado como tratamiento específico la memantina, la selegilina y la vitamina E (antioxidante): •
La memantina actúa evitando la muerte neuronal. Se trata de un antagonista no
competitivo de los receptores NMDA, y actúa uniéndose en ellos al mismo lugar que fisiológicamente lo hace el magnesio, pero con mayor afinidad. Esto bloquea la entrada masiva de calcio que se produce en las células nerviosas cuando existe una excesiva actividad del glutamato que provoca el desplazamiento del magnesio. La indicación aprobada actualmente de manera oficial es en los casos moderados, graves y moderadamente graves, pero ya hay estudios en marcha para conseguir su aprobación para los casos leves. • La selegilina y la vitamina E
han demostrado eficacia en producir un cierto retraso
en la evolución de la enfermedad, retrasando asimismo la institucionalización de los pacientes. Ninguno de estos dos agentes ha demostrado producir mejoras en el plano cognitivo.
43
Introducción
Otras alternativas farmacológicas son las siguientes: •
Terapia de complementación: el cerebro de un paciente con EA presenta una
serie de deficiencias (hormonas, neurotransmisores, factores tróficos, etc.), las cuales suponen una diana para la complementación farmacológica. • Componentes anti-apoptóticos: uno de
los mecanismos que se encuentra activado
en la EA es la apoptosis. El conocimiento y comprensión de esta cascada bioquímica debería conducir a la determinación de sustancias capaces de bloquear la apoptosis. Las caspasas se encuentran en primera línea de investigación, en particular la caspasa-3, que siempre está presente en las placas seniles y en los ovillos. • Sustancias anti-amiloides: el concepto farmacológico para el tratamiento de la EA
consiste en disminuir la síntesis del péptido A β42, o promover su eliminación, papel que deberían llevar a cabo los macrófagos y células microgliales, o prevenir su depósito y agregación (Esiri, 2001). Otra aproximación es la dirigida a estimular respuestas inmunológicas contra antígenos específicos. Schenk (2006) observó que la aparición de los depósitos amiloides podía prevenirse mediante la vacunación con péptido sintético A β, de tal manera que el sistema inmunológico crea anticuerpos que eliminan las formas modificadas de esta proteína. Años antes se habían realizado pruebas con otra vacuna en humanos. Los resultados obtenidos fueron los esperados tras la fase de experimentación, es decir, se redujo el número de placas amiloideas en los pacientes. Pero tuvo que abandonarse la aplicación de esta vacuna debido a que en un grupo reducido de pacientes se presentaron casos de meningoencefalopatía e inflamación cerebral, con la consecuente muerte de algunos de estos pacientes. Parece ser que el fracaso de esta vacuna fue la utilización de una proteína natural que desencadenó una fuerte respuesta
44
Introducción
inmune. A pesar de mantenerse en continua investigación, la utilización de este tipo de vacunas parece esperanzadora para la lucha contra esta devastadora enfermedad. •
Inhibición de la agregación proteica : las proteínas que se agregan en las
enfermedades neurodegenerativas adoptan una estructura en hoja- β que las hace insolubles. Ciertas isoformas de Apo E pueden actuar estabilizando la disposición espacial en hoja- β del péptido Aβ. Actualmente existen pocos fármacos que impidan la formación de hojas- β. La molécula quinacrina, con efectos sobre la estructura tridimensional de ciertas proteínas, es objeto de evaluación en la EA. • Fármacos que reducen la cantidad de
lípidos: los vínculos entre el colesterol y la
EA se han estrechado gracias al descubrimiento del factor de riesgo Apo E4. Está demostrado que las estatinas, compuestos que disminuyen el colesterol, reducen el riesgo de desarrollar la EA a través de mecanismos que deben ser independientes del colesterol. • Sustancias con impacto en la mitocondria : resolver la disfunción mitocondrial es
también un objetivo para el desarrollo de futuros medicamentos para tratar la EA. Existen algunos medicamentos que de una forma más o menos directa normalizan o restauran la función mitocondrial. Estos compuestos no tóxicos se prescriben frecuentemente en pacientes de edad avanzada y promueven el metabolismo energético a través de vías intermedias que favorecen la disponibilidad de oxígeno y glucosa en la mitocondria. •
Tratamiento de los síntomas psicológicos y conductuales : existen tratamientos
que ayudan a controlar los síntomas psicológicos y conductuales que aparecen con esta enfermedad, mejorando la calidad de vida de los pacientes y su relación con el medio.
45
Introducción
La depresión aparece con frecuencia en las fases iniciales de la enfermedad y puede responder a tratamiento antidepresivo. También deben controlarse otros síntomas como el insomnio, la agitación o las alucinaciones, con lo que se usan neurolépticos o benzodiacepinas.
Terapias antiinflamatorias para la EA : la existencia de una reacción inflamatoria crónica y especialmente intensa en los cerebros de pacientes con Alzheimer, dió pie a pensar que el tratamiento de la inflamación con agentes antiinflamatorios podría tener algún efecto beneficioso sobre esta enfermedad. Los agentes antiinflamatorios pueden ser de dos tipos: esteroideos y no esteroideos (conocidos como AINES). - Agentes antiinflamatorios esteroideos: en el caso de los agentes antiinflamatorios esteroideos (glucocorticoides, como la prednisona), aunque tienen propiedades que podrían ser útiles para el tratamiento de la inflamación de la EA (son antiinflamatorios muy potentes), también tienen propiedades que podrían hacerles menos adecuados para la administración a pacientes con EA (como por ejemplo, efectos proinflamatorios, como se verá más adelante, y graves efectos secundarios cuando se utilizan durante períodos de tiempo largos). Globalmente, la exposición crónica a glucocorticoides (GCs) durante un estrés prolongado produce efectos adversos, tales como inmunosupresión, infertilidad y neurodegeneración. La situación podría ser peor en pacientes con EA, por las interacciones específicas de los esteroides con alteraciones bioquímicas, sistémicas y de comportamiento ya existentes. Otros estudios han mostrado que los GCs hacen a las neuronas más vulnerables a una variedad de agentes neurotóxicos, entre los que se incluyen el glutamato y el
46
Introducción
kainato (Sapolsky, 2000; Lu y col, 2003) y, más importante aún, al péptido A β (Behl y col., 1997b). También se han observados otras relaciones negativas entre la EA y los GCs. Recientemente se ha mostrado que el estrés y los GCs promueven la deposición amiloide y la acumulación de tau en modelos de EA en ratones transgénicos (Green y col. 2006; Jeong y col., 2006). Más recientemente, Sotiropoulos y col. han observado que el tratamiento con GCs llevaba a un mal procesamiento de la APP y a una menor degradación y acumulación de tau (Sotiropoulos y col., 2008). Por todo esto, al no tener efectos beneficiosos para tratamientos a largo plazo, los GCs no son del todo aconsejables para tratar la EA (Sorrells y Sapolsky, 2006). - AINES: como alternativa a los agentes antiinflamatorios esteroideos se está probando el uso de los AINES. Evidencias epidemiológicas sugieren que los AINES deben proteger contra la EA. Sin embargo, los estudios terapéuticos con ellos no han confirmado tal evidencia epidemiológica. La aparente incongruencia puede ser debida al hecho de que la evidencia epidemiológica está basada en estudios anteriores a la aparición de las manifestaciones clínicas de la EA, mientras que los estudios terapéuticos se han llevado a cabo en personas que sobrepasan el umbral de detección clínica. Por esto, es concebible que las estrategias terapéuticas administradas durante la demencia temprana o moderada no puedan ser efectivas de una forma óptima. La acción primaria de los AINES es la inhibición de las enzimas ciclooxigenasas (COX). Estas enzimas se presentan en forma inducible (COX-2), que está elevada en los cerebros de pacientes con EA, y en una forma constitutiva (COX-1). Ambas están implicadas en numerosas actividades inflamatorias además de en funciones neuronales. In vitro se
ha demostrado que los inhibidores no selectivos de COX pueden disminuir 47
Introducción
preferentemente los niveles del péptido Aβ42. Estudios recientes con AINES no selectivos en modelos de EA en ratones indicaron que la frecuencia de los depósitos de este péptido en el cerebro de estos animales puede ser significativamente reducida por el tratamiento con el ibuprofeno (inhibidor no selectivo de la COX). Sin embargo, la aspirina o el naproxeno, que pertenecen a la misma familia, no poseen este efecto protector. Estos estudios y los datos epidemiológicos apoyan una terapia potencial para los AINES en el tratamiento de la EA. Sin embargo, dado el gran número de candidatos antiinflamatorios, sus actividades ampliamente divergentes y los importantes efectos secundarios, es esencial optimizar la selección de la droga y el modelo de estudio. Un mejor entendimiento de la influencia de la actividad antiinflamatoria en la EA y la identificación de los mecanismos específicos que juegan un papel temprano en la progresión de la enfermedad, mejorará mucho la probabilidad de éxito en los esfuerzos por encontrar una estrategia de tratamiento antiinflamatoria efectiva (Pasinetti, 2002). Por todo ello, el uso de los AINES para tratar la EA se encuentra todavía en continua investigación.
5.
MODELOS
DE
NEURODEGENERACIÓN.
El
LIPOPOLISACÁRIDO.
Existen diversos modelos que permiten mimetizar las características neuroquímicas e histológicas que acompañan a los procesos inflamatorios cerebrales. Entre ellos se encuentra el lipopolisacárido (LPS) o endotoxina que representa el
48
Introducción
principal componente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y juega un papel clave en el desarrollo de infecciones y sepsis (Rietschel y Brade, 1992; Schletter y col., 1995). El LPS fue descubierto aproximadamente hace unos 100 años por Richard Pfeiffer y al contrario que la exotoxina segregada por la bacteria del cólera, es estable al calor (Ulmer y col., 2002).
5.1. Estructura del LPS. Aunque existe una gran variación en la composición del LPS de diversas cepas bacterianas, todos ellos muestran una estructura común. Se trata de moléculas anfipáticas consistentes en una parte polisacárida e hidrofílica que va unida covalentemente a un componente lipídico e hidrofóbico, denominado lípido A (ver imagen
de
la
estructura
química
y
variabilidad
del
LPS
en
http://pathmicro.med.sc.edu/fox/lps.jpg). El heteropolisacárido comprende dos regiones: la cadena O-específica también llamada Antígeno O, formada por unidades repetitivas de oligosacárido; y la región central o core. Éste a su vez se subdivide en core externo (formado por hexosas), mediante el cual se une al antígeno O; y el core interno (formado por heptosas). El lípido A se compone en general de un disacárido fosforilado, unido a dos Dglucosaminas en posición β1, 6 y que porta un máximo de seis o siete residuos acilo. Se une al core interno mediante un residuo llamado KDO (ácido 2-keto-3-deoxioctanoico). Existen variaciones en la longitud, posición y número de ácidos grasos que componen el lípido A. Éste constituye el principio endotóxico del LPS, mientras que los efectos biológicos son reproducidos por la parte del lípido A libre.
49
Introducción
5.2. Interacción entre el LPS y proteínas solubles de membrana. Un requisito previo para la activación de las células por el LPS es su interacción con moléculas específicas de unión al LPS en la superficie de sus células diana. Se han descrito varias estructuras de unión al LPS, pero sólo se ha demostrado una relevancia fisiológica para algunas de ellas (Bermejo y Duarte, 2003). La proteína de la superficie celular más destacada relacionada con la unión al LPS y a su activación celular es la glicoproteína de 55kDa CD14 (Tanaka y col., 2000). Ésta existe como una proteína de membrana (CD14m) anclada a un glicosilfosfatidilinositol
(GPI)
en
las
células
monocíticas,
en
leucocitos
polimorfonucleares, en algunos linfocitos B (Gu y col., 1998) y en células epiteliales. La unión del LPS al CD14m en los monocitos es necesaria para la estimulación de estas células, lo cual lleva a la producción y liberación de mediadores inmunes. La unión del LPS al receptor CD14 está fuertemente incrementada por una glicoproteína sérica de 60kDa denominada proteína de unión al LPS (LPS-binding protein o LBP) (Staal y Sonsalla, 2000). Durante la respuesta de fase aguda, la concentración de LBP se incrementa desde 5-10 µg/ml hasta 200 µg/ml. El LBP reduce la concentración de LPS requerida para la activación de los monocitos formando complejos LBP-LPS, que son reconocidos por el CD14. Además del CD14m, existen distintos tipos de CD14 solubles (de 48, 53 y 55 kDa) presentes en concentraciones de alrededor de 2-6 µg/ml en el suero (Frey y col., 1992) que son liberados por monocitos o bien secretados por formas libres de GPI (Alam y col., 1997a, b; McNaught y Olanow, 2003). Se sabe que el LPS se une directamente a las formas solubles del CD14 (CD14s), un proceso altamente facilitado
50
Introducción
por el LBP, a pesar de que esta proteína no está presente en los complejos de LPSCD14s (Andrew y col., 1993). Los complejos LPS-CD14s permiten la activación sin CD14m de algunas células, como células endoteliales, fibroblastos y células del músculo liso que producirían citoquinas (Benveniste, 1992; Good y col., 1992; Wang y col., 2002). Así, se ha postulado la existencia de un receptor específico para los complejos de LPS-CD14s que se expresaría en estas células y que mediaría la activación por el LPS de las células sin CD14. En conclusión, el CD14 jugaría un papel extremadamente importante como receptor soluble de membrana en el reconocimiento molecular del LPS en varias células. Sin embargo, parece que la activación celular requiere moléculas de membrana adicionales.
5.3. Transducción de señal inducida por el LPS. En los últimos años se ha identificado en humanos y ratones una familia de proteínas denominadas receptores semejantes a Toll (Toll-like receptors o TLRs). Se trata de proteínas transmembrana con un dominio extracelular con repeticiones ricas en leucina (LRR) y un receptor citoplasmático Toll/IL-1 (TIR) con un dominio de gran semejanza estructural con el del receptor de IL-1 (O´Neill y Greene, 1998; Anderson, 2000). Existen evidencias que sugieren que estos TLRs son las moléculas de reconocimiento de patógenos más importantes y que se utilizan diferencialmente en el inicio de las cascadas de señalización en respuesta a infecciones con diferentes clases de patógenos. Una vez que el LPS estimula las células diana, ocurren una serie de eventos intracelulares. El más importante y mejor caracterizado es la activación del NF- κ B, que
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juega un papel central en la regulación de las respuestas inflamatorias e inmunes (Ghosh y col., 1998; May y Ghosh, 1998). El NF- κ B representa un grupo de proteínas relacionadas estructuralmente, incluidas la p65, p50, p52, RelB y c-Rel. En condiciones normales, el NF- κ B se encuentra secuestrado en el citosol como una forma inactivada homo o heterodimérica, con interacciones no covalentes con sus proteínas de inhibición, denominadas I κ Bs. Tras la estimulación con el agonista apropiado, el I κ B es fosforilado, ubiquitinizado y degradado. Así, el NF- κ B es liberado y se trasloca al núcleo iniciando la expresión génica. Dentro de los genes diana del NF- κ B se incluyen aquellos que codifican para citoquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión, proteínas de fase aguda, péptidos antimicrobianos, la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la COX-2. En conjunto, estos mediadores proporcionan protección inmediata al huésped e inducen el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa (Ghosh y col., 1998; May y Ghosh, 1998) . En los últimos años se ha producido una importante expansión de nuestro conocimiento sobre los mecanismos de señalización por los que el LPS induce la activación del NF κ B. De hecho, se han descubierto varios de los componentes moleculares implicados en este proceso (Bermejo y Duarte, 2003; Zhang y Ghosh, 2000). El TLR4 es un receptor primario transmembrana de señalización para el LPS. Una vez que el LPS se ha unido al CD14, el LPS debe transferirse al TLR4, resultando en la homodimerización del TLR4 y en un cambio conformacional en el dominio citoplasmático. Posteriormente, se recluta sobre el receptor una proteína adaptadora llamada MyD88, seguido de la interacción con la kinasa asociada al IL-1R (IRAK)-1, -2 o –M. La IRAK se disocia del complejo del receptor y recluta al factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que finalmente resulta en el ensamblaje y activación del complejo IKK α/β/γ y la subsecuente fosforilación y degradación del I κ B y la translocación al núcleo del NF κ B. 52
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El mecanismo por el cual el TRAF6 activa a las IKKs no se conoce bien actualmente, aunque hay evidencias que muestran que el TRAF6 podría interaccionar con moléculas adicionales que ayudarían a activar a proteínas kinasas en cascada, lo cual llevaría a la fosforilación y activación de las IKKs. Se han identificado tres proteínas TRAF6, denominadas intermediario evolutivo conservado de señales en la vía Toll (ECSIT), proteínas de unión a TAK-1 (kinasa activada por el factor de crecimiento transformante β-2, TAB2) y proteína de unión al TRAF6 (T6BP) (Zhang y Ghosh, 2000). Existen otras vías de transducción de señal del LPS. En diversos estudios in vitro con monocitos y fibroblastos se han implicado proteínas G y pequeñas proteínas G que pueden participar en la activación de tirosinkinasas (TK) (Tanke y col., 1991; Mayeux, 1997), la fosfolipasa C (PLC) y A 2 (PLA2) (Chang y col., 1990; Fleming y col., 1996), así como la calmodulina (Nakano y col., 1993; Mattsson y col., 1996). También se ha atribuido el papel de segundo mensajero a la esfingomielasa (SM), que hidrolizaría la esfingomielina en ceramida, la cual activaría diferentes proteínfosfatasas (PPT) y proteinkinasas (PK), como la PK activada por ceramida (CAK) (Joseph y col., 1994), que podría intervenir en la señal del LPS activando o inhibiendo diversas enzimas como la PKC, las fosfolipasas PLC y PLA 2, y la COX inducible (COX-2) (Hayakawa y col., 1996; Liu y col., 1999). Otra vía es la formada por las PK, en la cual están implicados varios grupos: las serin-treonin PK A (PKA) y C (Shapira y col., 1994; Kozak y col., 1997) y un gran conjunto de TK (Ruetten y Thiemermann, 1997). El conjunto de las TK activadas por mitógenos, MAP kinasas (MAPKs) también participa en gran medida en las señales intracelulares del LPS. Esta gran familia consta de PKs que fosforilan restos de serinatreonina y tirosina-treonina. Según diferentes estudios in vitro realizados en macrófagos, 53
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otros leucocitos, células endoteliales, células musculares lisas y otros tipos celulares (Arditi y col., 1995; Downey y Han, 1998; Baydoun y col., 1999), existen al menos cuatro subgrupos de MAPKs, de los cuales se ha descrito que tres están relacionados con las respuestas inducidas por el LPS. Uno de estos subgrupos está formado por las kinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) y otro, por las kinasas llamadas p38. Se sabe que ERK está implicado en la producción de óxido nítrico (NO), la expresión de iNOS y la secreción de TNF- α estimuladas por LPS. p38 induce la producción de TNF-α e IL-1β, además de la expresión de otras proteínas/ mediadores inflamatorios entre los que se incluyen iNOS, COX-2, IL-6 e IL-8. Las otras vías relacionadas con las MAPKs incluyen el conjunto de proteínas que forman la subfamilia de PK del factor de transcripción c-jun, llamadas JNK, cuya activación induce la expresión de proteasas y citoquinas específicas.
5.4. LPS como modelo de enfermedad de Parkinson y de sepsis. Como ya se ha mencionado anteriormente, el LPS es un componente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. Es eliminado de la circulación sistémica principalmente por las células de Kupffer, los macrófagos residentes del hígado. En el SNC es un eficaz activador inmune. La cinética de la reacción inflamatoria que sigue a la inyección intracerebral de LPS ya se describió en el SNC de ratones (Anderson y col., 1992) y rata (Bourdiol y col., 1991; Montero-Menei y col., 1994, 1996; Szczepanik y col., 1996). Estudios previos de nuestro grupo de investigación nos han hecho considerar que el LPS puede proporcionar un interesante modelo para estudiar los efectos específicos de la inflamación en los procesos degenerativos del sistema dopaminérgico, los cuales podrían jugar un papel importante en la aparición de la EP.
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De forma resumida, estos estudios demostraron que una única inyección de LPS produce una fuerte respuesta inflamatoria en la SN lo que lleva al daño de las neuronas dopaminérgicas sin afectar a otros tipos neuronales. Esta neurodegeneración se dispara en el cuerpo neuronal, lo que está de acuerdo con Patt y col. (1991) que sugieren que en la EP la lesión se inicia en la SN. El daño es permanente, al menos en el período de tiempo estudiado (1 año) y se acompaña por el daño en las terminales dopaminérgicas en el estriado. El modelo descrito permitiría determinar en qué medida está implicada la activación glial en la progresiva degeneración nigral característica de la EP y también en qué medida los factores derivados de la glía, como las citoquinas o la deprivación de factores neurotróficos, clásicamente asociados con una importante muerte neuronal in vivo, están implicados en la
degeneración dopaminérgica.
El LPS se ha utilizado también como un modelo animal de inflamación crónica y sepsis (Yang y Lee, 2008). Es un potente inductor de inflamación sistémica (Ulevitch y Tobias, 1995) y puede dañar múltiples órganos a dosis muy bajas. Activa a los fagocitos mononucleares circulantes y no circulantes que producen y liberan citoquinas como el TNF-α y la IL-1β, las cuales median el daño y la mortalidad observados durante la exposición al LPS. También induce varias reacciones patológicas locales y sistémicas, además de anormalidades en la coagulación de la sangre. Es especialmente utilizado en estudios del tronco respiratorio para ver la respuesta local de los pulmones al estímulo patogénico. Cuando se inhala causa fiebre, enfriamientos y broncoconstricción según la dosis. Estos síntomas se acompañan de una respuesta proinflamatoria en el esputo y el fluido broncoalveolar, con elevación de neutrófilos, macrófagos y ciertas citoquinas/quimioquinas (Kharitonov y Sjöbring, 2007). La administración de una dosis letal de LPS a las ratas resulta en una hipotensión severa y en un fallo multiorgánico. El
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daño en el hígado y el pulmón normalmente aparece dentro de las 8 horas y las ratas suelen morir por fallo respiratorio en 12-24 horas.
6. EL ESTRÉS Y SU HISTORIA.
Sin duda alguna, el concepto de estrés sería difícil de entender sin los conceptos desarrollados por los fisiólogos Claude Bernard y Walter Cannon. El primero introdujo el concepto de medio interno ( Millieu Interieur ) y el americano Walter Cannon introdujo el término homeostasis para definir el conjunto de mecanismos fisiológicos que permiten mantener la constancia del medio interno, gracias a la puesta en marcha de sistemas que de manera cooperativa contrarrestan los factores de origen interno o externo que tienden a modificarlo. Basándose en los conceptos previamente desarrollados por Bernard y Cannon, Hans Selye acuñó en los años 30 el término estrés para designar el conjunto de cambios observados en ratas cuando investigaban el efecto de distintos extractos de glándulas sobre la fisiología de estos animales. Entre estos cambios destacan la pérdida de peso corporal, la hipertrofia adrenal, la inhibición tímica y la ulceración gástrica. Al conjunto de todos estos procesos Selye lo denominó síndrome general de adaptación (Selye, 1946). Selye definió el término estrés como la respuesta no específica del organismo frente a cualquier demanda sobre él, destacando la activación cortico-adrenal como el aspecto fisiológico más relevante del estrés. Posteriormente introdujo las palabras stressor para
designar el estímulo que provocaba este síndrome y stress para definir la
respuesta al estímulo. Selye centró su concepto de estrés en la característica de las respuestas fisiológicas emitidas por los organismos.
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John W. Manson argumentó en contra del concepto de respuesta no específica de Selye, considerando que la aparente inespecificidad de la respuesta sería una consecuencia de la activación emocional provocada por estímulos estresantes físicos (Manson, 1974). Su argumento se basaba en el hecho de que la respuesta al estrés se reducía cuando se minimiza o elimina la componente psicológica asociada a la exposición al estímulo. Tras otros experimentos además sugirió que la aparente no especificidad de la respuesta neuroendocrina al estrés era debida a la reacción emocional causada por la exposición a todos los estímulos estresantes. Pueden exponerse dos argumentos en contra de esta idea (Martí y Armario, 1998): (a) la respuesta neuroendocrina al estrés se presenta también en animales y en humanos bajo anestesia general (Dallman y Jones, 1973; Lilly, 1994; Udelsman y col., 1986), condiciones bajo las cuales no hay activación emocional; (b) un incremento gradual de la intensidad del estímulo físico lleva al animal a adaptarse a la situación sin que éste represente una amenaza para él. Por lo tanto, el animal no “interpreta” la situación como peligrosa y no responde como si se encontrara frente a una situación estresante. Parece por tanto evidente que algunos estímulos específicos son capaces de activar los sistemas endocrinos asociados al estrés actuando en áreas del sistema nervioso central no involucradas en el control de emociones. Así como Manson planteó el estudio de la respuesta al estrés desde una perspectiva psicosomática, Weiss, años más tarde (1972), estudió los efectos psicológicos y fisiológicos de la capacidad de control sobre las situaciones estresantes (Weiss, 1972). Aplicando choque eléctrico a las ratas observó que muchos de los déficits comportamentales y de los cambios neuroquímicos asociados a esta situación estresante eran debidos a la falta de control sobre la situación y no al castigo físico per
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se.
Por lo tanto, la ausencia de control sobre la situación es el principal factor
desencadenante de muchos efectos negativos de la exposición al estrés. Richard Lazarus en los años 60 aportó una nueva visión sobre el problema del estrés. Planteó la existencia de diferencias individuales, en tanto que una misma situación podía afectar de manera diferente a personas distintas. Puesto que determinadas situaciones pueden ser estresantes para unos y no para otros, no es posible establecer una relación causal simple entre estímulo estresante y respuesta al estrés. Por tanto, Lazarus propuso la existencia de factores motivacionales y cognitivos que podrían diferir de un individuo a otro. Destacó la importancia de la evaluación cognitiva de la situación que, según su criterio, determinaría su valor emocional y las estrategias de afrontamiento que se pueden poner en marcha para hacer frente a la situación (Lazarus, 1993). El estudio de las técnicas de afrontamiento de las situaciones estresantes y sus variaciones entre individuos es especialmente relevante en el comportamiento humano y debe tenerse en cuenta para el estudio de las consecuencias fisiológicas o patológicas del estrés. Algunos factores psicológicos subyacen a la capacidad de control y la predictibilidad de la situación puede influir en la activación del eje hipotalámico pituitario-adrenal (HPA). La capacidad de control hace referencia al control que tendría el organismo sobre la aparición del estímulo aversivo, es decir a la capacidad de poner fin o disminuir su intensidad, duración o frecuencia (Weiss, 1972). Por lo tanto, es evidente que el estrés implica procesos cognitivos que pueden afectar a la magnitud y dirección de las respuestas fisiológicas características, incluyendo la del eje HPA. A pesar de que en las últimas décadas se han publicado innumerables artículos científicos sobre el estrés, la definición de estrés sigue siendo compleja, controvertida y algo ambigua, de manera que no se ha podido encontrar una definición universalmente 58
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aceptada. Pero como definición se podría aceptar la de Milan Vigas (1980): “El estrés es el estado creado en un organismo enfrentado a agentes real o simbólicamente nocivos para su integridad, estado que desencadenaría una serie de respuestas no específicas, desarrolladas en el curso de la filogenia y conservadas gracias a su valor adaptativo frente a estos agentes”.
6.1. Características de los estímulos estresantes. Podríamos agrupar los estímulos estresantes en tres categorías principales:
Estímulos sistémicos: estímulos de carácter interno o externo de naturaleza tanto física como química. Entre los de naturaleza física podemos mencionar las perturbaciones provenientes del medio ambiente (frío, calor, radiaciones) y también heridas, fracturas y quemaduras entre otras. Entre los de naturaleza química, las sustancias irritantes o dolorosas, así como los contaminantes del agua (metales pesados) que causan daños funcionales a los animales acuáticos.
Estímulos emocionales: son aquellos que no causan un daño real al organismo, pero son interpretados por el individuo como potencialmente peligrosos. En este tipo de situaciones es muy importante la valoración que cada individuo pueda hacer de la situación. Esta clase de estímulos estresantes está asociada a una componente emocional que generalmente presenta características negativas para el individuo (Lazarus, 1993). Podemos citar entre ellos el miedo, la ansiedad, la frustración o la exposición a un ambiente desconocido.
Estímulos mixtos: la característica fundamental de esta clase de estímulos estresantes es que poseen componentes tanto sistémicos como emocionales, dado que algunos estímulos físicos pueden causar dolor, miedo o ansiedad, adquiriendo así una
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cualidad emocional. Esta clase de estímulos son muy frecuentes; entre ellos podríamos mencionar el choque eléctrico, la natación forzada y la inmovilización en tabla. Los estímulos estresantes no sólo difieren cualitativamente; otro parámetro a determinar es la intensidad del estímulo, lo que nos puede permitir predecir su impacto medio en una población de individuos. Sólo algunas variables endocrinas son capaces de reflejar la intensidad de la situación estresante y por lo tanto pueden ser consideradas como marcadores de estrés: la hormona adrenocorticotropa (ACTH), la adrenalina, la prolactina y la glucosa. Un buen marcador de estrés debería permitir cuantificar objetivamente el grado de estrés experimentado por el individuo, y para ello el individuo debería responder a los estímulos estresantes de manera consistente, unidireccional y proporcionalmente a la intensidad del estímulo. En relación al eje simpático-médulo-adrenal (SMA), la adrenalina es mejor marcador de intensidad del estrés que la noradrenalina, lo que permite explicar que la hiperglucemia inducida por el estrés, que viene sobre todo regulada por la adrenalina, sea un buen marcador de estrés. De las hormonas del eje HPA, la ACTH es mejor marcador de estrés que la corticosterona. Los GCs pueden ser un buen índice de la intensidad del estrés cuando las situaciones son de una intensidad suave y moderada, pero no cuando las situaciones son más severas. Al menos en la rata, la capacidad de la corteza adrenal para sintetizar GCs se satura con niveles moderados de ACTH, de tal manera que una liberación superior de ACTH no se reflejaría en la liberación de GCs. Otra hormona adenohipofisaria capaz de reflejar la intensidad del estrés es la prolactina, que parece responder proporcionalmente a la intensidad de los estímulos estresantes tanto en ratas (Kant, 1983; Armario y Jolín, 1989) como en humanos. Sin embargo, la liberación de prolactina es sensible a estímulos emocionales y no a estímulos estresantes de tipo físico. 60
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La frecuencia y duración del estímulo son parámetros que hacen referencia al curso temporal de exposición a la situación estresante. Así, hablamos de estímulos agudos, presentados una sola vez, que pueden diferir en la duración de la exposición (segundos, minutos u horas), y estímulos crónicos, los cuales pueden ser intermitentes si se repiten diariamente durante un determinado número de días o crónicos continuos si el individuo está permanentemente expuesto al mismo (Martí y Armario, 1997).
6.2. Respuesta al estrés. Ante las situaciones estresantes el ser humano moviliza sus recursos fisiológicos con el fin de responder a estas situaciones, lo que se denomina como reacción o respuesta de estrés (Carlson, 1996). En estas situaciones de grave amenaza intervienen una serie de variables que pueden condicionar de algún modo la respuesta del individuo ante las mismas. Entre las variables implicadas se destacan los agentes de estrés o estresares (según el tipo, la gravedad o la repetición de los acontecimientos), los factores individuales (como la vulnerabilidad, la estabilidad emocional y los estilos de afrontamiento) y las variables ambientales. De la interacción de estos factores podemos encontrar diversas respuestas de estrés desde el punto de vista fisiológico, en las que intervienen la activación cerebral (procesamiento de la información), autonómica (sistema de respuesta rápida) y neuroendocrina (sistema de respuesta lenta o tardía). Todas estas respuestas retroalimentan constantemente al organismo para incrementar, mantener o disminuir la respuesta de estrés. Aunque son sistemas individuales, en la práctica sus funciones se solapan en algún momento.
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• Activación nerviosa central (procesamiento de la información):
inicialmente un
estímulo aversivo excita a un receptor conduciendo dicha información hacia el cerebro bajo la forma de impulsos nerviosos. La información sensorial se proyecta en los núcleos asociativos del tálamo quien cumple funciones como estación de relevo sensitivo. Los impulsos nerviosos hacen una escala a nivel talámico, estableciendo sinapsis antes de proseguir su recorrido hacia la corteza cerebral (Ganong, 1992). Luego pasan a la corteza cerebral que se encarga de modular la fidelidad del procesamiento sensorial e identificar si se trata de un estímulo amenazante o no. La activación es promovida por la acción de la formación reticular quien pone en marcha la excitación general (Humber, 1986). Entre otras cosas, la corteza cingulada cambia las prioridades de la atención y de la concentración. La corteza frontal genera el plan de prioridades para las capacidades de atención y memoria de trabajo (Medina y col., 2002). Si no es valorada como estresante, la respuesta del organismo implicaría la puesta en marcha de los mecanismos homeostáticos normales, específicos y apropiados para la situación particular. Si es considerada estresante, se activarían los mecanismos de emergencia que constituyen la respuesta de estrés (activación de los ejes SMA, activación autonómica, y HPA, activación neuroendocrina). La respuesta de emergencia puede iniciarse porque el estímulo sea cualitativamente estresante para todos los individuos de una especie en particular o porque rebase un cierto valor umbral de intensidad.
•Activación
autonómica: cuando la activación nervioso-central parece haber
alcanzado su punto máximo, tiene lugar la activación autonómica, la cual actúa por medio del sistema SMA, encargado de preparar al organismo para afrontar la situación,
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de manera que se mantenga el medio interno en estado uniforme (homeostasis) y de facilitar respuestas de lucha o huída, de distinto significado emocional (Valdés y de Flores, 1990; Carlson, 1996). Este sistema está compuesto por el sistema nervioso simpático (que cumple funciones activadoras o de alerta) y por la médula suprarrenal. Una vez que la formación reticular ha iniciado el proceso de activación general (habiéndose realizado ya los procesos cognitivos que fueron atribuidos o evaluados como peligrosos, a través de la corteza cerebral y el tálamo), se excita el hipotálamo (Humber, 1986). El hipotálamo se encarga de controlar las funciones del sistema nervioso autónomo y del sistema endocrino; organiza las conductas de supervivencia tales como pelear, alimentarse, huir y reproducirse (Carlson, 1996). Tras la llegada de la información al hipotálamo, esa respuesta primaria y veloz provocará la liberación, a partir del hipotálamo y por vía simpática, de las catecolaminas noradrenalina y adrenalina. La noradrenalina es segregada a nivel de la médula suprarrenal y de estructuras cerebrales como el hipotálamo, el sistema límbico, el hipocampo y la corteza cerebral. Se ha observado que las situaciones estresantes aumentan su liberación en algunas zonas del cerebro tales como el hipotálamo, la corteza frontal y el cerebro frontal basal lateral (Valdés y de Flores, 1990; Funk y Stewart, 1996), aunque, de acuerdo a Valdés y de Flores (1990), en principio el hipotálamo es la única estructura nervioso-central que utiliza noradrenalina, aunque es bien sabido que su producción se da en todo el cerebro. Tanto la estimulación de los nervios simpáticos como las situaciones de estrés físico, agudo o crónico, en estados de cólera (Ax, 1953), de agresividad, de interacción social difícil y en conductas de alto riesgo, aumentan su producción (Valdés y de Flores, 1990). La noradrenalina se ha usado como indicador de la capacidad adaptativa, de manera que
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sus concentraciones fluctúan según las apreciaciones que hace el organismo de la situación y de los recursos para afrontarla. La adrenalina es producida en su mayor parte por la médula adrenal. Se ha considerado el indicador bioquímico de la actividad emocional del sujeto. Se incrementa en el estrés y en los estados de ansiedad, impredecibilidad e incertidumbre (Ax, 1953). La disminución rápida de los niveles de adrenalina se ha relacionado con el bienestar físico y psicológico (Valdés y de Flores, 1990). Estas catecolaminas son las encargadas de poner el cuerpo en estado de alerta preparándolo para luchar o huir. Algunas de las consecuencias fisiológicas observables incluyen taquicardia, incremento de la presión arterial, sudoración y dilatación de las pupilas (Ursin y Olff, 1993).
•
Activación neuroendocrina: la respuesta neuroendocrina es relativamente lenta
puesto que se pone en marcha al cabo de segundos o minutos, dura entre quince minutos y una hora y además decrece con el tiempo cuando es repetida ante estímulos que promueven una activación estresante (Valdés y de Flores, 1990). Se le denomina “neuroendocrina” porque su activación depende del SNC y su función, entre otras, es excitar la totalidad del sistema nervioso incrementando la función de algunos órganos y la disposición a la percepción y a la reacción (Humber, 1986). La activación neuroendocrina se inicia cuando las neuronas en el núcleo paraventricular del hipotálamo segregan un péptido llamado factor liberador de corticotropina (CRH) que es la hormona que inicia la cadena de neurotransmisores. El CRH y otras hormonas relacionadas entran en el sistema circulatorio privado que une el hipotálamo con la pituitaria anterior y en apenas segundos, activan la pituitaria que se
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encarga de liberar ACTH (Carlson, 1996; Leng y Russel, 1998). Una vez liberada la ACTH se introduce en el flujo saguíneo y, a través del sistema circulatorio, estimula a la corteza suprarrenal para que libere GCs: cortisol, hidrocortisona y corticosterona. También se liberan mineralocorticoides, como la dexoxicorticosterona y la aldosterona, y hormonas sexuales como la progesterona. La liberación de GCs en situaciones de estrés persigue elevar el nivel de glucosa en la sangre, ayuda a que las grasas se conviertan en energía, aumenta el flujo sanguíneo, estimula las respuestas conductuales al tiempo que inhibe actividades vegetativas innecesarias en tales momentos como la digestión, crecimiento, reproducción y sistema inmunitario (Stratakis y Chrousos, 1995; Carlson, 1996), de tal forma que lo que se intenta es preparar al organismo para hacer frente a la situación de emergencia. Los efectos de los GCs ante la respuesta al estrés son importantes y necesarios; sin embargo, su activación a largo plazo puede generar efectos dañinos en la salud tales como aumento en la presión sanguínea, daño en el tejido muscular, diabetes esteroide, infertilidad, inhibición del crecimiento, de las respuestas inflamatorias e inmunológicas (Carlson, 1996) e incluso daños en estructuras cerebrales como el hipocampo (Sapolsky, 1986; McEwen, 1999). Por último, esta excitación vegetativa general y la simultánea tensión nerviosa (nivel de comportamiento motor) vuelven ahora al centro (el cerebro) iniciando la retroalimentación sobre el estado de los receptores internos del cuerpo. Esta retroalimentación puede tener como consecuencia un incremento adicional de la excitación general (estimulación del sistema simpático) y, a la inversa, una relajación (estimulación del sistema parasimpático), al disminuir la excitación o al influir correspondientemente sobre todo el proceso.
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6.3. El eje hipotalámico-pituitario-adrenal. Dada la importancia fisiopatológica y psicológica del eje HPA en la respuesta al estrés, son innumerables los estudios y aproximaciones experimentales que se han desarrollado para esclarecer por qué los GCs parecen ser esenciales para la supervivencia en muchas situaciones de estrés. El eje HPA consta principalmente de tres estructuras claves: hipotálamo, hipófisis y glándulas adrenales.
6.3.1. El hipotálamo. Dentro del hipotálamo, el núcleo implicado en este sistema es el NPV. Éste se encuentra en una posición rostral del hipotálamo, a lo largo del borde del tercer ventrículo, y puede dividirse en distintos subterritorios según su aspecto citoarquitectónico, citoquímico y de conexiones con otras zonas (Swanson y Sawchenko, 1983). Funcionalmente pueden diferenciarse dos grandes divisiones: la magnocelular y la parvicelular. La división magnocelular posee grandes neuronas neurosecretoras que sintetizan principalmente los neuropéptidos arginina-vasopresina (AVP) y oxitocina (Antoni, 1993). Estas neuronas proyectan sus axones al lóbulo posterior de la hipófisis desde donde liberan sus productos de secreción en la circulación periférica. La división parvicelular puede subdividirse en cinco subregiones bien delimitadas. Las neuronas parvicelulares (zona hipofisiotrófica) sintetizan CRH y sus axones alcanzan la lámina externa de la eminencia media, donde liberan CRH que entra en el sistema portal-hipofisario y se distribuye por la hipófisis anterior, actuando sobre las células corticotropas.
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Se han descrito dos clases de receptores para el CRH que difieren entre si por su distribución anatómica y perfil farmacológico: el receptor tipo I (CRH-R1) de 415 aa y el tipo 2 (CRH-R2), que presenta dos isoformas de 431 aa. El CRH además de interactuar con sus receptores, puede unirse con alta afinidad a una proteína de unión al CRH, la cual inhibe de esta manera la actividad biológica del CRH (Lowry y col., 1996). Este neuropéptido no tiene como único papel la estimulación y liberación de ACTH, sino que también juega un papel importante en la integración de una gran parte de las respuestas fisiológicas y conductuales al estrés.
6.3.2. La hipófisis. La hipófisis, también llamada glándula pituitaria, es una glándula pequeña que se ubica en la silla turca en la base del cerebro y se conecta con el hipotálamo mediante el tallo pituitario. Fisiológicamente puede dividirse en la hipófisis anterior, también conocida como adenohipófisis, y la hipófisis posterior, llamada también neurohipófisis. Entre ellas existe una zona pequeña avascular, denominada pars intermedia, que está prácticamente ausente en el ser humano mientras que es de tamaño mayor y mucho más funcional en algunos animales inferiores. Las células que producen y sintetizan la ACTH en la adenohipófisis y en la pars intermedia son denominadas corticocotropas y representan del 7 al 10% del total de las células (Childs, 1992). Se han descrito tres posibles subtipos de células corticotropas en base a la respuesta diferencial de sus principales secretagogos (Schwartz y col., 1994): células que responden únicamente al CRH, células que responden únicamente a la AVP y células que responden al CRH/AVP.
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La ACTH pertenece a una familia de péptidos derivados de una proteína precursora común, la proopiomelanocortina (POMC) (Chretien y Seidah, 1981). El gen que codifica para esta proteína se expresa en la hipófisis anterior y en la pars intermedia y en menores cantidades también en cerebro y tejidos periféricos. En la adenohipófisis la POMC es fragmentada en moléculas de ACTH de 1-39 residuos de aminoácidos, βlipotropina y pequeñas cantidades de β-endorfina (Jones y Gillham, 1988). La ACTH viaja en la circulación a la corteza adrenal donde estimula la síntesis y secreción de GCs, aldosterona (aunque no es el secretagogo principal) y andrógenos adrenales, actuando mediante su interacción con un receptor específico de membrana. El receptor para la ACTH pertenece al grupo de receptores conocidos como receptores de melanocortinas. El de la ACTH en concreto pertenece al subtipo 2, el cual es activado selectivamente por la ACTH y es expresado principalmente en las células adrenocorticales (Penhoat y col., 2000). En respuesta al estrés, la liberación de ACTH se multiplica entre 5-100 veces los niveles basales, alcanzando un máximo entre los 1015 min, dependiendo de la duración e intensidad del estímulo estresante. Una vez liberada a la circulación general la ACTH parece tener una vida media de entre 6-7 min (Lopez y Negro-Vilar, 1988). La ACTH tiene un efecto trófico y sensibilizante sobre la corteza adrenal, lo que permite aumentar la respuesta a la subsiguiente estimulación (Dallman y Jones, 1973; de Souza y Van Loon, 1982; Keller-Wood y Dallman, 1984). Cuando los animales son expuestos de manera regular a dosis fijas de ACTH, se observa un incremento en la respuesta de los GCs a lo largo del tiempo (Johnson y col., 1992), seguramente como resultado de la hipertrofia adrenal. Lo mismo ocurre durante el estrés crónico. Contrariamente, si la secreción de ACTH disminuye o es eliminada, la respuesta de los GCs a la ACTH se reduce en paralelo con la aparición de una atrofia adrenal. 68
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6.3.3. Las glándulas adrenales. Las glándulas adrenales están encima de los riñones y están compuestas por dos tipos de tejido, funcional y embriológicamente distintos: corteza y médula. La médula está situada en la parte más interna de la glándula y está formada por células cromafines. Tiene un origen embrionario similar al del sistema nervioso simpático por lo que sus productos de secreción son las catecolaminas: adrenalina y, en menor proporción, noradrenalina. La corteza adrenal está a su vez dividida en tres zonas histológicamente distintas: zona externa, llamada glomerular, situada debajo de la capa de tejido conjuntivo, que secreta principalmente el mineralocorticoide aldosterona, esencial para el equilibrio de sodio y osmótico; zona fascicular, la capa intermedia y la más ancha de las tres, que secreta GCs (en el hombre y otras especies el GC principal es el cortisol y en los roedores, la corticosterona); y la zona reticular, la más interna y delgada, secreta hormonas sexuales (andrógenos y estrógenos), pero normalmente en cantidades pequeñas con poco efecto sobre la función reproductora. Todas las hormonas esteroideas derivan de un precursor común, el colesterol (ver imagen de la transformación del colesterol en hormonas esteroideas en http://themedicalbiochemistrypage.org/spanishimages/adrenalsteroidsynthesis-sp.jpg) que proviene mayoritariamente de la circulación general. El colesterol es convertido a pregnenolona, precursor de todos los esteroides y por lo tanto de la corticosterona y la aldosterona. El paso limitante en la ruta biosintética de los GCs se encuentra en el paso del colesterol a pregnenolona, que tiene lugar en la mitocondria. Los GCs se liberan desde las glándulas adrenales a la circulación general, alcanzándose un máximo entre los 15 y 30 min en situaciones de estrés. Los GCs presentan una naturaleza lipofílica, lo cual hace que tengan poca difusibilidad en un 69
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medio acuoso como la sangre. Se ha descrito que en condiciones basales una alta proporción del cortisol circulante está unido a una proteína plasmática que facilita su transporte (Hammond, 1990). Se trata de una glicoproteína ácida llamada transcortina que se sintetiza en el hígado. La fracción unida de corticosteroides se considera biológicamente inactiva y la pequeña fracción libre representa la fracción biológicamente activa de la hormona y por lo tanto la que ejercerá sus acciones fisiológicas (Siiteri y col., 1982). La corticosterona o cortisol unido podría ser una reserva circulante de la hormona biológicamente activa. Al igual que la ACTH, los GCs no se secretan de modo continuo, sino que su secreción es intermitente durante periodos cortos de tiempo (minutos) y la separación entre los picos puede durar incluso horas. El número y la duración de los picos secretores varían a lo largo del día, teniendo en el hombre un máximo entre las 4 y la 8 h de la mañana y un mínimo entre las 8 y las 12 h de la noche. Estos cambios en la frecuencia y amplitud de la secreción son los que dan lugar al ritmo circadiano, que varía en función de los ritmos de actividad del individuo. En la rata, la secreción de corticosterona presenta niveles bajos durante el día (basales), comenzando a incrementar por la tarde y presentando su pico de secreción justo antes del anochecer que es cuando inicia su mayor actividad (Scheving y Pauly, 1966; Krieger y Hauser, 1978; De Boer y Van der Gusten, 1987). Los procesos regulados por los GCs son muy variados, puesto que actúan prácticamente en todos los tejidos. Según su lugar de actuación, podríamos clasificar sus funciones en metabólicas, inmunitarias, sobre el sistema cardiovascular y renal, esqueleto, tracto gastrointestinal, diferenciación y desarrollo, SNC y finalmente su efecto sobre otras hormonas. Periféricamente los GCs afectan al metabolismo celular incrementando durante el estrés la energía disponible para el organismo y por lo tanto, 70
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inhibiendo los procesos anabólicos. Por eso podemos decir que la función principal sería preparar al organismo para hacer frente a situaciones adversas como el estrés. Bajo variadas condiciones estresantes, incluyendo ejercicio, trauma, ansiedad y depresión, los niveles de cortisol se elevan, llevando a una cadena de eventos que en última instancia proveen rápidamente de energía al organismo y mantienen al individuo alerta a través de la estimulación del sistema adrenérgico (la típica reacción de huida o “respuesta de lucha o huida”). Sin embargo, cuando el cortisol se hipersecreta de forma crónica, pueden producirse secuelas fisiológicas deletéreas, tales como el incremento de la presión arterial, diabetes, ateroesclerosis, supresión inmunológica, reabsorción ósea (osteoporosis) y atrofia muscular.
6.4. Receptores corticosteroides. Las acciones genómicas de los corticoides sobre el SNC son mediadas por dos clases de receptores: receptor glucocorticoide tipo II (RG) y receptor mineralocorticoide tipo I (RM) (De Kloet y col., 1987, 1993), que difieren entre sí por su especificidad y afinidad por los ligandos, por su localización y por su función. Los RG no activados tienen una localización predominantemente citoplasmática. El receptor libre forma un complejo con un sistema de proteínas chaperonas (las proteínas de choque térmico o hsp90, hsp70, hsp40) o con las inmunofilinas FKBP52 (Rajapandi y col., 2000; Galigniana y col., 2001; Pratt y col., 2001). Estas proteínas confieren a los receptores una alta afinidad por la hormona y se disocian del receptor tras la unión de la misma. No obstante estas proteínas parecen estar también implicadas en el movimiento del RG desde el citoplasma hacia el núcleo, a lo largo de los microtúbulos (Galigniana y col., 2001; Pratt y col., 2001).
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Una vez la hormona se ha unido al receptor se produce un cambio conformacional y el complejo ligando-receptor se torna activo lo que le permitiría unirse a secuencias específicas de ADN en zonas reguladoras o promotoras de los genes denominados CRE (elementos de respuesta a los GCs). De esta manera, los GCs controlan la expresión génica activando o inhibiendo determinados genes. Los RM se unen principalmente a un GC como la corticosterona y a mineralocorticoides como la aldosterona presentando una alta afinidad por ambos, mientras que los RG presentan una afinidad relativamente baja por la corticosterona y mayor afinidad por el cortisol (aunque menor que la afinidad de los RM) y por diversos GCs sintéticos como la dexametasona. Los RM están presentes en órganos diana para los mineralocorticoides como el riñón, el intestino y las glándulas salivales, regulando el equilibrio osmótico y el consumo de sal. A nivel central, los RM se expresan particularmente en el hipocampo, el septum, la amígdala, el bulbo olfatorio y en regiones de la corteza cerebral (De Kloet y col., 1993). Dentro de la formación hipocampal, abundan en las áreas CA1, CA3 y en el giro dentado. También se ha encontrado en menor cantidad en el núcleo del tracto solitario. Los RG en cambio tienen una distribución más generalizada ya que pueden encontrarse en todos los tipos de tejido. Dentro del SNC se encuentra en gran abundancia en el sistema límbico (hipocampo y septum), en el NPV y en áreas monoaminérgicas del tronco encefálico. Se han detectado niveles moderados en muchos núcleos talámicos, el estriado, la amígdala central y la corteza (McEwen y col., 1986; Jones y Gillham, 1988; Sapolsky y col., 1990). La diferente afinidad de ambos receptores por la corticosterona determina que muestren un grado de ocupación distinto entre ellos, en función de los niveles circulantes de GCs. Así, cuando los GCs están elevados, como ocurre durante la noche 72
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(en ratas) o tras situaciones de estrés, los receptores que se van ocupando son los RG, razón por la cual tienen tanta importancia en el bloqueo de la respuesta del eje HPA. En cambio, los RM cumplen un papel modulador de los niveles basales del eje HPA en la fase diurna (De Kloet y col., 1987) por ser estos receptores los primeros en ser ocupados. A nivel periférico casi todos los tejidos poseen RG y en menor cantidad RM (Munck y col., 1984). La distribución diferencial de estos receptores en los tejidos permite a los GCs actuar en diferentes procesos metabólicos indispensables para el mantenimiento del organismo.
6.5. Mecanismo de retroinhibición de los glucocorticoides. La activación del eje HPA en situaciones de estrés es contrarrestada por el efecto inhibidor de los GCs, que se ejerce mediante su unión a receptores específicos situados en distintos niveles del SNC (ver imagen del esquema de la regulación del eje HPA en http://estrescancer.files.wordpress.com/2009/12/hpa.jpg). Estos mecanismos de control participan en la finalización de la respuesta al estrés, permitiendo de esta manera restablecer los niveles normales de las hormonas del eje HPA. Sin embargo, los mecanismos de retroinhibición controlados por los GCs son complejos, quedando actualmente muchos aspectos por comprender. Dallman y Yates (1969) propusieron la existencia de dos mecanismos inhibidores ejercidos por los corticoides, que se caracterizan por tener fases inhibitorias temporalmente distintas. (Dallman y Jones, 1973): •
Rápido: dependiente de la tasa de incremento de corticosteroides en sangre y de
acción rápida (antes de los 30 min.). Se ponen en marcha cuando los niveles de GCs se están incrementando pero no una vez que están estabilizados. La rapidez con que se
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Introducción
produce sugiere que en este mecanismo no está implicada la síntesis de proteínas. Su efecto se ejerce sobre la liberación de la hormona, presumiblemente a través de receptores de membrana (Keller-Wood y Dallman, 1984). •
Lento: dependiente de los niveles totales de GCs liberados durante las horas
precedentes, o de la dosis total de GCs administrada. Es un mecanismo de actuación lento y se ejerce a partir de la primera o segunda hora de aplicación del estímulo estresante. En este caso, los GCs suprimen la síntesis de CRH y ACTH y su mecanismo de acción implica una regulación genómica. Se ha descrito que los receptores implicados en ambos mecanismos de retroinhibición podrían ser distintos. Como se ha mencionado anteriormente, los efectos genómicos de los GCs se ejercen mediante la unión a dos tipos de receptores que actúan como factores de transcripción: RG y RM. Se desconoce la participación precisa de estos receptores en los dos mecanismos de retroinhibición, aunque como ya hemos mencionado, se postula que la retroinhibición rápida no estaría mediada por los RM y RG sino a través de un mecanismo independiente de la síntesis de proteínas (Brann y col., 1995; Falkenstein y col., 2000; Makara y Haller, 2001). En los mecanismos de retroinhibición más lentos participarían los RG y RM, actuando a diferentes niveles: -A nivel de hipófisis, inhibiendo la síntesis y liberación de ACTH. -A nivel hipotalámico, inhibiendo la síntesis y liberación de CRH. -A nivel de estructuras extrahipotalámicas, principalmente el hipocampo y la amígdala.
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Introducción
6.6. Estrés crónico y adaptación. La exposición a un estímulo estresante puede durar desde pocos segundos hasta días o semanas, y los efectos del estrés sobre el sistema endocrino son dependientes del tiempo de exposición. Si la estimulación estresante es repetida y se prolonga por cierto tiempo es considerada como estrés crónico, y se ha relacionado con importantes patologías psicológicas y fisiológicas en humanos. Se ha sugerido que el estrés es un factor importante en el desarrollo de enfermedades gastrointestinales, hipertensión arterial, supresión del sistema inmunitario, disfunciones reproductoras y depresión. Según la modalidad de presentación del estrés crónico podemos distinguir entre dos tipos: crónico continuo y crónico intermitente. En el estrés crónico continuo el animal puede ser sometido de manera sucesiva a estrés durante días o semanas, mientras que en el crónico intermitente los animales son expuestos durante un periodo de tiempo de semanas a una situación estresante con un tiempo de exposición diario que va desde minutos hasta horas. Como ejemplo de un modelo de estrés continuo podríamos mencionar el estrés social en roedores. Éste es particularmente notable cuando se potencia el comportamiento agresivo de los machos por la presencia de hembras (Blanchard y col., 1993). El modelo de estrés más usado experimentalmente es el crónico intermitente, en el que los animales son expuestos diariamente a una situación estresante. En la literatura, los modelos más utilizados son la exposición al frío, la restricción del movimiento (en un tubo), la inmovilización en tabla, la natación forzada o el choque eléctrico en las patas entre otros (Katz y col., 1981; Armario y col., 1984; Armario y col., 1988a; Riccio y col., 1991). Se podría hablar también del estrés crónico variable como otro modelo de estrés crónico que comparte características con las dos clases de situaciones crónicas
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mencionadas anteriormente. En este caso, los animales son expuestos diariamente a diferentes clases de estímulos estresantes de forma aleatoria, dificultando la posibilidad de predecir la llegada de un estímulo en particular y de adaptación (Katz y col., 1981; Armario y col 1985). La exposición a situaciones de estrés crónico, tanto continúo como intermitente, produce numerosos cambios fisiológicos y neuroendocrinos. Los cambios observados dependen de la clase de estímulo estresante aplicado, de la intensidad y de la duración. Con la exposición repetida a un estrés crónico intermitente de cierta intensidad se observa en la rata una disminución de la ingesta sólida que provoca una disminución del peso corporal (Martí y col., 1993a). Se observa también un incremento en el tamaño de las glándulas adrenales con relación a la pérdida de peso corporal. Este aumento podría atribuirse al efecto trófico de liberación diaria de ACTH, aunque no se descartan otros factores (Armario y col., 1988b). Aunque los niveles basales de ACTH suelen ser normales, los de corticosterona están incrementados, pero sólo en la fase diurna del ritmo circadiano, que es cuando los niveles plasmáticos de GCs están en su nivel más bajo en el caso de la rata (Martí y col., 1993b). Aunque los niveles de ACTH son normales al día siguiente de la última exposición al estrés crónico intermitente, esto no es indicativo de la ausencia de cambios bioquímicos en el eje HPA a nivel de la hipófisis o a nivel suprahipofisario. A nivel hipofisario se ha podido observar un incremento en la expresión del gen para la POMC y en el contenido de ACTH (Hollt y col., 1986) junto con una mayor respuesta a la administración exógena de CRH (Uehara y col., 1989; Martí y col., 1993b). La mayor respuesta al CRH coincide con un descenso del número de receptores en la hipófisis. Finalmente, a nivel hipotalámico, el estrés crónico produce un incremento de los niveles de ARNm de CRH en el NPV y en el número de células CRHérgicas capaces de 76
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coexpresar AVP (de Goeji y col., 1991; Mamalaki y col., 1992; Makino y col 1995). No se ha observado que el estrés crónico cambie el número de receptores de GCs en la hipófisis o en el hipotálamo, aunque sí se observa una disminución en la formación hipocampal (Sapolsky y col., 1984; Martí y col., 1994; Gómez y col. 1996). Tomados en conjunto, todos estos datos parecen demostrar que la capacidad potencial de respuesta del eje HPA está notablemente incrementada después de la exposición a estímulos estresantes crónicos aunque no se refleja en la actividad basal del eje (tónica). Esta mayor capacidad potencial de respuesta sería necesaria para asegurar en el futuro una respuesta adecuada del eje HPA frente a nuevas demandas, representada por nuevos estímulos estresantes de características y duración imprevisibles (Martí y Armario, 1998).
6.7. Cambios en el hipocampo relacionados con el estrés. El estrés empieza en el cerebro y afecta al cerebro, además de afectar al resto del cuerpo. Regiones del cerebro tales como el hipocampo, la CPF y la amígdala responden al estrés agudo y al crónico, y muestran cambios en la morfología y en la química. Asimismo, existen numerosas evidencias de que dicha alteración está mediada en buena medida por los corticoides (Newcomer y col., 1994). En las décadas recientes, numerosos estudios en neurociencia han mostrado que las experiencias estresantes pueden tener un impacto negativo en ciertas funciones cerebrales como el deterioro en las capacidades de aprendizaje y memoria, el incremento del deterioro cognitivo relacionado con la edad y el aumento de la susceptibilidad de las neuronas del hipocampo a sufrir atrofia o necrosis en respuesta a demandas metabólicas. No obstante, conviene recordar que la respuesta aguda al estrés
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(por ejemplo, incremento de la atención) se considera un mecanismo adaptativo que capacita al organismo para responder de manera efectiva a una amenaza, potencial o real, para su supervivencia. Los principales efectos del estrés sobre el hipocampo son los siguientes: •
Estrés y memoria hipocampal: el hipocampo es una de las dianas de las
hormonas del estrés, con una de las mayores concentraciones de receptores para corticosteroides (RMs y RGs) del cerebro de los mamíferos. Como ya se ha visto anteriormente, una función neuroendocrina del hipocampo es participar en la terminación de la respuesta de estrés por medio de una retroalimentación negativa que inhibe el eje HPA. Los RGs son los principales mediadores de los efectos adversos del estrés en el hipocampo. Estos efectos afectan negativamente al metabolismo neuronal, la supervivencia celular, las funciones fisiológicas y la morfología neuronal del hipocampo en las ratas. Numerosos estudios apoyan la idea de que el estrés y las hormonas del estrés deterioran las formas de memoria dependientes del hipocampo, tanto en humanos como en animales. Así por ejemplo, los pacientes con trastornos por estrés postraumático (TEP) presentan atrofia del hipocampo y déficits marcados en las tareas de recuerdo dependientes del hipocampo. •
Estrés y plasticidad en el hipocampo: en las tres últimas décadas, el modelo
fisiológico primario de la memoria ha sido la LTP. Si esta hipótesis de que los cambios en la eficacia sináptica subyacen al almacenaje de la información es válida, entonces el hallazgo de que el estrés deteriora la memoria dependiente del hipocampo predeciría que el estrés interferiría asimismo con la inducción de la LTP hipocámpica (o procesos relacionados), lo cual ha sido extensamente comprobado en estudios in vivo e in vitro.
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Introducción
•
Estrés y morfología dendrítica: McEwen y col. mostraron que el estrés o la
administración de corticosterona sostenida pueden producir atrofia de las espinas dendríticas en diversas áreas del hipocampo (CA3, CA1 y giro dentado). Dicha atrofia puede bloquearse con drogas que: -
reduzcan la transmisión de aminoácidos excitatorios como aspartato y glutamato (por ejemplo, fenitoína)
-
reduzcan los niveles extracelulares de serotonina (por ejemplo, tianeptino)
-
reduzcan la excitabilidad general a través de una estimulación GABAérgica (por ejemplo, benzodiazepinas) Esto pone de manifiesto los múltiples neurotransmisores y sistemas hormonales
implicados en la inducción de atrofia en las dendritas del hipocampo. La participación de los receptores NMDA es crucial y bien conocida en la plasticidad sináptica y la memoria. No obstante, la activación del receptor NMDA también parece ser un elemento central en la manifestación de los efectos adversos a corto y medio plazo en la morfología del hipocampo. Por ejemplo, en la muerte celular producida por la corticosterona se producen elevados niveles de Ca 2+ que pueden ser reducidos con antagonistas del receptor NMDA. Resulta irónico que las células piramidales del hipocampo desplieguen receptores NMDA para almacenar la información, aunque el mismo mecanismo, estimulado de forma crónica, puede provocarles su eliminación. •
Estrés y neurogénesis: el giro dentado es una región del hipocampo que produce
nuevas neuronas (células granulosas) aún en las personas de edad avanzada (Kempermann y Gage, 1999; Seri y col., 2001). Su significación funcional aún no se comprende del todo, pero parece relacionada con las demandas del aprendizaje y la
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memoria. Así por ejemplo, en situaciones de aprendizaje dependientes del hipocampo, su número total y la longevidad de las de nueva formación aumenta. El papel de esta plasticidad también puede ser proteger contra el daño permanente. La producción de células granulosas se inhibe por el estrés, agudo o crónico, o con la administración experimental de corticosterona. Asimismo, la retirada de los corticosteroides endógenos produce la estimulación de la producción de nuevas células granulosas en ratas jóvenes y adultas. El mecanismo subyacente es desconocido, si bien dado que las células granulosas carecen de receptores para GCs (ni RMs ni RGs), la influencia debe ser indirecta, quizás por medio de un incremento de la transmisión glutamatérgica. Al igual que el estrés afecta al aprendizaje dependiente del hipocampo y la LTP, por medio de la liberación de glutamato y la activación del receptor NMDA, idéntico mecanismo inhibe la proliferación de células granulosas. Una vez más, el receptor NMDA sirve como un sitio de acción común para los efectos constructivos (aprendizaje y memoria) y destructivos (inhibición de la proliferación celular) de los GCs en el hipocampo.
6.8. Neurobiología del estrés y neuroinflamación. La activación del eje HPA induce una respuesta de fase aguda muy similar en la naturaleza de sus componentes a la respuesta inflamatoria generada en un organismo en respuesta a infección o traumatismo agudo: activación glial, invasión de células inmunes, síntesis y liberación de citoquinas, radicales libres, prostaglandinas y factores nucleares (Lucas y col., 2006; Elenkov y Chrousos, 2002). La estrecha relación existente entre ambas respuestas se pone de manifiesto en ciertos estudios que demuestran que la exposición a distintos agentes estresantes
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Introducción
contribuye decisivamente al inicio, evolución y resolución de enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios crónicos que afectan a diferentes sistemas orgánicos, como cardiovascular, endocrino, digestivo, inmune, etc. Curiosamente, la relación inversa también tiene lugar, ya que el proceso inflamatorio generado por una infección o traumatismo activa el eje HPA y actúa como estímulo estresante (Black, 2002). Se ha comprobado que los GCs pueden realizar efectos contrapuestos. Al principio, suprimen la inflamación periférica al atenuar la producción y liberación de citoquinas, inhiben la actividad de moléculas de adhesión vascular y bloquean la actividad de los leucocitos. Los GCs también exhiben capacidad antiinflamatoria en el SNC y se utilizan clínicamente por su habilidad para reducir el edema relacionado con ciertos tumores cerebrales, la encefalitis vírica y la meningitis bacteriana. Sin embargo, el tratamiento con GCs no suprime la neuroinflamación subsiguiente a la exposición de ciertos estímulos agudos como la isquemia y daño cerebral, e incluso pueden empeorar la muerte celular que tiene lugar en estos escenarios patológicos. Además, los GCs pueden exhibir actividad proinflamatoria en el SNC, al regular positivamente la síntesis de moléculas proinflamatorias como prostaglandinas y leucotrienos y exacerbar la neuroinflamación generada por la infección con el virus de la inmunodeficiencia humana (Sorrells y Sapolsky, 2006). En relación con el estrés, Madrigal y col. (2001) demostraron cómo tras la exposición a estrés por inmovilización (una situación en la que los niveles de GCs endógenos están elevados), se produce una liberación y acumulación de mediadores típicamente proinflamatorios, como el NO, prostanoides, citoquinas y la activación del NFkB, lo que genera un estado de neuroinflamación en el cerebro estresado de la rata que podría contribuir al daño cerebral observado en las neuropatologías estrechamente 81
Introducción
relacionadas con la exposición a estrés. También nuestro grupo ha demostrado recientemente por técnicas inmunohistoquímicas que los GCs secretados tras la exposición a estrés son capaces de potenciar el proceso neuroinflamatorio generado por la administración de LPS, al aumentar los grados de micro y astrogliosis (de Pablos y col., 2006). Se han expuesto diversas hipótesis para explicar esta “paradoja de los GCs”. Los GCs podrían ejercer efectos opuestos en función del tipo de receptor mayoritariamente ocupado (RM frente a RG), de los niveles fisiológicos o suprafisiológicos de GCs alcanzados tras la exposición al estímulo, del tipo celular del SNC susceptible de poseer receptores para GCs, o del área cerebral implicada. Desafortunadamente, los mecanismos que subyacen bajo estas discrepancias encontradas en los distintos modelos experimentales de estrés utilizados permanecen desconocidos, pero su elucidación parece ser de crucial importancia para valorar los beneficios terapéuticos de los GCs y su correcta utilización.
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OBJETIVOS
Objetivos
La etiología de enfermedades neurodegenerativas tales como el Parkinson y el Alzheimer aún no está bien conocida. Sin embargo, los estudios histológicos han demostrado desde hace tiempo que la pérdida neuronal se encuentra acompañada de procesos inflamatorios, lo que se pone de manifiesto a través de la activación de la microglía y la inducción de citoquinas proinflamatorias. Este hecho llevó a nuestro grupo a estudiar si estos procesos inflamatorios constituían un efecto secundario del proceso de neurodegeneración o si por el contrario podrían tener algún efecto directo, aunque fuese en la progresión de la neurodegeneración, ya que estas patologías son crónicas. Con este fin se llevó a cabo la inducción de un proceso inflamatorio en distintos centros del SNC mediante la inyección directa de LPS, un compuesto proinflamatorio muy usado para inducir inflamación en los sistemas periféricos. Con este método pudimos demostrar que, a pesar de que se considera que el SNC es un órgano inmunológicamente privilegiado, la inyección directa de LPS podía disparar una respuesta inflamatoria. Un dato de gran interés fue el que no todas las estructuras cerebrales se comportaban de la misma forma, sino que algunas, y de manera especial la SN, presentaba una respuesta inflamatoria máxima, con una fuerte activación de la microglía, inducción de citoquinas y degeneración de neuronas. Sin embargo, el resto de estructuras estudiadas presentaron una respuesta circunscrita al tracto de inyección y sin degeneración neuronal aparente. Por este motivo, nuestro grupo se centró, en primer lugar, en el estudio del efecto de esta inflamación en la SN. Dicho estudio nos permitió desarrollar un modelo de la EP, ya que la neurodegeneración inducida por la inflamación era específica de las neuronas dopaminérgicas, lo que conlleva también a la pérdida de sus terminales en el estriado. Estos estudios demostraron que al menos en esta estructura la inflamación es capaz de inducir la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la SN, por lo que podría 83
Objetivos
actuar como una causa directa (inducida entre otros factores por la acumulación de proteínas modificadas, por ejemplo la α-sinucleina) o como causa secundaria de progresión (donde la inflamación sería una consecuencia del daño o de la muerte neuronal provocada). Estos descubrimientos fueron corroborados a través de estudios con compuestos antiinflamatorios; el tratamiento con este tipo de fármacos previno la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SN inducida por la inyección de LPS. De estos trabajos surgieron también dos cuestiones importantes: a)
¿Por qué no son todos los tipos de neuronas de la SN igual de sensibles a la inflamación, siendo las neuronas dopaminérgicas las únicas que degeneran?
b)
Teniendo en cuenta que la EA es la enfermedad neurodegenerativa neurodegene rativa inicialmente relacionada con los procesos inflamatorios y que la CPF y el hipocampo están principalmente implicados en esta enfermedad, ¿a qué se debe que las otras estructuras estudiadas, entre las que se encuentran la CPF y el hipocampo, sean menos sensibles a la inflamación inducida por la inyección de LPS que la SN?
Nuestro grupo de investigación ha sido capaz de contestar a la primera pregunta, demostrando que la especial sensibilidad de las neuronas dopaminérgicas viene determinada por su contenido en DA. Para contestar a la segunda pregunta se partió de la idea de que la sensibilidad a la inflamación podría depender de otros factores. Por ello nos pusimos a buscar factores fisiológicos que pudieran aumentar la sensibilidad a la inflamación de la CPF y el hipocampo, estructuras antes mencionadas. En la bibliografía existía la idea, no demostrada, de que condiciones como el estrés podrían favorecer la aparición de la EA. Por ello, nos propusimos estudiar la 84
Objetivos
influencia de un estrés crónico sobre la inflamación inducida por la inyección de LPS en la CPF e hipocampo, estructuras ligada a la EA. En este trabajo nos hemos centrado como principal objetivo en el estudio que el efecto del estrés produce en el hipocampo y su acción sobre la inducción de la inflamación producida por la inyección intrahipocampal de LPS. Para ello utilizaremos animales controles (no estresados) y animales estresados de manera crónica. La inducción crónica e impredecible del estrés es necesaria para que no haya adaptación a los factores estresantes y que éste permanezca durante un tiempo suficiente para que se puedan estudiar los procesos neurodegenerativos e inflamatorios. Este estudio se llevará a cabo usando al menos cuatro grupos de animales distintos: a) animales inyectados en el hipocampo con solución salina; b) animales inyectados en el hipocampo con LPS. Estos animales nos permitirán repetir y confirmar los experimentos anteriores en los que demostrábamos la pequeña respuesta a este estímulo; c) animales con estrés crónico inyectados con solución salina en el hipocampo y d) animales inyectados en el hipocampo con LPS y sometidos a estrés crónico. En primer lugar en estos animales se estudiará que se ha producido un estado de estrés mediante estudios comparativos del peso corporal y de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre, parámetros que son afectados por este factor, con el fin de asegurar que se ha producido el estado de estrés. Posteriormente, se estudiarán los parámetros de inflamación en el hipocampo de todos estos grupos de animales, esperando lógicamente que los animales estresados e inyectados con LPS muestren unas señales inequívocas de aumento de la respuesta a la inflamación mediante el estudio de la activación de microglía, del efecto sobre los astrocitos y la síntesis de citoquinas y compuestos inflamatorios como TNF α e IL-1β IL-1β.
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Objetivos
Una vez demostrado este punto pasaremos a ver el efecto sobre los posibles procesos de neurodegeneración estudiando muerte y degeneración neuronal, mediante inmunohistoquímica de NeuN e histofluorescencia con Fluoro Jade B, respectivamente. Por último intentaremos conocer los mecanismos de acción mediante el estudio de MAPKs (que activan rutas de degeneración por apoptosis o protección, dependiendo de su activación o inhibición), liberación de factores de crecimiento como BDNF y de compuestos productores de radicales como iNOS. También intentaremos estudiar la acción de homonas glucocorticoides, mediante el estudio del efecto del antagonista RU486 (mifepristona), usado en la farmacopea. Todos estos datos nos permitirán proponer al estrés como un factor de riesgo para la progresión de una neurodegeneración que podría ser semejante a la descrita en la EA.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
1. ANIMALES.
Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el «Guidelines of the European Union Council» (86/609/EU), siguiendo las regulaciones españolas (BOE 67/8509-12, 1998) para el uso de animales de laboratorio y aprobadas por el comité científico de la Universidad de Sevilla. En todos los experimentos realizados se usaron ratas albinas macho de la raza Wistar de 3 meses de edad (200-300 g) criadas en nuestro laboratorio. Se mantuvieron 3 ó 4 ratas por caja a temperatura ambiente constante (22 ± 2ºC) y una humedad relativa del 60%, con ciclos de luz-oscuridad de 12 h y acceso ilimitado a agua y comida (dieta de mantenimiento A.04 de Panlab S.L.).
2. OPERACIONES QUIRÚRGICAS.
Las operaciones intracerebrales se practicaron mediante trepanación del cráneo previa anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg de peso; i.p.) y posicionando el animal en un estereotáxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EEUU). Las coordenadas para inyectar en el hipocampo se tomaron siguiendo el atlas de cerebro de Paxinos y Watson (1986). Todas las inyecciones se realizaron en el hipocampo izquierdo a través de una jeringa Hamilton posicionada a 3.6 mm caudal, 2.0 mm lateral y 3.4 mm ventral con respecto al punto Bregma. Estas coordenadas corresponden al área hipocampal CA1 en una localización que abarca la parte más baja del stratum oriens y la capa de células piramidales de CA1. El flujo de inyección fue de 0.5 µl/min y el volumen total inyectado de 2 µL. Después de cada inyección se esperaron 10 minutos para evitar el
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Materiales y Métodos
reflujo a lo largo del tracto de inyección. Sin embargo, se evidenció alguna difusión de Monastral Blue en el corpus callosum.
3. TRATAMIENTOS.
Se establecieron 5 grupos de animales de acuerdo a los diferentes tratamientos y para cada grupo se usaron al menos 5 ratas. Estos grupos se esquematizan en la figura 5 y se explican a continuación:
(1)Controles
Vehículo 2µl
(2) Controles con estrés
Vehículo 2µl
(3) LPS
(4) LPS y estrés
(5) LPS, estrés y RU486
2
Estrés
LPS /2 l
LPS 2µg/2µl
Estrés RU486
LPS 2µg/2µl
Estrés Día 1
Día 10
Fig. 5. Esquema de los distintos grupos de animales de acuerdo con los tratamientos ensayados.
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Materiales y Métodos
3.1. Controles. Este grupo control recibió una única inyección en el hipocampo izquierdo de 2 µL de vehículo (Monastral Blue al 1% en tampón fosfato salino (PBS), utilizado como trazador inerte para localizar el sitio de la inyección). Los animales se sacrificaron 10 días después de la cirugía por perfusión o decapitación y los cerebros se procesaron para posteriores análisis.
3.2. Controles con estrés. Este grupo recibió una única inyección de 2µl de vehículo en el hipocampo izquierdo, siendo además estresados durante 9 días y finalmente sacrificados 10 días después de la cirugía.
3.3. Tratamiento con LPS. El grupo tratado con LPS recibió una única inyección intrahipocampal de 2 µg de LPS disuelto en 2 µL de vehículo. Los animales fueron sacrificados 10 días más tarde y los cerebros procesados para posteriores análisis.
3.4. Tratamiento con LPS y estrés. En este grupo los animales recibieron una única inyección intrahipocampal de 2 µg
de LPS disuelto en 2
µL
de vehículo y además fueron estresados durante 9 días.
Finalmente los animales fueron sacrificados 10 días después de la cirugía.
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Materiales y Métodos
3.5. Tratamiento con LPS, estrés y RU486. El grupo tratado recibió una única inyección intrahipocampal de 2 µg de LPS disuelto en 2 µL de vehículo, fue estresado durante 9 días y recibió una dosis diaria de RU486 (20 mg/Kg de peso en salino al 20% en dimetilsulfóxido (DMSO); s.c.) 1 hora antes del estrés. Los animales se sacrificaron 10 días después de la cirugía por perfusión y los cerebros procesados para posteriores análisis.
Las inyecciones de vehículo o LPS en los animales sujetos a los 9 días de estrés crónico variable, se realizaron el día 1 después de completar el primer estresor (ver tabla 2). La mayoría de los parámetros se analizaron a los 10 días después de la cirugía. Cuando los animales se analizaban a tiempos postlesión más cortos, el estrés crónico variable se realizó igualmente como se indica en la tabla 2 hasta el día correspondiente al del sacrificio.
4. MODELO DE ESTRÉS.
El estrés crónico variable fue adaptado de otros modelos de estrés variable (Willner y col., 1987; Konarska y col., 1990; Murua y Molina, 1992; Muscat y col., 1992; Gamaro y col., 2003), pero con algunas variaciones. Los animales se dividieron en dos grupos: el grupo de animales estresados y el grupo de animales no estresados. Los animales no estresados se mantuvieron alejados de cualquier molestia en sus jaulas durante los diez días que duró el tratamiento. Para el grupo de animales estresados se usó un ciclo de 9 días de estrés variable. Los estímulos estresantes individuales y el tiempo en que éstos eran aplicados cada día se han descrito en la tabla 2. En resumen
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Materiales y Métodos
estos estímulos estresantes fueron: (a) 24 h de privación de comida; (b) 24 h de privación de agua; (c) 1-3 h de inmovilización; (d) 24 h de aislamiento; (e) 1.5-2 h de inmovilización a 4ºC; (f) natación forzada durante 10 minutos. La aplicación del estrés empezó en diferentes momentos cada día, con objeto de evitar su predicción. La inmovilización se llevó a cabo colocando al animal en un tubo de plástico de 21 cm x 6 cm, ajustándolo con una tapadera de plástico por la parte exterior de tal forma que el animal no pudiera moverse y con un orificio al final del tubo que le permitiera respirar. La natación forzada se llevó a cabo colocando al animal en un tanque de cristal de 44 x 33 x 30 cm con 22 cm de profundidad de agua a una temperatura de 23 ± 2 ºC. El peso corporal de los animales se midió al comienzo y al final del tratamiento como un parámetro indirecto de activación del eje HPA. Con el mismo fin se midieron también los niveles de corticosterona y progesterona en sangre.
Tabla 2. Estímulos utilizados durante el tratamiento de estrés crónico. Día de tratamiento
Estímulo estresante
Duración
1
Natación forzada
10 min
2
Inmovilización
3h
3
Privación de agua
24 h
4
Inmovilización a 4º C
1.5 h
5
Aislamiento
24 h
6
Privación de comida
24 h
7
Privación de agua
24 h
8
Inmovilización a 4º C
2h
9
Privación de comida
24 h
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Materiales y Métodos
5. PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES.
Para las técnicas de inmunohistoquímica, los animales fueron perfundidos bajo profunda anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg; i.p.) con una solución de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato, pH 7,4. Los cerebros se separaron y se crioprotegieron sumergiéndolos en sacarosa en PBS, pH 7,4, primero al 10% durante 24 horas, luego al 20% 24-48 horas y más tarde al 30% hasta que se hundieron (2-5 días). A continuación se congelaron en isopentano a –15 ºC y se cortaron en un criostato en secciones de 25 µm. Dichas secciones se montaron en portaobjetos gelatinizados.
6. MEDIDA DE LOS NIVELES DE CORTICOSTERONA Y PROGESTERONA EN SANGRE.
Para extraer la sangre del corazón, las ratas fueron previamente anestesiadas con hidrato de cloral (400 mg/Kg de peso; i.p.). Para preparar las muestras de suero, la sangre extraída de cada animal se pasó directamente a tubos de centrífuga. A continuación se dejó coagular la sangre durante 30 minutos a temperatura ambiente. Rápidamente, la sangre coagulada se centrifugó a 2.000 x g durante 15 minutos a 4±2 ºC. Luego se transfirieron las muestras de suero a tubos separados y se almacenaron a 70ºC. La concentración de corticosterona y progesterona en suero se midió usando un kit de enzimoinmunonsayo (Assay Designs Correlate-EIA) para corticosterona y progesterona.
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Materiales y Métodos
7. INMUNOHISTOQUÍMICA.
7.1. Inmunohistoquímica de OX-6, GFAP y NeuN. Para localizar y cuantificar el daño en las poblaciones astrogliales y neuronales se usaron técnicas de inmunohistoquímica frente a GFAP y NeuN. En el caso de las poblaciones microgliales se usaron técnicas de inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo OX-6 que reacciona con el determinante monomórfico del complejo mayor de histocompatibilidad clase II presente en la microglía activada. El anticuerpo frente a GFAP es capaz de reconocer a la proteína fibrilar ácida presente en los astrocitos. El anticuerpo frente a NeuN reconoce a una proteína presente en los núcleos y citoplasmas neuronales. Todos los anticuerpos se obtuvieron a partir de suero de ratón. Las inmunohistoquímicas se realizaron sobre secciones de 25 µm de grosor de cerebros procedentes de animales perfundidos. Todos los lavados y diluciones se realizaron con tampón Tris salino (TBS) a pH 7,4. Para los tres anticuerpos se siguió un protocolo común que sólo se diferenció en las concentraciones de los distintos anticuerpos primarios (1:200 para el OX-6, 1:300 para el GFAP y 1:1000 para el NeuN). Las secciones se descongelaron y se dejaron secar durante unos minutos a temperatura ambiente. Después de varios lavados de 10 minutos cada uno se procedió a la desactivación de la peroxidasa endógena mediante una solución de H2O2 al 0,3% en metanol. Las secciones se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con suero de caballo al 1% en tampón TBS y posteriormente durante 18 horas con una solución del anticuerpo primario que contenía 0,25% de tritón X-100 y 1% de suero de caballo. Las secciones se mantuvieron a 4 ºC en una cámara con humedad para evitar que se secasen. El resto de la técnica se realizó a temperatura
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Materiales y Métodos
ambiente. Tras otra serie de lavados en TBS las secciones se trataron con una solución de IgG biotinilado de caballo frente a ratón preparada al 0,5% en tampón TBS con un 0,25% de tritón X-100 durante dos horas. Posteriormente y tras una nueva serie de lavados en TBS las secciones se incubaron durante una hora con una solución de ExtrAvidin®-Peroxidade (Kit ABC) diluido al 1% en TBS. La peroxidasa se visualizó revelando con una solución estándar de diaminobenzidina/peróxido de hidrógeno durante 5 minutos.
7.2. Análisis de los datos obtenidos por inmunohistoquímica. La cuantificación de las células NeuN positivas y OX-6 positivas en la región CA1 del hipocampo fue estimada de acuerdo a una aproximación estereológica. En el caso de cada animal, se cortaron en serie secciones de 25 µm de espesor. 4 de estas secciones fueron sistemáticamente muestreadas al azar empezando por un punto a lo largo del eje antero-posterior de la región CA1 del hipocampo. De esta manera, la distancia entre las secciones estudiadas fue de 100 µm. La región estudiada tuvo un espesor de 320 µm desde el plato número 31 al plato número 33 del atlas de Paxinos y Watson (1986). Sobre cada sección se colocaron ventanas de contaje (120 x 90 µm) sobre tres sitios igualmente espaciados a lo largo del la extensión medio-lateral de la CA1. El área de la región CA1 se estimó usando el principio de Cavallieri. Los diferentes tipos de células OX-6 positivas (las cuales exhiben diferentes formas dependiendo de su estado de activación) se contaron solamente en la región CA1. Todos los datos fueron recogidos y expresados como células por mm3.
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Materiales y Métodos
8. FLUORO JADE B.
Los animales fueron perfundidos, 48 horas después de la cirugía, bajo profunda anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg; i.p.) con una solución de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato, pH 7,4. Los cerebros se extrajeron y se crioprotegieron sumergiéndolos en sacarosa en PBS, pH 7,4, primero al 10% durante 24 horas, luego al 20% 24-48 horas y más tarde al 30% hasta que se hundieron (2-5 días). A continuación se congelaron en isopentano a – 15 ºC y se cortaron en un criostato en secciones de 18 µm. Dichas secciones se montaron en portaobjetos gelatinizados. Antes de usarlas, las secciones se secaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación se lavaron en etanol 100% durante 3 minutos y luego en etanol 70% durante 1 minuto. Posteriormente se lavaron durante 1 minuto en agua destilada. Las secciones se incubaron en una solución de 0.06% de permanganato potásico durante 15 minutos, preferiblemente en un agitador para asegurar la eliminación del ruido de fondo entre ellas. Luego las secciones se lavaron en agua destilada durante 1 minuto. La solución de tinción se preparó al 0.001% de Fluoro Jade B en ácido acético 0.1% a partir de una solución stock al 0.01% de Fluoro Jade B. La solución stock una vez almacenada en la nevera era estable durante meses, mientras que la solución de tinción fue preparada unos 10 minutos antes de su uso y no fue reutilizada. Después de 30 minutos en la solución de tinción, las secciones fueron lavadas en agua destilada tres veces, durante 1 minuto cada vez. A continuación, se colocaron en una placa calefactora a 50 ºC durante 20 minutos en oscuridad (hasta secarse completamente). Las secciones secas se aclararon por inmersión en xileno durante 6 minutos antes de montar los cubreobjetos con el medio de montaje DPX.
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Materiales y Métodos
9. HIBRIDACIÓN IN SITU.
9.1. Obtención de la ribosonda. En nuestro estudio usamos diferentes clones que fueron sembrados en placas de agar con medio de crecimiento Luria (LB) con 100 µg/mL de ampicilina como antibiótico. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 horas para conseguir colonias aisladas. Por cada clon se resembró una colonia, esta vez en 25 mL de LB líquido y con la misma concentración de ampicilina y se incubó a 37 ºC con agitación de 200 r.p.m. durante 16 horas. Tras esto se realizó la extracción del ADN plasmídico utilizando un kit de purificación de ADN Wizard® Plus Maxipreps de Promega. A continuación se procedió a la linealización de los distintos clones, incubando cada uno de ellos a 37 ºC durante 2 horas con la enzima de restricción correspondiente para obtener las sondas sentido y antisentido. Por último, el ADN linealizado se fenolizó y precipitó con etanol absoluto en frío y acetato sódico 3M (pH 5,3) para eliminar los restos de enzimas y sales remanentes tras las manipulaciones previas. Después de esto y tras cada paso intermedio, se realizaron electroforesis de alícuotas de 1 µL de cada uno de los clones en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, con objeto de visualizar y cuantificar el ADN. Posteriormente se procedió a la transcripción de este ADN para la obtención de la ribosonda. La mezcla de reacción contenía: 20 unidades de polimerasa, el tampón proporcionado con ésta, ATP, CTP y GTP, cada uno a concentración de 1 mM, 125 µCi de [35S] UTP 30 µM (1300 Ci/mmol), DTT 4 mM y 7,2 unidades de inhibidor de la ribonucleasa. La reacción de marcaje transcurrió a 37 ºC durante 2 horas y fue parada con EDTA 0.5 M. Seguidamente se separó el isótopo incorporado al ARNc del que no
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Materiales y Métodos
lo fue mediante columnas de Sephadex y posterior centrifugación durante 2 minutos a 735 x g. Los clones empleados fueron: 1. Los plásmidos pBluescript SK, que contenían la secuencia ADNc de la ácido glutámico descarboxilasa 67 (GAD67) como un inserto de EcoRI de 3.2 kb (clones 14 y 18), fueron amablemente cedidos por el Dr. A. Tobin (UCLA, Los Angeles, EEUU). El ADNc de GAD67 fue aislado de una librería de ADNc 1 gt-11 preparada a partir de ARN poli (A) del cerebro adulto de rata (Erlander y col., 1991). Para preparar el transcrito antisentido de GAD67, el clon 14 fue digerido con SalI y usado como molde con la polimerasa T3. Para preparar el transcrito sentido de GAD67, el clon 18 fue digerido también con SalI y usado como molde con la ARN polimerasa T3. 2. Las ribosondas específicas del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) fueron transcritas desde un molde de rata de 460-pb del codón de BDNF clonadas en un vector PGEM-4Z (Promega, Madison, WI, USA) que fue amablemente cedido por Genetech (South San Francisco, CA, USA). Los transcritos sentido y antisentido fueron generados usando las polimerasas SP6 y T7 desde los fragmentos HindIII y EcoRI del vector.
Las ribosondas sentido y antisentido usadas para la hibridación in situ se transcribieron en presencia de [35S] UTP (1300 Ci/mmol; Amersham Internacional).
9.2. Reacción de hibridación. Las secciones de 12 µm se obtuvieron en un criostato disponiéndose sobre portaobjetos previamente gelatinizados. Una vez descongeladas fueron post-fijadas en
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Materiales y Métodos
paraformaldehído al 4% durante 30 minutos, continuándose con tres pasos de lavado de 10 minutos cada uno en PBS, pH 7,4. Para disminuir las uniones inespecíficas las secciones fueron tratadas con 0,1 M trietalolamina pH 8,0 (1 minuto) y con anhídrido acético al 0,25% en 0,1 M trietanolamina (10 minutos). Se continuó con un lavado de 1 minuto en citrato sódico salino (SSC) 2X, preparado a partir de SSC 20X (3 M de NaCl y 0,3 M de citrato sódico). A continuación, las secciones fueron deshidratadas mediante paso por soluciones con concentraciones crecientes de etanol (30, 60, 90 y 100%) y secadas al aire. Posteriormente se procedió a la hibridación de la sonda de [35S] ARNc con su secuencia complementaria; previamente la sonda se diluyó en el tampón de hibridación y se desnaturalizó a 80 ºC durante 5 minutos. Dicho tampón se componía de formamida al 50%, 0,002% solución Denhardt, SSC 1X, 50 mM Tris-HCl, 0,1% pirofosfato sódico, 0,1 mg/mL ARN de levadura, 0,1 mg/mL esperma de salmón, 1mM EDTA y sal sódica de sulfato de dextrano. La hibridación se llevó a cabo durante 3 horas a 50 ºC, enjuagándose a continuación en dos soluciones de SSC 2X, una con 20 mM DTT y otra sin DTT. Seguidamente se sometieron a digestión con ribonucleasa (Rnasa) a 37 ºC (20µg/mL de Rnasa A en 0,5M NaCl, 0,01M Tris-HCl y 1mM EDTA, a pH 8,0) durante 30 minutos. Para aumentar la astringencia, las secciones se dejaron en una solución de SSC 2X con 0,02M β-mercaptoetanol a 25 ºC durante toda la noche, y otra solución de SSC 0,1X a 60 ºC durante 1 hora. Finalmente las secciones fueron deshidratadas en etanoles (30, 60, 90 y 100%) con acetato amónico al 0,3M y secadas al aire.
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Materiales y Métodos
9.3. Análisis y cuantificación de la señal de hibridación. Como paso previo a la cuantificación de la señal, los portaobjetos fueron expuestos a una película de autorradiografía Betamax durante 10 días. Para el estudio de la expresión del ARNm se cuantificó tanto la densidad óptica sobre la película de autorradiografía como el número de granos de plata sobre neuronas individuales, utilizando un sistema de análisis de imagen. Las secciones fueron procesadas para la emulsión autorradiográfica. Los portaobjetos se impregnaron de emulsión LM-1 diluida 1:1 con agua, manteniéndose en la oscuridad a 4 ºC durante 30 días (tres veces el tiempo de exposición del film). A continuación, las secciones se revelaron con el revelador D-19 (Kodak) durante 5 minutos a 15 ºC, se enjuagaron en agua destilada durante 1 minuto y se fijaron durante 4 minutos para teñirlas a continuación con violeta de cresilo al 0,5%, pH 3,8. Posteriormente se deshidrataron y finalmente se montaron con medio de montaje. Las células que expresan ARNm de GAD67 se contaron usando 6 secciones de 12 µm de espesor por animal. Las secciones fueron cortadas en serie y sistemáticamente distribuidas desde un punto a lo largo del eje antero-posterior de la región CA1. De esta manera, la distancia entre las secciones estudiadas fue de 60 µm. La región estudiada tuvo un espesor de 325 µm desde el plato número 31 al plato número 33 del atlas de Paxinos y Watson (1986). Para cada sección, se colocaron ventanas de contaje (120 x 90 µm) en tres sitios igualmente espaciados a lo largo de la extensión medio-lateral de la región CA1. El área de la región CA1 se estimó usando el principio de Cavallieri. Todos los datos fueron recogidos y expresados como células por mm3. Para la medida de la expresión del ARNm de GAD67, se cuantificaron las densidades de los granos de plata sobre los cuerpos celulares individuales utilizando el
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Materiales y Métodos
sistema de análisis de imagen AnalySIS. El marcaje se consideró específico cuando la acumulación de granos sobre las células en los núcleos excedía 5 veces el valor del ruido de fondo en la ampliación 100X. Se especificó el área con alta densidad de granos sobre los cuerpos celulares individuales y se contó el número de granos dentro de este campo mediante un sistema de análisis de imagen con una ampliación de 40X. Debido a los altos niveles de marcaje, a la disposición típica de las agrupaciones sobre los cuerpos celulares y al alto aumento, la delimitación fue inequívoca. Sólo las células bien separadas se seleccionaron para la cuantificación. Se analizaron las secciones correspondientes al sitio de la lesión de cinco animales por tratamiento. En el caso del BDNF se analizaron las secciones correspondientes al sitio de la lesión de cinco animales por tratamiento, contándose las células por sección en 5 secciones por animal.
10. DESHIDRATACIÓN Y MONTAJE DE LAS SECCIONES.
Para la deshidratación de las secciones se utilizó un procedimiento general mediante el cual se sumergieron en soluciones de concentraciones crecientes de etanol (50, 70, 80, 90 y 100%) durante 5 minutos y seguidamente se mantuvieron durante 15 minutos en histolemon. El medio de montaje utilizado una vez completado el proceso fue DPX.
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Materiales y Métodos
11. CUANTIFICACIÓN RELATIVA DE PCR A TIEMPO REAL.
Los hipocampos izquierdos de cada rata fueron diseccionados 6 horas después del tratamiento, congelados rápidamente en nitrógeno líquido y guardados a –80 ºC. El ARN total fue extraído usando el kit RNeasy® (Quiagen). El ADNc fue sintetizado desde 1 µg del ARN total usando el kit de transcripción inversa QuantiTest® (Quiagen) en un volumen de reacción de 20 µl como se describe en el protocolo del fabricante. La PCR a tiempo real fue realizada con iQ TMSYBR ® Green Supermix (Biorad), 0.4
µM
cebadores y 1 µl de ADNc. Paralelamente se realizaron controles sin ADNc. La amplificación tuvo lugar en un termociclador Mastercycler ® ep realplex (Eppendorf) a 94 ºC durante 3 minutos seguidos de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 30 segundos, de alineamiento a 55 ºC durante 45 segundos y de extensión a 72 ºC durante 45 segundos, seguidos de una elongación final a 72 ºC durante 7 minutos. Tras la amplificación, se realizó el análisis de una curva de desnaturalización calentando las reacciones desde 65 a 95 ºC a intervalos de 1 ºC mientras se monitoriza la fluorescencia. El análisis confirmó un producto de PCR simple en la temperatura de desnaturalización pronosticada. La β-actina sirvió como control interno (gen de referencia) y fue usada para normalizar las muestras. Las secuencias de los cebadores para IL-1β, TNF-α y β-actina se muestran en la tabla 3. El ciclo al cual cada muestra alcanza un umbral de fluorescencia, Ct, fue determinado, y se calculó el promedio de los valores triplicados para cada ADNc. Los análisis de PCR a tiempo real se hicieron usando un método comparativo de Ct.
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Materiales y Métodos
Tamaño de Cebadores sentido y antisentido producto Referencia esperado (pares de bases) S: 5´-CAGGATGAGGACATGAGCACC-3´ 447 Rostworowski y IL-1β A: 5´-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3´ col., 1997 297 Meltzer y col., 1998 TNF-α S: 5´-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3´ A: 5´-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC-3´ 514 Rostworowski y β-actina S:5´-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3´ A:5´-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3´ col., 1997 ARNm diana
Tabla 3. Cebadores para la RT-PCR a tiempo real.
12. ANÁLISIS DE PROTEINAS POR WESTERN BLOT .
Una de las técnicas más comunes
para detectar y analizar proteínas es el
Western blot . Dicha técnica consiste en dos fases. En la primera se realiza una
electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida–Dodecil Sulfato Sódico (SDSPAGE), donde las proteínas desnaturalizadas son separadas en función de su peso molecular (Laemmli, 1970). En nuestro caso se han utilizado geles del 10% y del 16% en un sistema de electroforesis Mini-Protean II. En la segunda fase se lleva a cabo una transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa. Previamente el hipocampo fue homogeneizado en 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA y 1 mM PMSF (todos de Sigma). El homogeneizado se centrifugó a 12000 g durante 20 minutos a 4 ºC. Seguidamente, el sobrenadante se fraccionó y se congeló a – 80 ºC. El contenido de proteínas de las
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Materiales y Métodos
muestras se estimó por el método de microLowry usando un estándar de albúmina sérica bovina. Las muestras se mezclaron en proporción 1:1 con el tampón de muestra (0.01 M Tris/HCl pH 6.8, 20% glicerol, 10% β- mercaptoetanol, 2.3% SDS, 0.005% azul de Bromofenol), y posteriormente fueron hervidas a 100 °C durante 5 min. Se cargaron unos 25-50 µg de proteínas en cada pocillo. Las muestras de proteínas se separaron por SDSPAGE (10%, en el caso de las proteínas kinasas activadas por mitógeno (MAPKs); 16% en el caso de la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) y la iNOS). El tampón de corrido que se empleó fue una solución cuya composición es: 0.025 M Tris/HCl, 0.19 glicina y 0.1% SDS. En cuanto a las condiciones de las electroforesis, electroforesis , éstas se llevaron a cabo a 30 mA usando geles de 1,5 mm de grosor. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se procedió a la segunda fase, en la que las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C Extra; Amershan Life Science, RU), utilizando el sistema de electrotransferencia (TransBlot Cell, Bio-Rad). El tampón de transferencia contenía 25 mM Bicina, 25 mM Bis-Tris, 1 mM EDTA, pH 7,2 y 20 % de metanol. La transferencia se realizó según el método descrito por Towbin y col. (1979), durante 2 h a 4ºC y 120 voltios. Tras la electroforesis y transferencia a membranas de nitrocelulosas se realizó la inmunodetección de las proteínas de interés mediante los anticuerpos específicos correspondientes (tabla 4). Lo primero que se hizo fue teñir las membranas con una solución reversible de rojo Ponceau (0.2 % rojo Ponceau en 3 % TCA), para indicar que en los diferentes pocillos hay la misma cantidad de proteínas. Las membranas se lavaron con tampón Tris salino con Tween (TTBS, 20 mM TrisHCl, 500 mM NaCl y 0,05 % Tween 20) durante 15 min. Para evitar uniones
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Materiales y Métodos
inespecíficas del anticuerpo a la superficie de la membrana, se trató con leche de bloqueo (5% en TTBS) durante 1 h a temperatura ambiente y agitación suave. A continuación las membranas se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente. Los anticuerpos no fosforilados se utilizaron como controles de carga.
Anticuerpo
Origen
Dilución
Tiempo
SAPK/JNK
Cell Signaling Tech
1:1000
1h
P-SAPK/JNK
Cell Signaling Tech
1:1000
Toda la noche
(Thr 183/Tyr 185) P38
Santa Cruz biotech
1:500
1h
P-p38 (Tyr 182)
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
ERK1/2
Santa Cruz biotech
1:1000
1h
P-ERK1/2 (Tyr 204)
Santa Cruz biotech
1:1000
Toda la noche
Akt
Santa Cruz biotech
1:500
1h
P-Akt (Thr 308)
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
GSK-3β GSK-3β
Santa Cruz biotech
1:500
1h
P-GSK-3β P-GSK-3β β (Tyr 216)
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
CREB-1
Santa Cruz biotech
1:500
1h
P-CREB-1 (Ser 133)
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
iNOS
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
nNOS
Santa Cruz biotech
1:500
Toda la noche
Tabla 4. Anticuerpos primarios utilizados para el análisis de
Western blot .
Todos los anticuerpos fueron diluidos en TBS 0,05% Tween 20 y 5 % de leche en polvo, y se conservaron en frío para ser reutilizados en varias inmunodetecciones. inmunodetecciones.
Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las membranas se lavaron en tampón TTBS, y luego fueron incubadas con anticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de conejo, ratón y cabra conjugados con peroxidasa (DAKO,
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Materiales y Métodos
Produktionsvej, DK) en una dilución de 1:3000 durante 1 hora a temperatura ambiente y en tampón TTBS. Las proteínas se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL). Todos los experimentos fueron repetidos por triplicado. Para la cuantificación de las bandas de proteínas las películas autoradiografiadas se secaron a temperatura ambiente, las bandas fueron analizadas por densitometría utilizando un programa de ordenador Quantity One® 1-D Análisis Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las bandas de interés fueron delimitadas y la densidad óptica fue obtenida.
13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Los resultados se expresaron como la media ± la desviación estándar. Las medias se compararon mediante una ANOVA de una vía y se usó el test LSD para comparaciones múltiples. También se realizaron correlaciones intra animales entre las seis MAPKs estudiadas, utilizando el programa de ordenador Statgraphics.
14. REACTIVOS. El lipopolisacárido obtenido de Escherichia coli serotipo 026: BC fue proporcionado por Sigma Chemical Co, EE.UU. El Monastral®Blue se obtuvo de Sigma Chemical Co, EE.UU. El inhibidor para la activación de los receptores de glucocorticoides, RU486, se obtuvo de Sigma Chemical Co, EE.UU.
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Materiales y Métodos
El kit para las medidas de corticosterona y progesterona fue proporcionado por Assay Designs Inc., Ann Arbor, Michigan, EE.UU. En las determinaciones inmunohistoquímicas de la población neuronal, astroglial y microglial se utilizaron los siguientes productos: como anticuerpos primarios se usaron anti-OX-6 hecho en ratón (Serotec, RU); anti-proteína fibrilar ácida de glía hecha en ratón (GFAP, Chemicon, EE.UU.) y anti-NeuN obtenida también en ratón (Chemicon International). El anticuerpo secundario utilizado fue en los tres casos un anti-IgG biotinilado de Vector (RU) contra ratón obtenido en caballo, mientras que como sistema de revelado se utilizó el Kit ABC (ExtraAvidin®-Peroxidase) de Vector (RU). El suero empleado fue suministrado por Vector (RU). El agua oxigenada para la destrucción de la peroxidasa endógena se obtuvo de Merck, Alemania, mientras que la utilizada para el revelado con diaminobenzidina fue proporcionada por Sigma Chemical Co, USA. Para el revelado de las técnicas inmunohistoquímicas se utilizó tetracloruro de 3,3´diaminobencidina (DAB), de Sigma Chemical Co. El Tritón X-100 fue suministrado por Sigma Chemical Co, EE.UU. Para la deshidratación y montaje de las secciones se utilizó Histolemon de Carlo Erba y DPX de VWR International Inc. Poole, Inglaterra Para la histofluorescencia con Fluoro Jade B se utilizó una solución al 0.06% de permanganato potásico de Panreac, una solución stock al 0.01% de Fluoro Jade B de Histo-Chen Inc, Jefferson AR y ácido acético al 0.1 % de Panreac. Como líquido de centelleo se empleó Formula-989 LSC Cocktail de New England Nuclear. La perfusión de los animales para las técnicas de inmunohistoquímica se realizó con paraformaldehído de Carlo Erba. 106
Materiales y Métodos
Para la elaboración de las ribosondas empleadas en la hibridación in situ, el medio para el desarrollo y mantenimiento de Escherichia coli fue la Base de Caldo de Luria suministrada por Cultimed y el Agar Bacteriológico adquirido a Biolife Italiana. El antibiótico empleado fue ampicilina (Sigma Chemical Co). El ADN plasmídico fue obtenido mediante un kit de purificación de ADN Wizard® Plus Maxipreps de Promega, Madison, Wi, EEUU. Los plásmidos fueron linealizados con las enzimas de restricción Sal I, HindIII y EcoRI proporcionadas por Amersham Pharmacia Biotech, RU. Tanto el fenol como el cloroformo utilizados en la precipitación del ADN fueron suministrados por Sigma Chemical Co. Para visualizar el ADN plasmídico tras cada paso se realizaron electroforesis en geles de agarosa (Pronadisa) teñidos con bromuro de etidio (Merck). En los estudios de hibridación in situ se usó dietilpirocarbamato de Serva como inhibidor de las ribonucleasas a lo largo de todo el ensayo y uridina 5´[ 5´[α α-tio] [35S] triofosfato (UTP) de Amersham Pharmacia Biotech como marcador del ARNm. Para la transcripción de las sondas se emplearon las polimerasas de ARN T3, SP6 y T7 de Promega, Madison, WI, EE.UU., así como microcolumnas ProbeQuant G-50 de Amersham Pharmacia Biotech para la separación del UTP no incorporado a la sonda. Los reactivos de uso en el ensayo de hibridación in situ fueron de calidad para biología molecular. Para el Western blot se utilizaron NaCl, EDTA, EGTA y PMSF para la preparación del tampón de homogenización todos ellos de Sigma. Se usaron anticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de conejo, ratón y cabra conjugados con peroxidasa de DAKO, Produktionsvej, Dinamarca. Para la visualización de las bandas de proteínas se usó quimioluminiscencia de Pierce, Rockford, Ilianois.
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Materiales y Métodos
En la técnica de la PCR a tiempo real, para la extracción del ARN total se utilizó el kit RNeasy® de Quiagen y para la síntesis del ADNc se utilizó el kit de transcripción inversa QuantiTest® de Quiagen. La PCR a tiempo real fue realizada con iQTMSYBR ® Green Supermix de Biorad. La amplificación tuvo lugar en un termociclador Mastercycler ® ep realplex de Eppendorf . Los demás solventes y reactivos fueron de alto grado de pureza, obteniéndose todos ellos de los proveedores habituales.
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RESULTADOS
Resultados
1. CAMBIOS EN EL PESO CORPORAL. Con el fin de evaluar que los animales estuvieran realmente estresados se decidió medir su peso corporal como un parámetro de estrés. La ganancia en el peso de los animales durante el experimento se muestra en la figura 6. Mientras que los animales no estresados aumentaron su peso a lo largo de todo el tiempo que duró el experimento (p< 0,05), en el caso de las ratas estresadas no fue así. Las alteraciones del peso corporal son efectos típicos del estrés y se utilizan frecuentemente como un método para comprobar que el modelo de estrés aplicado es correcto (Gamaro y col., 2003).
Fig. 6. Efecto del estrés en el peso corporal en animales estresados y no estresados. Peso corporal al principio y al final del tratamiento en ratas estresadas y no estresadas. Los resultados, expresados en gramos, muestran las medias ± DE de 5 experimentos independientes. Significación estadística (t de Student) comparado con el peso al principio del tratamiento en ratas no estresadas: *, p<0,05.
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Resultados
2. CAMBIOS EN LOS NIVELES DE CORTICOSTERONA Y PROGESTERONA EN SANGRE.
Los niveles de corticosterona y progesterona en sangre se midieron como un índice de estrés crónico para asegurar que se ha producido el estado de estrés, ya que son parámetros que se afectan con este proceso. Debido a que los niveles de esteroides cambian a lo largo del día (en el caso de la rata se presentan niveles bajos durante el día, los cuales se incrementan por la tarde, presentado el pico de secreción justo antes del anochecer), las muestras de sangre se recogieron en dos momentos diferentes del día: por la mañana (entre las 9:00h-10:00h) y por la tarde (entre las 19:00h-20:00h), el día 10 del experimento. Como se esperaba, los niveles de corticosterona y progesterona en sangre aumentaron por la tarde y también en condiciones de estrés. El estrés aumentó significativamente los niveles de corticosterona durante la mañana (128% de los niveles control correspondientes) y durante la tarde (153% de los niveles control correspondientes) (p<0,01; Fig. 7A). El tratamiento con RU486 redujo los niveles de corticosterona a cerca del valor control correspondiente (110% de los niveles control por la mañana y 131% de los niveles control por la tarde, p<0,01; Fig. 7A). Al igual que la corticosterona, los niveles de progesterona también aumentaron después del estrés (150% y 159% de los niveles control correspondientes para las muestras recogidas por la mañana y por la tarde respectivamente) (p<0,01; Fig. 7B). En este caso, el tratamiento con RU486 no redujo los niveles de progesterona en sangre, aunque solamente los aumentó de manera significativa en las muestras recogidas por la tarde (208% de los niveles control, p<0,01; Fig. 7B).
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Resultados
Figura 7. Efecto del estrés en los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. (A) Cuantificación de los niveles de corticosterona en sangre en los distintos tratamientos ensayados (C: animales control, no estresados; E: animales estresados; ERU, animales estresados y tratados con RU486). Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): *, comparado con la mañana dentro del mismo grupo; a, comparado con el control, por la mañana; b, comparado con las muestras recogidas por la mañana de los animales estresados; c, comparado con el control, por la tarde; d, comparado con las muestras recogidas por la tarde de los animales estresados; p< 0.01. (B) Cuantificación de los niveles de progesterona en sangre en los distintos tratamientos ensayados (C: animales control, no estresados; E: animales estresados; ERU: animales estresados y tratados con RU486). Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): *, comparado con la mañana dentro del mismo grupo; a, comparado con el control, por la mañana.; b, comparado con el control, por la tarde; c, comparado con las muestras recogidas por la tarde de los animales estresados; p<0,01.
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Resultados
3. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LA MICROGLÍA. Con el fin de estudiar el efecto de los distintos tratamientos sobre la activación de la microglía inducida por el LPS se realizaron técnicas de inmunohistoquímica de OX-6. El OX-6 es un anticuerpo contra un determinante monomórfico del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II de la rata, expresado por la microglía reactiva pero no por la microglía residente. De esta manera podemos visualizar células “activadas”, caracterizadas por procesos más gruesos y cuerpos celulares mayores a los de células de cerebros controles, así como microglía fagocítica, con una morfología de pseudopódica a globular, y en su mayoría carentes de procesos que recuerdan a células cargadas de lípidos. En respuesta a un daño las células microgliales proliferan y se activan (cambian de morfología, desde una microglía residente ramificada con dos o tres finas prolongaciones hasta células redondeadas similares a los macrófagos tisulares). En nuestro diseño experimental un incremento en la expresión de OX-6 es un marcador de daño celular causado por neurotoxinas. Por el contrario se considera neuroprotección cuando aparece una disminución en la expresión de OX-6. La inyección de vehículo en animales no estresados produce una ligera reacción microglial (Fig. 8A y F) y tiene un débil efecto en los animales estresados (Fig. 8B y F). A diferencia de lo que sucede en otras estructuras, como por ejemplo la SN, la inyección de LPS en animales no estresados no logró una fuerte activación de las células microgliales, llegando incluso a mostrar valores similares a los del grupo control (99%, Fig. 8C y F). Sin embargo, la inyección de LPS en animales estresados aumentó notablemente las células microgliales reactivas, demostrándose así un efecto sinérgico de ambos factores (289% comparado con los animales inyectados con vehículo, p< 0,01; Fig. 8D y F). Dicho efecto se vio muy disminuido tras el tratamiento con
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Resultados
mifepristona (126% comparado con los animales inyectados con vehículo, p< 0,01; Fig. 8E y F).
4. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LA ASTROGLÍA.
Para
la
tinción
de
las
células
astrogliales
se
usaron
técnicas
de
inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal contra el GFAP, el cual es capaz de reconocer a la proteína fibrilar ácida presente en los astrocitos. Nuestros resultados muestran una astrogliosis moderada alrededor del sitio de inyección de vehículo en animales no estresados y estresados, sin mostrar pérdida de inmunotinción de GFAP, es decir, no se produce pérdida de astrocitos (Fig. 9B y C). Resultados similares se encontraron cuando se inyectó LPS en el hipocampo de animales no estresados (Fig. 9D), encontrándose sólo una pequeña hiperactividad alrededor del sitio de inyección. Sin embargo, cuando el LPS fue inyectado en animales estresados, se evidenció que el estrés refuerza el efecto del LPS, produciendo una fuerte astrogliosis (mayor hiperactividad) pero no pérdida de astrocitos (Fig. 9E). Por otro lado el tratamiento con RU486 redujo este efecto de una manera considerable (Fig. 9F), observándose una menor astrogliosis.
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Resultados
Figura 8. Efecto del estrés y el LPS sobre la microglía. (A) Sección coronal que muestra una ligera inmunorreactividad del OX-6 en un animal no estresado e inyectado con vehículo. (B) Activación del OX-6 en un animal estresado e inyectado con vehículo. (C) Inmunorreactividad en un animal no estresado e inyectado con LPS. La flecha señala el sitio de inyección de 2 µg de LPS. La activación microglial fue débil. (D) Inmunorreactividad del OX-6 en un animal estresado e inyectado con LPS. La reacción microglial es más fuerte y más extensamente distribuida alrededor del sitio de inyección (flecha). (E) El tratamiento con RU486 reduce la activación del OX6 en un animal estresado e inyectado con LPS. Barra de escala: 100 µm. (F) Cuantificación de los cambios en las poblaciones microgliales en la región CA1 al final de los tratamientos. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos independientes, y representan células OX-6 positivas por mm3. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones * múltiples): , comparado con el control, animal inyectado con vehículo; p<0,01. Abreviaturas: S, control, vehículo inyectado en el hipocampo de ratas no estresadas; SE, vehículo inyectado en el hipocampo de ratas estresadas; L, LPS inyectado en el hipocampo de animales no estresados; LE, LPS inyectado en el hipocampo de animales estresados.
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Resultados
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Resultados
Figura 9. Efecto del LPS y el estrés en la astroglía. (A) Representación esquemática del sitio de inyección en la región CA1 del hipocampo. (B) Sección coronal que muestra la inmunorreactividad de GFAP en un animal no estresado e inyectado con vehículo. (C) Inmunorreactividad de GFAP en un animal estresado e inyectado con vehículo. (D) Sección coronal que muestra una inmunorreactividad de GFAP en un animal no estresado e inyectado con LPS. La flecha señala el sitio de inyección de 2 µg de LPS. (E) Inmunorreactividad de GFAP en un animal estresado e inyectado con LPS. La flecha indica el sitio de inyección de 2 µg de LPS. La expresión de GFAP es más intensa alrededor del sitio de inyección. (F) El tratamiento con RU486 reduce la activación de astrocitos en un animal estresado e inyectado con LPS. Barra de escala: 100 µm.
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Resultados
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Resultados
5. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LAS POBLACIONES NEURONALES.
Para
detectar
neuronas
en
general
se
llevaron
a
cabo
técnicas
de
inmunohistoquímica frente a NeuN, mientras que para marcar específicamente neuronas GABAérgicas se realizaron técnicas de hibridación in
situ
frente al ARNm de GAD67.
La inmunohistoquímica con NeuN consigue teñir el núcleo y el citoplasma de las neuronas (Fig. 10). La pérdida de neuronas NeuN positivas fue restringida al tracto de inyección cuando se inyectó vehículo en el hipocampo de animales no estresados y estresados, obteniéndose un número de células/mm3 de 4.4 x 105 y 4.6 x 105, respectivamente (Fig. 10A, B y F). Resultados similares se encontraron cuando el LPS se inyectó en el hipocampo de animales no estresados (4.0 x 105 cél/mm3; Fig. 10C y F). Sin embargo, se detectó una pérdida significativa de neuronas NeuN positivas en la región CA1 después de la inyección de LPS en animales estresados, demostrándose otra vez un efecto sinérgico del estrés y el LPS (2.2 x 105 cél/mm3, p< 0,01 comparado con el número de neuronas contadas en animales controles; Fig. 10D y F). Este efecto también se vio reducido tras el tratamiento con RU486, obteniéndose un número de neuronas similar al de los animales controles (4.5 x 105 cél/mm3; Fig. 10E y F). El sistema GABAérgico presenta una abundante población neuronal en el hipocampo, por lo que va a expresar un elevado nivel del ARNm de GAD67 (Fig. 11). Por ello se evaluó el efecto del LPS y el estrés en las poblaciones GABAérgicas inyectando bien vehículo o bien LPS en ratas estresadas y no estresadas. La especificidad de las señales generadas por la hebra antisentido de ARN se confirmó utilizando también la sonda sentido (no mostrado). La pérdida neuronal no fue
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Resultados
significativa tras la inyección de vehículo o LPS en los distintos grupos ensayados (Fig. 11I). Cuando estudiamos los niveles de expresión del ARNm de GAD67 cerca del sitio de inyección (Fig. 11E-H y J), encontramos un modesto aumento de estos niveles en los animales estresados e inyectados con vehículo (119% comparado con los animales controles inyectados con vehículo; Fig. 11F y J). El LPS por sí solo no indujo un aumento de la expresión del ARNm de GAD67, siendo los valores medidos muy similares a los de los animales controles (92% comparado con los animales control; Fig. 11G y J). Sin embargo, el LPS produjo un aumento más pronunciado de estos niveles en los animales estresados (137% comparado con los animales inyectados con vehículo, p< 0,05; Fig. 11H y J). Para confirmar la neurodegeneración en la región CA1 del hipocampo de las ratas, las secciones fueron procesadas para una histofluorescencia con Fluoro Jade B (un marcador autofluorescente de alta afinidad para la localización de degeneración neuronal) (Fig. 12). En el hipocampo de animales no estresados e inyectados con vehículo se encontraron tan sólo algunas neuronas dispersas marcadas con Fluoro Jade B (Fig. 12A). En la región CA1 cercana al tracto de inyección en animales estresados e inyectados con salino se detectaron neuronas Fluoro Jade B positivas (Fig. 12B), al igual que en animales no estresados e inyectados con LPS (Fig. 12C). Sin embargo, y como era de esperar, cuando el LPS se inyectó en animales estresados, se detectaron numerosas neuronas degenerando a la largo de la mayor parte de la región CA1 (Fig. 12D).
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Resultados
Figura 10. Efecto del estrés y el LPS en las neuronas de la región CA1 del hipocampo. (A) Sección coronal que muestra la inmunorreactividad del NeuN tras la inyección de vehículo en animales no estresados. La pérdida se reduce al tracto de inyección. (B) Inmunorreactividad del NeuN tras la inyección de vehículo en animales estresados. (C) Sección coronal que muestra la inmunorreactividad del NeuN tras la inyección de 2µg de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. (D) Inmunorreactividad del NeuN tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de ratas estresadas. La tinción uniformemente distribuida se alteró alrededor del sitio de inyección (flecha). El área carente de tinción es extensa. (E) El tratamiento con RU486 disminuye la pérdida de neuronas NeuN positivas causada por la acción combinada del LPS y el estrés. (F) Cuantificación del número de neuronas NeuN positivas. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos independientes, y representan células/mm3. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): *, comparado con el control, animales inyectados con vehículo, p<0,01. Barra de escala: 100 µm.
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Resultados
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Resultados
Figura 11. Efecto del LPS y el estrés en las neuronas hipocampales que expresan el ARNm de GAD67. (A) Fotografía de una autorradiografía que muestra la expresión del ARNm de GAD67 tras la inyección de vehículo en animales no estresados. (B) Expresión del ARNm del GAD67 tras la inyección intrahipocampal de vehículo en animales estresados. (C) Sección coronal que muestra la hibridación in situ de las células que expresan el ARNm de GAD67 tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. (D) Expresión del ARNm del GAD67 tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de animales estresados. (E) Fotografía en campo oscuro de la región CA1 después de la inyección de vehículo en animales no estresados. (F) Fotografía en campo oscuro que muestra la expresión del ARNm de GAD67 tras la inyección de vehículo en el hipocampo de animales estresados, mostrando un pequeño aumento de la señal de hibridación (como granos por célula). (G) Fotografía en campo oscuro de la región CA1 en un animal inyectado con LPS. (H) Fotografía en campo oscuro que muestra la expresión del ARNm de GAD67 tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de animales estresados, mostrando un aumento significativo de la señal de hibridación (como granos por célula). (I) Cuantificación del número de células que expresan GAD67. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos independientes, y representan células/mm3. (J) Cuantificación de la expresión celular del mensajero de GAD67 en la región CA1 del hipocampo. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos, expresados como porcentaje del control. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): a, comparado con el control, animales inyectados con vehículo; b, comparado con los animales inyectados con LPS, p< 0,05. Barras de escala: A, B, C y D: 1mm; E, F, G y H: 50 µm.
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Resultados
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Resultados
Figura 12. Efecto del LPS y el estrés en la histofluorescencia con Fluoro Jade B. Microfotografías que muestran la cantidad de células Fluoro Jade B positivas en la región CA1 del hipocampo. (A) Animales inyectados con vehículo. No detectamos ninguna célula alrededor del tracto de inyección. (B) Animales estresados e inyectados con vehículo. Se observa una pequeña banda de células positivas en la región CA1 en el punto de la inyección. (C) Animales inyectados con LPS. La tinción con Fluoro Jade B mostró una banda discreta de células positivas en la región CA1 tras la inyección de 2 µg de LPS, mientras que la región CA1 de animales estresados e inyectados con LPS estaba casi completamente llena de células positivas para Fluoro Jade B (D). Barra de escala: 100 µm.
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Resultados
6. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LA EXPRESIÓN DEL ARNm DE BDNF.
Para comprobar el efecto que tenían los distintos tratamientos en la expresión de factores de crecimiento se realizaron técnicas de hibridación
in situ
del ARNm de
BDNF. Los factores neurotróficos como el BDNF son péptidos de secreción que actúan como factores de crecimiento durante el desarrollo fenotípico y contribuyen al mantenimiento de las poblaciones neuronales específicas en el SNC, tanto en el estado adulto como durante el desarrollo. Estas proteínas pueden actuar a través de una vía de señalización retrógrada a partir de neuronas diana, o por mecanismos paracrinos o autocrinos, controlando así numerosos aspectos relacionados con la estructura neuronal y glial (Siegel y Chauchan, 2000). Existe un gran número de trabajos que estudian cambios en la expresión de BDNF mediante el uso de modelos de enfermedades. De hecho, varios autores han demostrado que las células microgliales pueden expresar factores neurotróficos tras diferentes tipos de daño (Elkabes y col., 1996; Miwa y col., 1997). En nuestro estudio, los animales inyectados con vehículo muestran poca cantidad de células que expresan el ARNm de BDNF alrededor del tracto de inyección. Estas células fueron tan escasas que sólo pudimos encontrar 1 ó 2 células positivas por sección (Fig. 13A, B y G). Resultados similares se encontraron cuando se inyectó vehículo en animales estresados (no mostrado) y LPS en animales no estresados (Fig. 13C, D y G). Sin embargo, la inyección de LPS en animales estresados incrementó el número de células que expresan BDNF en un factor de aproximadamente 5 (Fig. 13E, F y G; p< 0,01). Esta fuerte inducción pensamos que no es de neuronas sino de microglía,
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Resultados
ya que puede verse una correlación topográfica precisa entre la microglía y la inducción de BDNF (las células que expresan ARNm de BDNF aparecen justo cerca del sitio de inyección).
Figura 13. Efecto del estrés y el LPS en la expresión del ARNm de BDNF en el hipocampo. Las fotografías en campo oscuro fueron tomadas a partir de secciones emulsionadas. (A) Expresión de ARNm de BDNF tras la inyección de 2 µL de vehículo en el hipocampo de ratas no estresadas. No se observan células alrededor del sitio de inyección (flecha). (B) Alta magnificación en campo claro de la foto A. (C) Expresión del ARNm de BDNF tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. No se ven células alrededor del sitio de inyección. (D) Alta magnificación en campo claro de la foto C. (E) Expresión del ARNm de BDNF tras la inyección de 2 µg de LPS en el hipocampo de ratas estresadas. El número de células alrededor del sitio de inyección se incrementa (flecha). (F) Alta magnificación en campo claro de la foto E. (G) Cuantificación de la expresión del ARNm de BDNF. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos independientes, y representan células/sección. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehículo; b, comparado con los animales estresados e inyectados con vehículo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p< 0,01. Barras de escala: A, C y E, 100 µm; B, D y F, 50 µm.
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Resultados
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Resultados
7. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LOS NIVELES TOTALES Y FOSFORILADOS DE JNK, P38, ERK, AKT, CREB y GSK-3β.
En las células mamíferas se han identificado 3 grupos principales de MAPKs: kinasa de la región aminoterminal del factor de transcripción c-jun (JNK), kinasa regulada por señales extracelulares (ERK) y p38 MAPK. Akt, GSK-3β y el factor de transcripción CREB, se incluyen dentro de otros grupos. La activación de las MAPKs se determinó a través de
Western blot utilizando
anticuerpos específicos de las formas
fosforiladas y no fosforiladas de JNK, p38, ERK, Akt, GSK-3β y del CREB. Ni el estrés ni el LPS produjeron cambios significativos en las cantidades totales de estas proteínas (Fig. 14). Por el contrario, sí que se alteraron los niveles fosforilados de todas ellas. El estrés indujo un incremento en el P-JNK (desde 40% en animales controles hasta el 69% en animales estresados inyectados con vehículo, p<0,01; los valores en porcentaje son relativos a la cantidad total de las proteínas estudiadas en animales controles). La inyección de LPS también incrementó los niveles de P-JNK en animales no estresados (61%, p<0,01) y en animales estresados (95%, p<0,01) en comparación con los animales control, aunque en un grado diferente. Los niveles de P-p38 MAPK también se vieron alterados. Así, el estrés indujo un incremento en P-p38 (desde el 22% en controles al 45% en animales estresados inyectados con vehículo, p<0,01), mientras que el LPS inyectado en animales no estresados incrementó estos niveles hasta el 62% (p<0,01). De nuevo, el estrés reforzó este efecto en combinación con el LPS (81%; p<0,01). Los niveles de P-ERK también cambiaron tras la inyección de vehículo en animales estresados, incrementándose desde el 32% en los controles hasta el 64% en
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Resultados
animales estresados e inyectados con vehículo (p<0,01). El efecto fue similar en animales no estresados e inyectados con LPS (67% comparado con los controles, p<0,01), y se reforzó cuando se inyectó LPS en animales estresados (87% comparado con los controles, p<0,01). El término Akt se refiere por lo general al Akt1, uno de los tres miembros conocidos de la familia de genes del Akt (Brazil y Hemmings, 2001). Aunque estas tres proteínas Akt no se conocen muy bien, al menos parece que tienen algunas funciones no solapadas. En nuestro trabajo encontramos que los niveles de fosforilación de Akt cambiaron después de los diferentes tratamientos, disminuyendo del 71% en animales controles al 50% en animales estresados inyectados con vehículo (p<0,01). Esta disminución fue similar en animales no estresados e inyectados con LPS (47%, p<0,01) y se reforzó cuando se inyectó LPS en animales estresados (13% comparado con los animales control, p<0,05). La proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico (CREB) es un miembro de la familia de los factores de transcripción ATF-1 y está implicado en la regulación de muchos genes de citoquinas (revisado por Mayr y Montminy, 2001). Su fosforilación en la serina 133 (la cual puede tener lugar por muchas kinasas incluyéndose la Akt) se requiere para la actividad transcripcional de CREB (revisado por Lonze y Ginty, 2002). La fosforilación de CREB se estudió también a través de Western blot (Fig.
14). El P-CREB se redujo tras la inyección de vehículo en animales
estresados (desde 67% en animales controles al 24% en animales estresados e inyectados con vehículo, p<0,01) y de LPS en animales no estresados (26%, p<0.01). Este descenso fue mayor tras la inyección de LPS en animales estresados (11%, p<0,01) comparado con los valores controles.
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Resultados
Dentro de las dianas de Akt implicadas en el control de la supervivencia celular se incluye a la glucógeno sintasa kinasa GSK-3β (Cross y col., 1995). Se realizaron ensayos de
Western blot utilizando
anticuerpos contra las formas fosforiladas de GSK-
3β (tirosina 216). De este análisis observamos que el estrés indujo un aumento en los niveles fosforilados de GSK-3β (del 28% en los controles al 53% en los animales estresados e inyectados con vehículo, p<0,01); mientras que el LPS inyectado en los animales no estresados aumentó los niveles al 68% de los controles (p<0,01). De nuevo el estrés reforzó este efecto en combinación con el LPS (89%; p<0,01). En la figura 14 se muestran, además, los resultados obtenidos de las correlaciones intra animales que se realizaron entre las seis MAPKs, junto con los coeficientes de correlación correspondientes (todos los resultados fueron los esperados, por lo que sólo se muestran las interacciones de mayor interés). Puede observarse como las interacciones entre JNK/ERK, JNK/p38, p38/ERK y Akt/CREB son positivas, mientras que la interacción entre Akt/GSK-3β es negativa.
8. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LOS NIVELES DE TNF- α E IL-1β.
Teniendo en cuenta que el estrés incrementa el efecto del LPS, decidimos corroborarlo
a
nivel
molecular
determinando
los
niveles
de
las
citoquinas
proinflamatorias TNF-α e IL-1β. Los análisis por RT-PCR a tiempo real mostraron que los ARNm de estas citoquinas proinflamatorias se indujeron a las 6 horas tras el tratamiento con LPS. Los niveles de expresión del ARNm de la IL-1β en el hipocampo (Fig. 15A) no cambiaron en los animales estresados inyectados con vehículo (114%
130
Resultados
comparado con los controles), pero aumentaron en los animales no estresados e inyectados con LPS (379% comparado con los animales no estresados e inyectados con vehículo, p< 0,01). Cuando se inyectó LPS en
animales estresados, los niveles de
expresión de IL-1β alcanzaron el 720% de los animales controles no estresados e inyectados con vehículo (p<0,01). Los niveles de expresión del mensajero de TNF-α en el hipocampo (Fig. 15B) se afectaron también sólo por la inyección de LPS y por la combinación de LPS y estrés. De esta manera, el LPS en animales no estresados aumentó el nivel de expresión al 457% de los valores controles (p<0,01). Cuando el LPS se inyectó en animales estresados, los niveles de expresión de TNF-α alcanzaron el 1131% de los animales controles (p<0,01).
9. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRÉS EN LOS NIVELES DE iNOS y nNOS.
La expresión de enzimas tales como la nNOS o la iNOS se midió por Western blot
utilizando anticuerpos específicos (Fig. 16). Los niveles de nNOS e iNOS
aumentaron tras la inyección de vehículo en animales estresados (171% y 256% respectivamente, comparado con los controles, p<0,01). Un aumento de la expresión de iNOS se observó también en los animales no estresados e inyectados con LPS (287%, p< 0.01); en el caso de nNOS, el LPS solo no aumentó su expresión comparado con los animales estresados e inyectados con vehículo, pero sí comparado con los animales control (166%; p< 0,01). Sin embargo, la adición de estrés aumentó tanto los niveles de
131
Resultados
expresión de nNOS como de iNOS (266% y 363% respectivamente de los controles, p<0,01) (Fig. 16).
Figura 14. Efecto del estrés y el LPS en los niveles de expresión de varias proteínas kinasas y el factor de transcripción CREB en el hipocampo. Las proteínas del hipocampo de ratas sometidas a los distintos tratamientos (S: control, vehículo inyectado en el hipocampo de ratas no estresadas; SE: vehículo inyectado en el hipocampo de ratas estresadas; L: LPS inyectado en el hipocampo de animales no estresados; LE: LPS inyectado en el hipocampo de animales estresados) se separaron por electroforesis y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, para posteriormente teñirlas con anticuerpos anti-JNK, anti P-JNK, anti p38, anti P-p38, anti ERK, anti P-ERK, anti Akt, anti P-Akt, anti CREB, anti P-CREB, anti GSK-3β y anti P-GSK-3β. Se calcularon las densidades ópticas totales de cada banda. Los resultados se expresan en media ± DE de 5 experimentos independientes, y representan la intensidad de las bandas relativa al control. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehículo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehículo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01. También se representan las correlaciones intra animales entre las seis MAPKs, mostrándose sus coeficientes de correlación.
132
Resultados
133
Resultados
Figura 15. Efecto del estrés y el LPS en los niveles de expresión hipocampales de los ARNm de IL-1β y TNF-α. La expresión de los ARNm de IL-1β y TNF-α en el hipocampo de ratas sometidas a los distintos tratamientos se midió por RT-PCR a tiempo real. (A) Cuantificación de la expresión del ARNm de la IL-1β. El estrés no tuvo efecto, mientras que el LPS solo aumentó los niveles de expresión. La inducción del ARNm de la IL-1β fue mayor cuando el LPS y el estrés se combinaron. (B) Cuantificación de la expresión del ARNm de TNF-α. El estrés aumenta ligeramente el nivel de expresión del TNF-α. Esta inducción fue mayor y significativa en los animales no estresados e inyectados con LPS. De nuevo la combinación del LPS y el estrés aumentó este efecto de forma sinérgica. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehículo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehículo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01.
134
Resultados
135
Resultados
Figura 16. Efecto del estrés y el LPS en la expresión hipocampal de nNOS e iNOS. (A) Cuantificación de la expresión de nNOS. El estrés sólo y la inyección de LPS solo, aumentaron el nivel de fosforilación de nNOS de una manera similar. Sin embargo, la combinación de LPS y estrés produjo una mayor elevación de estos niveles. (B) Cuantificación de la expresión de iNOS. De nuevo, el estrés solo y el LPS solo aumentaron el nivel de fosforilación de iNOS, aunque en este caso de una manera diferente ya que el aumento fue mayor en el caso de los animales no estresados e inyectados con LPS. La combinación de ambos factores aumentó este efecto de una manera significativa. Significación estadística (ANOVA de una vía seguido de un test LSD para comparaciones múltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehículo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehículo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01.
136
Resultados
137
DISCUSIÓN
Discusión
Nuestro grupo, al igual que otros investigadores, ha demostrado la diferente susceptibilidad de las distintas estructuras del SNC al estímulo proinflamatorio inducido por una única inyección intraparenquimal de LPS (Herrera y col., 2000; Kim y col., 2000). Herrera y col. (2000) inyectaron 2 µg de LPS en la SN, el estriado, el haz prosencefálico medial y el rafe dorsal, y observaron que la SN era la estructura más sensible al estímulo inflamatorio en todos los parámetros estudiados. Además comprobaron que el daño era selectivo del sistema dopaminérgico, ya que ni el sistema GABAérgico ni el serotóninérgico se afectaban. De igual manera, Kim y col. (2000) observaron que la inyección de LPS en el hipocampo, la corteza o la SN de ratas adultas solamente producía neurodegeneración en el caso de la SN. El análisis de la cantidad de microglía en cada región reveló que la SN tenía la mayor densidad de microglía. En estudios
in vitro
se observaron que cuando cultivos mezclados de
neuronas y glía derivados del hipocampo, la corteza o el mesencéfalo se trataban con LPS, los cultivos mesencefálicos eran sensibles al LPS a concentraciones tan bajas como 10 ng/ml y respondían, de una manera dependiente de la dosis, con la producción de factores inflamatorios
y pérdida de neuronas dopaminérgicas. En cambio, los
cultivos hipocampales y corticales permanecieron insensibles al tratamiento con LPS a concentraciones tan altas como 10 observaciones
in vivo,
µg/ml
(Kim y col., 2000). De acuerdo con las
los cultivos mesencefálicos tenían entre 4 y 8 veces más
microglía que los cultivos de las otras regiones. Esta correlación positiva entre la cantidad de microglía y la sensibilidad a la neurotoxicidad inducida por el LPS también fue confirmada por la observación de que la suplementación con microglía enriquecida derivada del mesencéfalo o la corteza hizo que los cultivos corticales neurona-glía insensibles al LPS se volvieran sensibles a la neurotoxicidad inducida por éste (Kim y
138
Discusión
col., 2000). Este comportamiento diferente en función de la estructura se justifica, según Kim y col., por la elevada densidad de microglía que existe en la SN frente a las otras áreas cerebrales (Lawson y col., 1990; Kim y col., 2000), microglía que al activarse produce una serie de citoquinas, disminuye factores neurotróficos, secreta neurotoxinas como el NO y además libera RLOs. Sin embargo, otros autores no están de acuerdo con esta explicación, ya que en la SN coexisten distintos tipos de neuronas y, por lo tanto, la mayor densidad de microglía en la SN no sería suficiente para explicar la especial vulnerabilidad de las neuronas dopaminérgicas. Esta gran vulnerabilidad de las neuronas dopaminérgicas al estrés oxidativo puede ser también consecuencia de la reducción de la capacidad antioxidante, del alto contenido en hierro y/o de la DA de la SN (Jenner y Olanow, 1998). Existe un consenso general en cuanto a la acción tóxica de la DA, como generadora de metabolitos redox incluyendo la semiquinona, la quinona, los zwiteriones 5,6hidroxiindoles y, posiblemente, RLOs. Esta toxicidad de la DA, en teoría, también acelera la autooxidación de la DA liberada, lo que genera RLOs in vivo. El aumento de la autooxidación de la DA y de los RLOs podría iniciar una cascada de estrés oxidativo que llevarían al daño y a la pérdida de neuronas en la SN compacta en la EP. Uno de los últimos estudios realizados por nuestro grupo profundiza en la implicación de la DA en la vulnerabilidad del sistema dopaminérgico después de la inyección de LPS (de Pablos y col., 2005). En este estudio nuestro grupo mostró que el proceso inflamatorio degenerativo inducido por el LPS depende de la DA, ya que la inhibición de la tirosina hidroxilasa (TH) por la α-metilparatirosina (α-MPT) producía una
protección
considerable.
Además,
el
tratamiento
sistémico
con
L-
DOPA/benserazida, que conlleva a la producción de DA a pesar de la inhibición de la
139
Discusión
TH por α-MPT, revierte el efecto protector producido por esta droga. Por tanto, la implicación de la DA en este proceso podría explicar la especial susceptibilidad de las neuronas dopaminérgicas de la SN a la inflamación. Sin embargo, no justifica la diferencia encontrada entre estructuras, ya que la implicación de los procesos inflamatorios ha sido descrita como importante en otras enfermedades degenerativas y otras estructuras, como por ejemplo en la CPF y el hipocampo en la EA. Respecto a la diferencia en la densidad microglial como causa de las diferencias regionales a la susceptibilidad al estímulo inflamatorio, cabe decir que la densidad de células microgliales en la formación hipocampal no es muy diferente de la de la SN, por lo que parece evidente que otras características deben explicar las diferencias encontradas. En un estudio reciente, Ji y col. (2008) han estudiado las diferencias regionales en la inflamación cerebral inducidas por la inyección de LPS en la SN y en la corteza, concluyendo también que diferentes factores explican las diferencias regionales. Algunos de estos factores incluyen la infiltración excesiva de neutrófilos y factores del entorno tales como menor densidad astrocítica y mayor permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Como ya se ha mencionado, se ha demostrado que áreas del cerebro tales como el hipocampo no responden a la inyección intrahipocampal de LPS (Kim y col., 2000). En el presente estudio confirmamos estas observaciones y además demostramos que el estrés crónico hace a las neuronas hipocampales altamente sensibles al estímulo proinflamatorio inducido por una única inyección intrahipocampal de LPS. Este efecto combinado del estrés y la inflamación también se ha demostrado en la degeneración de las neuronas de la CPF, donde el estrés aumenta de forma sinérgica el daño inducido tras una inyección intracortical de LPS (de Pablos y col., 2006). Además, nuestro
140
Discusión
trabajo también proporciona evidencias de que el estrés crónico es un suceso clave para activar la microglía reactiva en el hipocampo cuando se combina con un estímulo proinflamatorio. Según esto parece evidente que deben existir otro tipo de factores que aumenten el efecto de la inflamación sobre las estructuras cerebrales que son relativamente resistentes a ésta, o que sensibilicen a las estructuras frente a la inflamación, y uno de estos factores podría ser el estrés. El modelo de estrés crónico variable aplicado en nuestro estudio fue validado demostrándose niveles aumentados de corticosterona y progesterona en sangre, ya que dichos niveles aumentan en situaciones de estrés. También fue validado mediante la medida del peso corporal. Los animales estresados no aumentaron de peso a lo largo del tiempo que duró el experimento, lo que también es un efecto típico del estrés (Gamaro y col., 2003).
1.
EFECTOS
DEL
INFLAMATORIAS
ESTRÉS
EN
INDUCIDAS
LAS POR
CARACTERÍSTICAS LA
INYECCIÓN
INTRAHIPOCAMPAL DE LPS.
En este estudio demostramos una importante respuesta neurodegenerativa en el hipocampo de animales estresados después de la inyección de LPS. Debemos subrayar la presencia de células en proceso de degeneración en la región CA1 de animales no estresados e inyectados con LPS, observada por histofluorescencia con Fluoro Jade B. Sin embargo, el análisis de las poblaciones neuronales por inmunohistoquímica de NeuN demostró que la inyección intrahipocampal de LPS solo no logra alterar la integridad de las poblaciones neuronales en el área CA1, confirmándose así que la
141
Discusión
inyección intrahipocampal de LPS induce un daño mínimo. Sin embargo, la inyección de LPS en animales estresados induce una pérdida de cerca del 50% de las neuronas NeuN positivas en la región CA1. Además, la tinción de Nissl muestra una pérdida restrictiva de neuronas piramidales CA1, claramente observable por el tamaño y la morfología típicos que tienen estas neuronas. Estos resultados sugieren un efecto sinérgico deletéreo del estrés crónico y la inflamación en la región CA1 piramidal. Las interneuronas inhibitorias, en cambio, no se vieron afectadas por la inyección de LPS como se demuestra por la hibridación
in situ
del ARNm de GAD67. De hecho, no se
vieron diferencias en la respuesta al LPS entre los grupos estresados y no estresados. Sin embargo, sí se encontró una sobreexpresión del mensajero de GAD67 en las neuronas alrededor del sitio de inyección de LPS en los animales estresados. Esta sobreexpresión ya se demostró en las neuronas GABAérgicas del hipocampo de la rata y en otras regiones del cerebro relevantes para el estrés tras la exposición a un estímulo estresante (Bowers y col., 1998). El análisis a largo plazo demuestra un aumento discreto en el número de microglía reactiva OX-6 positiva en respuesta a una única inyección intrahipocampal de 2 µg de LPS en los animales no estresados, que no fue estadísticamente diferente de los grupos inyectados con salino. Esta observación concuerda con la opinión de que el hipocampo es altamente resistente a los estímulos inflamatorios en condiciones normales. Tanaka y col. (2006) observaron que la inyección de LPS en la región CA1 del hipocampo de la rata durante 5 días consecutivos causaba activación de la microglía e inducía déficits en el aprendizaje y la memoria en los animales, pero el análisis histoquímico no presentaba muerte neuronal bajo estas condiciones experimentales. Sin embargo, nosotros hemos visto que en animales estresados, la inyección con LPS desencadena una fuerte activación de microglía en la formación hipocampal, 142
Discusión
demostrándose así el papel clave del estrés en este suceso. Nuestro estudio también revela una fuerte reacción astroglial en el grupo estresado e inyectado con LPS, con la proliferación e hipertrofia de astrocitos activados alrededor de la lesión, pero sin pérdida de astrocitos GFAP-positivos. La astrogliosis es una reacción esperada con el uso de inflamógenos. Los experimentos llevados a cabo por PCR a tiempo real muestran un aumento en los niveles de expresión de los ARNm de las citoquinas proinflamatorias IL-1β y TNF-α, 6 horas después del tratamiento con LPS. Así, el LPS por sí solo indujo una respuesta inflamatoria mínima, únicamente detectada a nivel molecular y poco después de la inyección. Estos datos concuerdan con estudios previos donde se demuestra que cuando se inyecta LPS en la región CA1 del hipocampo de la rata se produce el aumento de estas citoquinas microgliales durante la fase inicial del tratamiento (Tanaka y col., 2006). En estos estudios también se mostraba que las células que expresan IL1β, después del tratamiento con LPS, colocalizaban con las células microgliales pero no con las células astrogliales. En nuestro estudio encontramos que la inyección de LPS en animales estresados produce un aumento mayor en los niveles de expresión de IL-1β y TNF-α de una manera sinérgica. Para profundizar algo más en nuestro estudio, se midieron los mediadores proinflamatorios nNOS e iNOS, 24 horas después del daño. El estrés en sí mismo aumenta significativamente la expresión de la proteína nNOS de una manera similar a la observada en los animales inyectados con LPS. La expresión de iNOS aumenta en los animales estresados e inyectados con vehículo, pero este aumento es mayor en el grupo no estresado e inyectado con LPS. La producción de NO inducida por LPS es uno de los factores más importantes que afectan a la fisiología y patología del cerebro. De nuevo podemos observar como el estrés actúa sinérgicamente con el LPS para 143
Discusión
producir un aumento máximo de ambas enzimas, proporcionando así una nueva evidencia de que el estrés crónico juega un papel clave en la activación microglial en la formación hipocampal. Otro resultado interesante es el aumento inducido por el LPS en el número de células que expresan altos niveles del ARNm de BDNF alrededor del sitio de inyección, en animales estresados pero no en ratas control. El BDNF es un factor neurotrófico que pertenece a la familia de las neurotrofinas, un grupo de sustancias relacionadas con los fenómenos de supervivencia neuronal y de diferenciación en áreas específicas del SNC, así como en la regulación de la conectividad neuronal y la plasticidad sináptica. Se ha propuesto que los axones compiten durante el desarrollo por cantidades limitadas de factores neurotróficos; las neuronas que no fuesen capaces de obtener una cantidad suficiente de estos factores para cubrir sus necesidades, morirían mediante apoptosis (Thoenen y col., 1987; Connor y col., 1998). La expresión de BDNF cambia en respuesta a diferentes estímulos estresantes y depende de la estructura del cerebro estudiada (Pizarro y col., 2004; Tapia-Arancibia y col., 2004; Xu y col., 2004; Rosenbrock y col., 2005). En nuestro experimento, el aumento en el número de células que expresan el ARNm de BDNF podría ser un efecto sinérgico producido por la toxicidad del LPS y por el estrés, más que ser producido por el estrés directamente. Puesto que la expresión neuronal de BDNF en la formación hipocampal está restringida a las capas de células piramidales y granulares dentadas, es plausible sugerir el origen microglial de las células que expresan el ARNm de BDNF. Confirmando esto, se puede ver una correlación topográfica precisa entre la activación microglial y la inducción de BDNF (las células que expresan altos niveles del ARNm de BDNF aparecen justo cerca del sitio de inyección). La expresión del ARNm de BDNF en las células microgliales después del daño estriatal ya ha sido demostrado 144
Discusión
(Venero y col., 2002). Estudios previos han demostrado que la expresión de BDNF aumenta en respuesta a un daño (Plunkett y col., 1997; Wong y col., 1997; Liberatore y col., 1997) como resultado de la activación microglial y de los macrófagos (Batchelor y col., 1999). Esta expresión de BDNF microglial se ha asociado a mecanismos de reinervación (Wong y col., 1997; Batchelor y col., 1999). Consecuentemente, nuestro estudio sugiere que la expresión del ARNm de BDNF que se ve aumentada en respuesta al tratamiento combinado de estrés y LPS, podría ser una respuesta glial adaptativa para evitar la degeneración de las neuronas hipocampales. Para profundizar en los mecanismos de acción, nuestro grupo estudió los cambios en la fosforilación de diferentes MAPKs, considerando su papel en la neurodegeneración y en la activación microglial (Borsello y Forloni, 2007; Kumar y col., 2003; Subramaniam y Unsicker, 2006; Zhang y Dong, 2005). Las cascadas de estas proteínas son responsables de la transducción de las señales neurotróficas y se ven activadas tanto por los procesos inflamatorios como por el estrés y el BDNF (a través de su receptor TrkB). Pero algunas de estas MAPKs, como JNK, p38 y ERK, se sabe que están asociadas con la aparición de apoptosis y que juegan un papel importante en la patogénesis de la respuesta inflamatoria (Walton y col., 1998). En nuestro experimento, la respuesta de estas tres diferentes MAPKs fue bastante similar en las diferentes condiciones experimentales ensayadas. Así, el estrés y el tratamiento con LPS por sí solos, aumentan de una manera similar los niveles de fosforilación de cada una de ellas. Sin embargo, la combinación de LPS y estrés produce un aumento mayor que cuando actúa cada uno por sí solo. JNK y p38 juegan papeles importantes en la inducción de la apoptósis y, lo que es más importante, en la producción de las citoquinas inflamatorias (Kummer y col., 1997; Kyriakis y Avruch, 2001). Se ha demostrado que la activación sostenida de las 145
Discusión
MAPKs JNK y p38 está asociada con la activación secuencial de la caspasa 8 y la caspasa 3 y la muerte neuronal y/o la apoptosis en muchos tipos celulares (Borsello y Forloni, 2007; Subramaniam y Unsicker, 2006). Además, la fosforilación de JNK y su sustrato, c-jun, se ha relacionado con cambios neurodegenerativos, incluyendo la formación hipocampal (Herdegen y col., 1997; Minogue y col., 2003). El aumento en la actividad de p38 también se ha mostrado como una señal de apoptosis en varios tejidos, incluyendo el hipocampo (Ozawa y col., 1999; Takagi y col., 2000). Estos efectos sirven de fundamento para los procesos degenerativos encontrados en la formación hipocampal en animales estresados, en respuesta al LPS. Sin embargo, debemos hacer resaltar la relación íntima entre la activación de JNK y p38 y la inflamación. Así, la activación de JNK induce la expresión de proteasas y citoquinas específicas (Karin y Gallargher, 2005). Alternativamente, los inhibidores de p38 inhiben la producción de TNF-α e IL-1β (Kumar y col., 1997) además de la expresión de otros mediadores/proteínas inflamatorias, entre los que se incluyen la iNOS (Ajizian y col., 1999), la COX-2 (Subbaramaiah y col., 1998), la IL-6 (Krause y col., 1998) y la IL-8 (Krause y col., 1998). En el cerebro, ERK está también implicado en las respuestas celulares a los estímulos estresantes, incluyendo el estrés oxidativo y la estimulación del receptor de glutamato (Aikawa y col., 1997) y se sabe que igualmente está implicado en la producción de NO, la expresión de iNOS y en la secreción de TNF-α estimuladas por LPS. Consecuentemente, la activación de JNK, p38 y ERK por el estrés, combinado con el tratamiento con LPS, apoya la opinión de que ambas condiciones actúan recíprocamente para desencadenar un ambiente inflamatorio, principalmente relacionado con la activación microglial. Esta opinión también se corrobora por el análisis de las correlaciones intra animales que demuestra la existencia de correlaciones significativas entre JNK/ERK, JNK/p38 y p38/ERK. 146
Discusión
Para demostrar que la supervivencia celular está comprometida cuando se combina el estrés crónico con el LPS, se analizó la activación de Akt y CREB. La vía de señalización de Akt se conoce como una de las vías más críticas en la regulación de la supervivencia celular. La activación de la vía de Akt facilita a las células una señal de supervivencia para resistir a los estímulos apoptóticos (Yao y Cooper, 1995). El factor de transcripción CREB es capaz de ser fosforilado por Akt, mediando así la expresión de algunos genes antiapoptóticos inducida por Akt (Wang y col., 1999). En los animales estresados e inyectados con LPS se ve una fuerte disminución en los niveles fosforilados de Akt y CREB, lo que confirma el consecuente estado deletéreo en el sistema hipocampal bajo estas condiciones. El análisis de la correlación intra animal entre Akt y CREB demuestra una interacción positiva entre ellos. La misma interacción, pero negativa, se observó entre Akt y su diana GSK-3β (Akt favorece la fosforilación de GSK-3β en la Ser-9, lo que lleva a su inactivación), una kinasa que es abundante en el cerebro y que está ampliamente distribuida en las neuronas
in vivo
(Cross y col., 1995). El interés en esta kinasa es máximo ya que GSK-3β también se ha implicado directamente en la regulación de apoptosis. Además, GSK-3β activado lleva a una hiperfosforilación de tau (Johnson y Bailey, 2002), lo que le otorga a esta kinasa un papel en la patología del Alzheimer (Balaraman y col., 2006). En nuestras condiciones experimentales, el LPS induce de forma significativa la forma activa de GSK-3β en animales no estresados, siendo este aumento significativamente mayor en las ratas estresadas. La forma fosforilada de GSK-3β que hemos determinado en este estudio es la forma activa, la cual tiene la fosforilación en la tirosina 216. Según esto, en este caso su fosforilación no parece ser inducida por Akt, ya que, según Cross y col. (1995), Akt induce la fosforilación de GSK-3β en la serina 9, dando lugar a su forma
147
Discusión
inactiva. Esto está de acuerdo con el resultado del análisis de correlación intra animal entre Akt/GSK-3β, el cual dió una interacción negativa entre ambos. En resumen, la combinación del estrés crónico y el LPS desencadenan mecanismos que llevan a la activación de las MAPKs y a la activación microglial, factores que contribuyen significativamente al deterioro de los sistemas neuronales (Hirsch y col., 2003; Miloso y col., 2008).
2.
EFECTOS
DEL
ESTRÉS
Y
ACCIÓN
DE
LOS
GLUCOCORTICOIDES SOBRE EL CEREBRO.
El estrés es capaz de incrementar los daños neuronales en determinadas condiciones; una exposición previa al estrés social incrementa el volumen infartado y exacerba los déficits cognitivos asociados a la isquemia cerebral transitoria (Sugo y col., 2002; Craft y col., 2005). El mecanismo responsable de los efectos del estrés en los accidentes cerebro-vasculares parece estar relacionado con la corticosterona a través de sus receptores de GCs para incrementar la subsiguiente muerte neuronal inducida por isquemia (Sugo y col., 2002; Craft y col., 2005). Las consecuencias dañinas de la exposición prolongada a un exceso de GCs se han descrito extensamente en el hipocampo, de manera que después de un tratamiento con corticosterona se ha demostrado atrofia de las dendritas y pérdida neuronal (Sapolsky, 1985; Wolley y col., 1990). También se ha demostrado que en presencia de GCs las neuronas hipocampales llegan a ser más vulnerables a diferentes daños entre los que se incluyen la isquemia (Sapolsky y Pulsinelly, 1985) y la hipoglucemia (Tombaugh y Sapolsky, 1992; Tombaugh y col., 1992), así como a la exposición a
148
Discusión
antimetabolitos (Packan y Sapolsky, 1990) y a varias neurotoxinas (Hortnagl y col., 1993; Stein y Sapolsky, 1988). De acuerdo con esto también se ha visto que la liberación inducida por estrés de compuestos que incluyen catecolaminas, péptidos y corticosteroides, ejerce una influencia excitatoria en sus células diana, particularmente en la formación hipocampal, la amígdala, la CPF y el septum lateral (Morilak y col., 2005; Joels y col., 2008). Los receptores NMDA están altamente concentrados en el hipocampo y, de manera fisiológica, intervienen en los mecanismos de concentración y memoria. Dentro del hipocampo, la corticosterona induce la liberación de vesículas que contienen glutamato en proyección aferente al área CA1 (Karst y col., 2005). Sin embargo, los altos niveles de glutamato (por exceso de GCs originado por el estrés) podrían causar una sobreestimulación de entrada de calcio a través de los receptores NMDA y la pérdida de neuronas NMDA-receptivas debido a la excitotoxicidad (Choi y Rothman, 1990; Bal-Price y Brown, 2001). Sobre las propias neuronas y células de microglía, el cortisol actúa inhibiendo moderadamente el transporte de glucosa, de tal manera que ese ligero descenso compromete la supervivencia celular durante los episodios isquémicos y podría incrementar la vulnerabilidad neuronal al daño a través de la disminución de la capacidad energética (Sapolsky, 1986). Además, el exceso de GCs origina un descenso en la actividad de los antioxidantes, bloquea la actividad de las proteínas neuroprotectoras y limita la disponibilidad de NADPH para responder en los fenómenos de isquemia. Todos estos efectos son ocasionados por el estrés a través de los GCs. La cuestión es cómo los cambios inducidos por el estrés en el hipocampo hacen a esta área del cerebro más susceptible al daño en respuesta a la inflamación. Una observación clave en nuestro estudio es la fuerte respuesta de las células microgliales al estímulo 149
Discusión
del estrés. En este sentido, los receptores de corticosteroides no son exclusivos de las neuronas, sino que también se expresan en las células microgliales (Tanaka y col., 1997). Inicialmente se creyó que el estrés suprime las respuestas inmunes incluyendo la inhibición de la microglia debido, en parte, a los efectos de los GCs circulantes (examinado en Biondi y Zannino, 1997). Sin embargo, hay evidencias que sugieren que el estrés y los GCs en realidad aumentan la activación microglial (Minami y col., 1991; Nguyen y col., 1998; Niino y col., 2000). Nuestros datos apoyan claramente este hecho, al menos en la formación hipocampal, que es particularmente resistente al estímulo proinflamatorio. Como se ha comentado anteriormente, se consideran diversos factores para explicar estas diferencias regionales. Nuestro estudio sugiere que la presencia de altas densidades de RM y RG debe ser un factor adicional para explicar las diferencias regionales asociadas a la degeneración relacionada con la inflamación.
3. PREVENCIÓN DEL DAÑO PRODUCIDO POR EL ESTRÉS.
Todos estos resultados nos permiten sugerir que el estrés crónico induce una situación especial que conduce al incremento del daño y a la pérdida de neuronas. Sin embargo, el daño producido por el estrés se puede prevenir con antagonistas específicos de los GCs. De acuerdo con esto se ha visto que la inhibición del aumento de los niveles de GCs durante la isquemia preserva la supervivencia celular después de la isquemia (Krugers y col., 1995, 1998, 1999; Smith-Swintoski y col., 1996). Para demostrar de forma indudable que los GCs circulantes son responsables de los efectos deletéreos vistos en nuestro estudio, introdujimos un nuevo grupo de animales estresados que además fueron tratados con RU486 (mifepristona), un potente
150
Discusión
esteroide sintético inhibidor de la activación de los RG y antagonista también del receptor de la progesterona, por lo que presenta efectos antiglucocorticoides y antiprogestágenos (Herrmann y col., 1982; Gaillard y col., 1984). El bloqueo de los RG con RU486 también previene la pérdida de las neuronas de la región CA1 en las 24 horas después de un daño por constricción crónica de nervios (McCullers y col., 2002). Se sabe también que RU486 revierte la vulnerabilidad frente al glutamato mediada por GCs en cultivos de líneas celulares de hipocampo de rata (Behl y col., 1997a). En nuestro estudio el tratamiento con RU486 protege significativamente a los animales contra los efectos deletéreos observados en los animales estresados e inyectados con LPS, reduciendo la activación de la microglía, la astrogliosis y la pérdida de neuronas NeuN positivas. Esto demuestra que los GCs juegan un papel crítico en la activación de la microglía en respuesta al LPS, llegando a inducir muerte celular de las neuronas piramidales de CA1. Estos efectos antiglucocorticoides además podrían prevenir la excesiva acumulación intracelular de calcio en las neuronas (Elliot y Sapolsky, 1993; McCullers y col., 2002), puesto que la activación concreta de los RG aumenta el influjo de calcio. El efecto protector de RU486 podría ser debido también a sus efectos antiglucocorticoides combinado con sus propiedades antioxidantes, ya que según Behl y col. (1997b) previene de la acumulación intracelular de peróxido y de la muerte celular inducidos por la proteína β amiloide, el peróxido de hidrógeno, el glutamato y neurotoxinas que se han implicado en ciertas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EA. Estudios previos han mostrado que RU486 previene la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (Parthasarathy y col., 1994) e inhibe la modificación oxidativa de proteínas por peróxidos lipídicos preexistentes en sistemas libres de
151
Discusión
células (Carpenter y col., 1996). Además, Behl y col. (1997b) demostraron los efectos antioxidantes neuroprotectores de RU486 en cultivos celulares y cortes organotópicos.
4. POSIBLES EXPLICACIONES AL EFECTO SINÉRGICO DEL ESTRÉS Y LA INFLAMACIÓN EN LOS DAÑOS PRODUCIDOS EN EL HIPOCAMPO.
Los resultados obtenidos en nuestro experimento sugieren que el daño neuronal en el hipocampo podría ser debido al efecto sinérgico entre el estrés crónico y la inflamación. Este daño podría deberse al incremento de la activación de la microglía (con el consecuente aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias y neurotoxinas como el NO, y en la liberación de RLOs, por parte de la microglia), a la activación de las MAPKs y al aumento de los niveles de glutamato extracelular, producidos cuando se combinan neuroinflamación y estrés. Todos estos datos sugieren que la inflamación, junto con el estrés crónico, induce una situación especial que lleva a un daño aumentado y a la pérdida de neuronas. Estudios recientes han descrito la implicación de los RLOs en los efectos degenerativos inducidos por la inyección intranigral de LPS (Tomás-Camardiel y col., 2004). Además, se sabe que el estrés induce la formación de RLOs (McIntosh y Sapolsky, 1996). McIntosh y Sapolsky observaron como los niveles fisiológicos de GCs en cultivos neuronales exacerbaron la toxicidad de compuestos generadores de RLOs y, por tanto, la generación de RLOs. La hipótesis que propusieron es que los GCs deben exacerbar la toxicidad de neurotoxinas cuyos mecanismos de acción solapan con las vías de los GCs. Esta formación de RLOs acaba generando un daño oxidativo en varios
152
Discusión
tejidos, incluyendo la sangre (Oishi y col., 1999) y el cerebro, concretamente en los lípidos, proteínas y ADN (Liu y col., 1996). La activación de las cascadas de las MAPKs puede dar lugar a la inducción de apoptosis y la producción de citoquinas inflamatorias, como ya se ha mencionado anteriormente. En nuestro estudio, el descenso en los niveles fosforilados de Akt y CREB y el aumento en los niveles fosforilados de JNK, p38, ERK y GSK-3β, confirman completamente el estado deletéreo producido por el LPS y el estrés en el hipocampo. La sobreexcitación de los receptores de glutamato debido a la inflamación producida tras la inyección de LPS, parece contribuir a la neurodegeneración en estadios tempranos (Glezer y col., 2003) por excitotoxicidad tras el aumento de la entrada de calcio al interior de la célula. Además, esta excitación se ve aumentada con el estrés. En resumen, todos estos resultados sugieren una relación sinérgica entre el proceso inflamatorio y el incremento de la actividad basal del eje HPA.
5.
POSIBLE
RELACIÓN
ENTRE
EL
ESTRÉS
Y
LA
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.
Estas observaciones podrían tener importantes consecuencias clínicas para los pacientes que sufren de EA, ya que la CPF y el hipocampo son las áreas del cerebro más afectadas en esta enfermedad. De acuerdo con esto, en los estadios tempranos en la EA se encuentra microglía activada en el hipocampo (Cagnin y col., 2001), estructura que muestra el mayor grado de cambios neuropatológicos y de neurodegeneración
153
Discusión
(Griffin y col., 1998). Cagnin y col. (2001) encontraron una distribución de microglía activada en el cerebro de pacientes con EA en estadíos tempranos que no se ve en cerebros de individuos ancianos sanos, por lo que ambos cerebros tienen un patrón distinto a pesar de que comparten algunas de las características patológicas. Por otro lado, estudios de imágenes PET de activación microglial en la EA encuentran una mayor activación en regiones del cerebro que más tarde desarrollan atrofia (Cagnin y col., 2001). Estos datos confirman el hecho de que, al igual que en otras enfermedades neurodegenerativas como la EP, el proceso patológico puede permanecer subclínico y sin reconocerse durante varios años antes de que se alcance el umbral para la manifestación clínica (Cagnin y col., 2001). La evidencia convincente que apoya la hipótesis neuroinflamatoria en la EA deriva de la extensa investigación sobre la relación entre los AINEs y el desarrollo de la enfermedad. Esta hipótesis sugiere que el empeoramiento funcional y el daño del SNC en la EA es causado por una mayor inflamación del SNC debido a una activación de la microglía en el cerebro (Rosenberg, 2005). Hay numerosos estudios epidemiológicos que indican que las personas que toma agentes atiinflamatorios o que sufren de condiciones tales como la artritis, para las cuales el uso de estos agentes es rutinario, tienen un riesgo considerablemente reducido de desarrollar EA. Sin embargo, estudios epidemiológicos en personas que sufren de EA, no dan tan buenos resultados. Por esto Rosenberg destaca la importancia de profundizar en los procesos antiinflamatorios y en su detección precoz para desarrollar nuevas terapias antiinflamatorias eficaces desde estadíos tempranos de la enfermedad. Pacientes con EA también muestran una actividad basal aumentada del eje HPA, incluyendo un aumento en las concentraciones basales de cortisol en plasma (Belanoff y col., 2001) junto con un mayor índice de fracaso de adaptación al estrés 154
Discusión
crónico (Pascualy y col., 2000). Debido a que el estrés crónico está asociado con un aumento en la función de los corticosteroides, es plausible la hipótesis de que el estrés crónico debe conferir mayor susceptibilidad al daño neuronal en pacientes que sufren EA. De acuerdo con esto, nuestro estudio proporciona pruebas que refuerzan el hecho de que el estrés crónico debe constituir un factor de riesgo para exacerbar el curso natural de la enfermedad. El hipocampo podría ser menos sensible a la inflamación que al estrés; sin embargo, un efecto cooperativo entre estos dos procesos podría explicar la relación sugerida entre estrés y EA. Así, Wilson y col. (2005) observaron que una alta susceptibilidad al sufrimiento, a la angustia, lleva a un riesgo aumentado de desarrollar esta enfermedad, de manera que las personas propensas al sufrimiento tenían 2.4 veces más probabilidad de desarrollar EA que las personas no propensas. Nuestros resultados también apuntan la posibilidad de usar RU486 como un tratamiento coadyuvante en la EA ya que esta droga tiene propiedades neuroprotectoras y antioxidantes intrínsecas que también podrían ofrecer beneficios adicionales. Considerando esto, diferentes autores han propuesto el uso de RU486 como un tratamiento que atrasa la progresión del deterioro cognitivo en esta enfermedad (Belanoff y col., 2002; DeBattista y Belanoff, 2005).
155
CONCLUSIONES
Conclusiones
1. Hemos comprobado que nuestras condiciones experimentales de estrés crónico variable son efectivas, habiendo producido la alteración del peso corporal de los animales tratados y el aumento de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. 2. El estrés induce la activación de la microglía en respuesta al LPS, siendo esencial para que se produzca respuesta inflamatoria en el hipocampo. 3. El estrés aumenta de forma considerable el efecto del LPS sobre la población astroglial, produciendo una fuerte astrogliosis pero no pérdida de astrocitos. 4. El estrés y la inyección de LPS producen de manera sinérgica la degeneración y la pérdida significativa de células piramidales hipocampales, mientras que no producen pérdida de neuronas GABAérgicas. 5. La expresión del ARNm de BDNF en el sitio de inyección solo se produce cuando se combinan estrés y LPS. 6. El estrés, el LPS y la combinación de ambos producen un aumento de los niveles de fosforilación de las MAPKs JNK, p38, ERK y GSK-3β. En cambio, los niveles de fosforilación de Akt y del factor de transcripción CREB disminuyen. Todos estos cambios son promotores de la apoptosis. 7. El estrés aumenta los niveles de TNF-α e IL-1β inducidos por la inyección de LPS en el hipocampo. 8. La adición de estrés a la inyección de LPS aumentó de forma significativa los niveles de mediadores de la inflamación tales como iNOS y nNOS. 9. Nuestros resultados parecen indicar que el estrés puede ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas que tengan como base la pérdida de neuronas del hipocampo, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer. Los efectos dañinos del estrés deben ser tomados en 156
Conclusiones
cuenta en aquellos individuos en los que se puedan dar efectos inflamatorios debidos a la acumulación de proteínas modificadas durante el envejecimiento o por otras causas. 10. El tratamiento con RU486, un potente inhibidor del receptor de glucocorticoides, disminuye los efectos producidos por la combinación de estrés crónico variable y LPS en el hipocampo en todos los parámetros estudiados. Esto nos permite sugerir la posible utilidad de la inclusión de tratamientos contra el estrés basados en el bloqueo de los receptores de glucocorticoides dentro de las terapias que se aplican en la actualidad en la enfermedad de Alzheimer.
157
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