17/09/2014
ENZYMOLOGIE Pr Layachi CHABRAOUI
Cours1ère Année Pharmacie Rabat 2014-2015
ENZYMOLOGIE? L'enzymologie est l’étude biochimique des enzymes. Elle consiste à étudier les propriétés structurales et fonctionnelles des enzymes. Elle s’intéresse aussi à décrire la vitesse des réactions catalysées par les enzymes et les facteurs qui l’influence.
Introduction Les organismes vivants sont le siège d'une multitude de réactions biochimiques. Ces réactions concernent la biosynthèse ou le catabolisme d’un grand nombre de molécules biologiques. Elles constituent le métabolisme qui s'effectue dans des conditions physiologiques (pH:7, température :37oC) grâce à la présence des enzymes
Les enzymes ont donc un rôle vital
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Les chapitres du cours
● Structure et propriétés des enzymes ● Cinétique enzymatique ● Mécanisme de la réaction enzymatique
Chapitre 1 Structure des enzymes Objectifs: Distinguer les différents groupes d’enzymes Décrire la structure des enzymes Expliquer le mode d’action des enzymes et des coenzymes Distinguer les différents types de facteurs qui influencent la cinétique enzymatique
1- Définitions 1.1- Les enzymes Protéines spécialisées dans la catalyse de réactions.
⇒Catalyseurs biologiques très puissants Elles augmentent la vitesse des réactions chimiques, sans en modifier l’équilibre. A + B
C +D
Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est déterminée génétiquement. Chaque enzyme est le produit d’expression d’un gène (parfois 2 gènes)
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1.2- Un substrat (S):est la molécule qui est transformée sous l’action de l’activité de l’enzyme 1.3- Un produit (P): est la molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par l’enzyme Site actif
P
S S Enzyme
Enzyme
Enzyme
ES
S + E
P + E produit
substrat
1.4- Le site actif : la partie de l’enzyme qui fixe le substrat et le transforme.
2- Historique 1730: La digestion est un phénomène plus chimique que mécanique 1850: Pasteur démontra que la fermentation du sucre en alcool par la levure est catalysée par une substance qui existe dans la levure
En zyme dans
levure
1897:
Buchner a extrait de la levure les premières enzymes
1929:
La 1ère enzyme purifiée et cristallisée est l’uréase Urée
Uréase
CO2 + 2NH3 + de 3000 E <<< nombre d’enzymes effectivement présentes
3- PROPRIETÉS ET CARACTÉRISTIQUES DES ENZYMES 3.1- Agissent en très faible quantité: une molécule de catalase peut hydrolyser 5 millions de molécules d’H2O2 en une min dans des conditions de pH et de température physiologiques 3.2- Ne sont pas consommées au cours de la réaction: comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent intactes à la fin de la réaction 3.3- Sont spécifiques: Une enzyme transforme un S donné (spécificité de substrat) grâce à une réaction donnée (spécificité de réaction)
3
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Spécificité liée à la réaction : Spécificité étroite Exemples: AA = substrat de 3 types d’enzymes (3 réactions)
décarboxylation R
CH
COOH
NH2
oxydase
oxydation désamination
AA
Spécificité vis à vis du substrat: Spécificité étroite Certaines E peuvent distinguer entre la forme D et L ou entre la forme α et β = stéréospécificité Spécificité large Phosphatase R+ P R-P alcaline Autres exemples: HK et GK
3.4- Mode d’action des enzymes S
P
énergie état de transition sans catalyseur catalyseur Energie d’activation enzyme état initial état final déroulement de la réaction
Les enzymes abaissent l’énergie d’activation
Illustration: H2O2
½ O2 + H2O
Sans catalyseur : 18 kcal/mole d’H2O2 Catalyseur chimique (le platine) : 11,7 kcal/mole d’H2O2 Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole d’H2O2 Les enzymes abaissent l’énergie d’activation Elles ne modifient pas l’équilibre Elles augmentent la vitesse de réaction 3.5- Les enzymes sont régulables L’activité catalytique de nombreuses enzymes varie en réponse à des signaux métaboliques (inhibiteurs, activateurs)
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4- Structure des enzymes: 2 types ex: Chymotrypsine
- Enzymes entièrement protéiques = holoenzyme totalité
cofacteur
- Enzymes formées de deux parties
apoenzyme
Une partie protéique: apoenzyme Une partie non protéique: cofacteur
- ion métallique - coenzyme, groupement prosthétique
Apoenzyme: intervient dans la spécificité, thermolabile Cofacteur: effectue la réaction chimique, thermostable
4.1- Les enzymes holoprotéiques: Les enzymes sont des protéines globulaires. Elles peuvent être formées: - d’une seule chaîne polypeptidique ex: le lysozyme 130 acides aminés
- de plusieurs chaînes identiques ou différentes Exemples: Isoenzymes enzymes allostériques
4.1.1- Le site actif - Définition: = enzymatique: acides aminés qui entrent en contact avec le S 4-1 La protéine site actif
- le site de fixation qui se combine au substrat - le site catalytique qui agit sur le substrat pour lui faire subir la réaction chimique.
- Constitution: sérine, cystéine, histidine, tyrosine
S
- Mise en évidence des AA du site actif: a- Utilisation des composés qui se fixent spécifiquement à un AA Diisopropylfluorophosphate (DFP): Sérine Parachloromercuribenzoate: Cystéine Dérivés arsenicaux: Cystéine b- Méthodes de génie génétique
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4.1.2- Relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique Exemple: : la trypsine: enzyme pancréatique
Zymogène Trypsinogène Nt Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
His His
49
S
29
(inactif)
Ser S
183 S
S
entérokinase : E intestinale Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
+
Trypsine
Site actif His His 29 49
(active)
S
Ser
183
S
S S
Le départ de l’hexapeptide, fortement chargé (-) par les 4 Asp, modifie la conformation de la protéine, en favorisant la formation d’hélice α.
4.1.3- forme du site actif 1890: Fischer a proposé que la forme du substrat est complémentaire de la forme du site actif de l’enzyme = modèle de la clé et de la serrure
1958: Koshland a proposé que l’enzyme et le substrat adaptent mutuellement leurs formes respectives Une molécule d’enzyme n’est pas rigide mais flexible = modèle de l’ajustement induit (comme la main et le gant)
4-2 Enzymes hétéroprotéiques: à Cofacteurs - de nature inorganique: les ions métalliques, - de nature organique: les
coenzymes
Lorsque le coenzyme se lie à la protéine enzymatique par une liaison covalente, on parle de groupement prosthétique Lorsque la liaison est faible on parle de
cofacteur
cosubstrat apoenzyme
4-2-1 Ions métalliques Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+… Exemples: Fer: les cytochromes Zn2+ dans l’alcool déshydogénase forme un pont entre l’enzyme et son substrat
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4-2-2 Coenzyme Molécule indispensable à la réaction enzymatique. La réaction se produit avec le coenzyme et non avec la protéine (coenzyme = site catalytique) L’apoenzyme intervient dans la spécificité (site de fixation) Mode d’action des coenzymes
Exemple:
A-X + Co
A + Co-X
Co-X + B A-X + B
A + B-X
B-X + Co déshydrogénase
AH2 + FAD
hydrogénase
FADH2 + B
A + FADH2 BH2 + FAD
Le coenzyme n’est pas spécifique: plusieurs enzymes différentes peuvent avoir le même coenzyme certaines enzymes ont besoin d’un ion métallique et d’un groupement prosthétique: cas des cytochromes: noyau porphyrique + Fe2+
5- NOMENCLATURE ET CLASSIFICATION DES ENZYMES Avant 1961 : les enzymes ont été dénommées selon le nom du S sur lequel elles agissent en ajoutant le suffixe "ase“ ou le nom de la réaction Exemples:
Substrat
Enzyme
amidon urée
amylase uréase
E1 Décarboxylase Acide aminé
E2 Aminotransférase E3 Oxydase
1961: l’union internationale de biochimie (UIB) : nouvelle classification des enzymes selon le type de la réaction catalysée
6 classes d’enzymes On a attribué à chaque enzyme un numéro: EC-a-b-c-d (EC = Enzyme Commission)
5.1- Les oxydoréductases(EC-1- avec 23 sous groupes) nécessitent un coenzyme (NAD, NADP, FAD ou FMN)
Aox + Bred • Hydroxylases:
Ared + Box
(=monooxygénases)
-CH3 -CH2-
catalysent la fixation d’un atome d’oxygène(EC 1-13-)
-CH2OH -CHOH-
• Déshydrogénases: lactate déshydrogénase (EC 1-6-) CH3- CHOH-COOH + NAD+ ac. lactique
CH3-CO-COOH ac. pyruvique
+ NADH + H+
• Cytochromes: ont un coenzyme héminique avec un ion, qui présente 2 états d’oxydation, ce qui en fait un transporteur d’électrons. Fe2+ Fe3+ + 1eréduit oxydé
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5.2- Les transférases catalysent le transfert de groupement autre que l’hydrogène entre deux substrats (EC-2-) nécessitent un coenzyme
E
A-X + B
A + B-X
• les transaminases: transfèrent les radicaux aminés -NH2 d’un AA à un acide cétonique accepteur. Le coenzyme est le (EC-2-6-) phosphate de pyridoxal. • les phosphokinases ou kinases: transfèrent un P sur une molécule (EC-2-7-) d’ADP. L’ion Mg++ est indispensable. ATP + glucose • Les transacétylases:
ADP + glucose 6P
transfèrent les radicaux acétyles(-CH2COOH), le coenzyme est CoA
• Les transméthylases:
transfèrent les radicaux méhyles (-CH3), d’une molécule à une autre, le coenzyme est l’acide tetrahydrofolique.
5.3- Les hydrolases (EC-3- avec 13 sous groupes) Catalysent la rupture d’une liaison avec fixation des éléments d’une molécule d’eau. A-B + H2O
A-H +
B-OH
• Les estérases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool
(EC-3-1-) RCOO-CH2-R’ + H2O
RCOOH + R’CH2OH
• Les lipases : hydrolysent les glycérides en glycérol et en acides gras • Les osidases: hydrolysent les osides glucosidase, galactosidase • Les enzymes protéolytiques: hydrolysent les liaisons peptidiques R-CO-NH-R’ + H2O
RCOOH + NH2-R’
5.4- Les lyases (EC-4- avec 7 sous groupes) catalysent la rupture des liaisons C-C, C-N, C-O, C-S - décarboxylase d’acide cétonique: le coenzyme est la thiamine pyrophosphate (TPP) R-CO-COOH
- décarboxylase d’acides aminés:
R
CH
COOH
R-CHO + CO2
le coenzyme est le phosphate de pyridoxal
R-CH2-NH2 + CO2
NH2
Cas de la pyruvate déshydrogénase: 5 coenzymes TPP, NAD+, FAD, Coenzyme A et Lipoate
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5.5- Les isomérases (EC-5- avec 6 sous groupes) catalysent le déplacement de groupes à l’intérieur d’une molécule sans que la formule brute varie Epimérases:
provoquent des interconversions d’oses galactose
Mutases:
glucose
catalysent le transfert d’un radical d’une partie d’une molécule à une autre H
CH3
CH2
C
CH2
COOH
CO
CO
CoA
CoA
Methyl malonyl CoA
COOH
Succinyl CoA
5.6- Les ligases (EC-6- avec 6 sous groupes) catalysent la condensation de 2 molécules. A+B
A-B ATP
AMP + P-O-P
6- PRINCIPAUX COENZYMES Origine des coenzymes (ATP, S adénosyl méthionine)
1- métabolisme 2- Vitamine
(= amine vitale)
Un certain nombre de coenzymes dérivent de vitamines, notamment de vitamines hyrosolubles et en particulier les vitamines du groupe B
- Coenzymes intervenant dans les réactions d’oxydoréduction (4 coenzymes) - Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement (6 coenzymes)
6.1- Coenzymes intervenant dans les réactions d’oxydoréduction
6.1.1-Coenzymes nicotiniques = Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et NADP+ NAD+
● Structure
CO- NH2
nucléotide
O HO
P
O
O H H
H H OH
OH
O
NH2 N
nucléotide
N HO
P O
Nicotinamide (Vit B3ou Vit PP)
N+
O
N
Adénine N
O H H
OH
H H OH
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centre actif CO- NH2 O HO
P
N+ O
O H H
H H OH
OH
O N
N
N HO
P O
NAD+
NH2
NADP+ O
N
O H
H
H
OH
O
HO
P
H
OH
O
● Mécanisme réactionnel AH2 + Substrat réduit
NAD+ (ou NADP+)
A + NADH + H+ (ou NADPH) Substrat oxydé H
H
AH2 +
CO- NH2
+
+ H+
N
N+
B
H
CO- NH2
NADH + H+ (ou NADPH)
BH2 + NAD+ + (ou NADP )
Substrat oxydé
Substrat réduit
Ce sont des coenzymes de type Cosubstrats
● Spectre d’absorption Mesure de la densité optique en fonction de λ NAD+ (forme oxydée)
DO
NADH (forme réduite)
260
350
Longueur d’onde (nm)
dosage des enzymes à NAD+ ou à NADP+ Exemple: LDH
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● Spécificité NAD+
Localisation mitochondriale Coenzyme d’oxydation Localisation cytoplasmique
NADP+
Coenzyme d’hydrogénation, de biosynthèse
[NAD+]
>
[NADP+]
La plupart des enzymes sont spécifiques soit du NAD+ soit du NADP+ sauf qq exceptions comme la glutamate déshydrogénase ● Origine Le NAD+ et le NADP+ s’apparentent à la vitamine B3 ou PP (pellagre preventive) L’avitaminose PP entraîne une maladie appelée pellagre
6.1.2- Coenzymes flaviniques = Flavine mononucléotides (FMN) et Flavine adénine dinucléotide (FAD) ● Structure FMN
Flavine mononucléotides:
ribitol O (CHOH)3
CH2
CH2
O
P
OH
OH CH3
N
CH3
N
O
N
NH O
Noyau isoalloxazine = flavine = vit B2
Flavine Adénine Dinucléotide: FAD FMN (CHOH)3
CH2 CH3
N
CH3
N
N
O
NH
CH 2
O
OH
P
O
P
O
OH
O O
NH2 N
N
N
Ac adenylique
N
CH2 O H
H
H
OH
H OH
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● Mécanisme réactionnel
H
N
N
E
AH2 +
A
+
N
N H
FAD ou
FADH2 ou
FMN
FMNH2
jaunes
incolores
Les FMN et FAD sont appelés ferments jaunes FMN et FAD sont liés à l’enzyme: groupements prosthétiques
Exemples de déshydrogénases à FAD: NADH Déshydrogénase NAD+
NADH + H+ FAD
FADH2 COOH
COOH
Succinate déshydrogénase CH2
CH
CH2
CH
FADH2
FAD
COOH
COOH
succinate
Fumarate
● Origine Le FAD et le FMN dérivent de la flavine ou vitamine B2
6.1.3- Les ferroporphyrines: Coenzymes associés aux cytochromes grpt prosthétique + Fe
● Structure CH3
CH2-CH 2
N
CH3
CH3
N Fe N N
Cyt C
S
CH2-CH2
S
CH2 CH2
CH2 COOH
CH2
CH 3
CH2 COOH
● Rôle Jouent un rôle important dans le transfert d’électrons Fe2+ Fe3+ + 1eréduit oxydé
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6.1.4- Acide lipoïque ● Structure Ce coenzyme a la structure d’un AG saturé à 8 C avec un pont disulfure entre C6-C8. 7 CH2
1
2
3
4
6
COOH
CH2
CH2
5
CH2
CH2
CH
CH2
S
S
S
S
● Rôle:
+ 2H
8
SH
SH
Transporteur d’H2
L’acide lipoïque est attaché par covalence à l’Apoenzyme par son carboxyle à un reste lysine de l’enzyme : groupement prosthétique
6.2- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement
6.2.1- Thiamine pyrophosphate (TPP) ● Structure:
dérive de la vitamine B1 ou thiamine H
NH2
centre actif S
C N
CH2
N+
N
CH3
CH2
O
CH3
Cycle pyrimidique
OH
OH CH2
O
P
P
OH
O
O
Cycle thiazole
Thiamine = vitamine B1 ● Rôle: Transporteur d’acétaldéhyde dans les réactions de décarboxylation COOH CO2 + CH3
C=O CH3
O
C H
Acétaldéhyde
Ac. pyruvique La carence en vitamine B1 entraîne une maladie : le Béri-béri
NH2
● Structure O
CH2 H H O
O P OH
O
P O O
OH
O
P
OH
N N
O
H H OH OH
N N
6.2.2- Coenzyme A (CoA) = Coenzyme d’Acylation Dérive d’une Vit du groupe B: ac pantothénique ● Rôle Transporteur d’acétyle et d’acide gras
O CH2 CH3
C
H
OH C O C NH
CH3
Acide pantothénique CoA-SH + CH3COOH
CH2
CH3CO-SCoA acétyle CoA
CH2 C
O
CoA-SH + R-COOH
RCOO-SCoA
NH
acyl CoA CH2 CH2
Thioéthylamine ou mercaptoethylamine
SH
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6.2.3- Acide tetrahydrofolique
(FH4)
● Structure: dérive d’une vit: ac folique (vit B9) OH N
N 4
Acide folique
2
5 6 8 7
1
10
CH
CH2 CH2 COOH
COOH
Glu
Ac. Para amino benzoïque
N. pteridine H
OH
FH4
CO NH
CH2 NH
9
N
NH2
N H H N
N NH2
CH2
NH
CO NH
CH2 CH2 COOH
CH COOH
H
● Rôle
: transporteur d’unités à un C (CH3) CH2 Sur N5 Sur N10 N CH2 5 entre N5 et N10
N
10
6.2.4- S adénosyl méthionine (SAM) COOH
● Structure:
NH 2
CH NH2 CH2
Met
N
N
CH2 N +
CH3
S
CH3
H
adénosine
N
O
H
H
OH
H OH
● Rôle: transporteur de radicaux méthyles Transméthylase Substrat méthylé
Substrat
(Adrénaline)
(Noradrénaline) SAM
SAH
6.2.5- Adénosine 5’ triphosphate NH2
● Structure:
N
O HO
P OH
O
O O
P OOH
O
P
N
N O
adénine
N
O
OH H
H
H
OH
H OH
AMP ADP ATP ● Rôle: transfert de groupements ATP
ADP
+ P
ATP
AMP
+ P-P
ATP
adénosyl
+ P + P-P
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6.2.6- Phosphate de pyridoxal ● Structure:
dérive de la vit B6
= vit B6 CHO
CH2OH
CH2-NH2
CH2OH
CH2OH
CH2OH
OH
OH
OH
CH3
CH3
CH3
N
N
pyridoxine ● Rôle:
N
pyridoxal
pyridoxamine
Transport de groupement aminé: NH2 Pyridoxal = vit B6
HO
CH2-NH2
O
O
CHO
P
O
- NH2
CH3
P
O
CH3 OH
OH
OH
OH
HO
CH3
CH3
N
N
Phosphate de pyridoxamine
Phosphate de pyridoxal
Mécanisme des réactions de Décarboxylation et de Transamination 1ère étape -Enzyme
Acide aminé
PLP
Enzyme-PLP
Amino-acid-PLP
Réaction de décarboxylation
CO2 Quininoïd intermédiaire
Amino-acid-PLP PLP
Amine
+
H2
H2 O
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Réaction de transamination Réaction globale
Transaminase PLP Acide aminé
α cétoglutarate
Acide α cétonique
Glutamate
Transamination: étape 1 Iminoacide
Fonction amine
Acide α cétonique Pyridoxamine P (PMP)
Transamination: étape 2
(PMP)
α cétoglutarate
Enzyme-PLP
Glutamate
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6.2.7-Réaction de carboxylation: Carboxylases à Biotine
Centre actif
Biotine
Exemple: AcétylCoA Carboxylase HCO3ATP
CH3-CO∼ ∼SCoA
Pi ADP
→
HOOC-CH2-CO∼ ∼SCoA
Biotine
Chapitre 2:
La cinétique enzymatique
Objectifs: Reconnaître la cinétique d’une enzyme Reconnaître les facteurs qui influencent la cinétique d’une enzyme Définir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM) Représenter graphiquement la cinétique d’une enzyme en fonction des différentes variables
1- L’ORDRE D’UNE REACTION S
P
A- réaction d’ordre 0 [S]
V V=
t
-d[S]
=k
dt
[S]
B- réaction d’ordre 1 [S]
V
V=
t
-d[S] dt
= k[S]
[S]
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Calcul de la vitesse d’une réaction K1
S
P
V = V de disparition de S (d’apparition de P):
K1 K2
S
V =−
d [ S ] d[ P] = K1 [ S ] = dt dt
P
V de l’allée = V de disparition de S (apparition de P):V = −
d [ S ] d[P] = K [ S ] = 1 dt dt
d[P ] d [ S ] = K 2 [P ] V de retour = V d’apparition de S (disparition de P): V = − = dt dt
équilibre
Keq =
K1[S] = K2[P]
K1 [ P ] = K 2 [S ]
K1 A+B
P
K2
V de l’allée= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B] V de retour= V d’apparition de A et B (disparition de P): V = K2[P] équilibre K1[A][B] = K2[P]
Keq=
K1 [P ] = K 2 [ A ][B]
K1 A +B
C+ D
K2
V de l’allée= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B] V de retour= V d’apparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D] K1[A][B] = K2[C][D]
Keq=
K1 [C][D] = K 2 [ A ][B ]
2- CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES Ce qui est fondamental dans les réactions enzymatiques, c’est la combinaison E-S. Après formation du complexe, le substrat est transformé en produit et l’enzyme retrouve sa structure initiale.
S +E
K1 K2
ES
K3 K4
P +E
La V de la réaction enzymatique est influencée par: [S], [E], température, pH, effecteurs.
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2.1- V de la réaction en fonction de [S] L’étude de la cinétique enzymatique a été réalisée essentiellement par Michaelis et Menten en 1913.
2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten [E] fixe et faible V
V=Vmax [E] =[ES] Saturation de l’enzyme Ordre 0
Vmax
Courbe de Michaelis-Menten
Ordre 1 S
S
S
S
S
S
S S
S
S
S S S S
S
[S]
S S
Interprétation de la courbe de MM
- Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à la concentration du substrat (réaction d’ordre 1)
- Lorsque la conc de S augmente, la vitesse ne s’accroît plus dans les mêmes proportions (réaction d’ordre mixte)
- Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indépendante de cette concentration (réaction d’ordre 0): l’enzyme est saturée par son substrat. Ce phénomène est particulier à la cinétique enzymatique.
1.1.2- Détermination de l’équation de Michaelis-Menten K1
S+ E
K2
S +E ES
K3
K1 K2
ES
K3 K4
P +E
ES (rapide)
V= f([S]) ?
Conditions initiales [E] = concentration totale de l’enzyme [ES] = concentration du complexe Enz-Sub [E]L = concentration de l’enzyme libre
P + E (lente)
[E] = [E]L+ [ES]
[E]L= [E] - [ES]
V= K3[ES] Vitesse de formation de [ES] = Vitesse de disparition de [ES] =
d[ES] = K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S] dt - d[ES] = K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3) dt
Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES] K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3)
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K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3) ([E]-[ES])[S] [ES]
=
(K2+K3) = KM K1
[E][S] - [ES][S] = [ES] KM
[E] [S] [ES] =
[ES](KM+[S]) = [E][S] Or, V = K3[ES]
V
KM+[S] [E] [S]
= K3
V=Vmax
[E]=[ES]
KM+[S]
Vmax = K3 [E]
V=
Vmax [S] KM+[S]
V=
Equation de M-M
Vmax [S] KM+[S]
Cas particulier Si V=
Vmax 2 Vmax = Vmax [S] 2 KM+[S]
2[S] = KM +[S]
KM = [S]
V
Vmax
Vmax 2
KM
[S]
1.1.3- Signification de Vmax et de KM Vmax est atteinte lorsque toute l’enzyme est saturée par le substrat KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la réaction est Vmax/2 KM est une grandeur expérimentale qui peut varier avec la structure du S, le pH, la température. Chaque enzyme a un KM caractéristique pour un S KM indique l’affinité de l’enzyme pour le S
KM
affinité
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1.1.4- Représentation de Linweaver et Burk KM +[S]
KM
[S]
1 = = + V Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S]
V=
Vmax [S] KM+[S]
1 KM 1 + 1 = V Vmax [S] Vmax Y = a x + b
1 V
KM/Vmax
1/Vmax 1 [S]
-1/KM
Cette représentation offre l’avantage de permettre la détermination plus précise de KM et Vmax. De plus, étant une droite, elle nécessite moins de points expérimentaux.
1.2- Influence de la concentration en enzyme
V V
E3 E2 E1
[S]
[E]
La vitesse d’une réaction est proportionnelle à la quantité d’enzyme
1.3- Influence de la température
V
to optimale Mouvement des molécules
Dénaturation de la protéine
température 20
30
40
50
60
21
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1.4- Influence du pH
V
cholinestérase
pepsine
La plupart des enzymes
2
Le pH agit:
4
6
8
10
12
pH
Conformation de la protéine Association E-S Action catalytique de l’enzyme
1.5- Effet des effecteurs Rôle des effecteurs: Physiologique: Régulation du métabolisme cellulaire Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode d’action des enzymes compétitive réversibles inhibiteurs
irréversibles
non compétitive incompétitive
activateurs effecteurs allostériques
1.5.1- Inhibiteurs 1.5.1.1- Inhibition réversible 1.5.1.1.1- Inhibition compétitive Exercée par un composé dont la structure ressemble à celle du S E + S E + I KI =
K1 K2
ES
S
E + P
i
EI (Inactif)
[E] [I] [EI]
[EI] =
[E] [I] KI
[E] = [E]L + [ES] + [EI] Vmax [S] V = KM(1+[I]/KI) + [S]
K’M= KM(1+[I]/KI)
K’M
22
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1
Vmax [S] V = KM(1+[I]/KI) + [S]
=
V
[I] KM 1 + 1 (1+ ) [S] Vmax KI Vmax
V 1/ V
Sans I [I]
Vmax
[I]
Vmax/2 1/Vmax
-1/KM -1/K’M -1/K’’M
[S]
KM K’M K’’M
KM
1/[S]
affinité
Quand [S] augmente , l’effet de l’inhibiteur disparaît: L’inhibition compétitive est levée par un excès de substrat Vmax n’est pas modifiée
Exemples: La succinate déshydrogénase COOH
COOH
Succinate déshydrogénase CH2
CH
CH2
CH
FADH2
FAD
COOH
COOH
succinate
Fumarate COOH
COOH
CH2
Inhibiteurs compétitifs de la succinate déshydrogénase
CH2
CO COOH
COOH
malonate
oxaloacétate
Inhibition par le produit de la réaction Glucose 6 phosphatase Glucose 6P
+ H2O
glucose + H3PO4
Les amines quaternaires sont des inhibiteurs compétitifs de la cholinestérase
CH3 CH3
N+
CH2
CH2
O
CO
CH3
acétylcholinestérase Choline + ac. acétique
CH3
acétylcholine R1 R2
N+
R4
Amines quaternaires
R3
23
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Antimétaboliques En s’introduisant dans l’organisme, ils donnent naissance à des composés anormaux et ralentissent certains métabolismes. fluorouracile 2-amino adénine
Action anti-cancéreuse
La sulfamide
NH2
NH2
bactérie N-ptéridine +Ac. para amino-benzoïque + Glu
E COOH
Ac. para aminobenzoïque
Ac. folique
SO2-NH2
sulfamide Action antibactérienne
X des bactéries
1.5.1.1.2- Inhibition non compétitive E + S E + I ES + I
ES EI ESI
E
S
+ P
inactifs
i Cu2+, Ag2+…
[E]= [E]L+ [ES] + [EI] + [ESI] V’max V=
V Vmax V’max a V’’max b
Vmax [S] 1+ [I]/KI
1
KM + [S]
V
=
KM Vmax
(1+[I]/KI)
1 1 + (1+[I]/KI) [S] Vmax
1/V
[i]
sans i
1/V’’max 1/V’max 1/Vmax
[S]
1/[S] -1/KM
Ce type d’inhibition n’est pas levé par un excès de substrat KM est inchangé, l’affinité de E pour S n’est pas affectée Vmax est diminuée par l’inhibiteur Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des réactifs capables de se combiner réversiblement avec les groupement SH des radicaux Cys indispensables à l’activité enzymatique comme les métaux lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+…..) Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+, cet ion peut être chélaté par EDTA (éthylène diamine tétra acétique).
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1.5.1.1.3- Inhibition incompétitive
l'inhibiteur ne se lie que sur ES S
E
ES + I
E + S
+P
i
Vmax [S] 1+[I]/KI V= KM + [S] 1+[I]/KI
ESI [E]= [E]L+ [ES] + [ESI]
1 1 1 = KM (1+[I]/KI) + V Vmax [S] Vmax
V
Vmax
sans I
V’max
i
1/V
1/V’ max 1/Vmax
[S]
1/[S]
-1/KM’ -1/KM
Cet inhibiteur déplace l’eq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloquée sous forme ESI, donc Vmax est diminuée
Tableau récapitulatif des inhibitions réversibles
KM
Vmax
Pente
Compétitive Non compétitive Incompétitive
1.5.1.2- Inhibition irréversible:
inactivation totale de l’enzyme
1er exemple: E-S-CH2-CONH2 + HI
E-SH + ICH2CONH2 E à Cys l’iodoacétamide
Complexe inactif
réaction irréversible 2ème
exemple: Diisopropyl fluorophosphate (DFP) : arme biologique E - CH2 F CH3
E-CH2OH + E à Ser
CH CH3
O
P
O
O
DFP
CH
CH3
CH3
CH3
CH3
O CH
O
P
O
CH
CH3
+ HF
CH3 O
réaction irréversible Complexe inactif
Ex. enzyme à sérine: acétylcholinestérase 3ème exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition
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1.5.2- Activateurs 1.5.2.1- Activation par protection de l’enzyme Des composés qui protègent les enzymes contre les oxydations dans les enzymes à Cys se comportent comme des activateurs E-SH + SH-G E à Cys
E-S ------ SG + H2
Glutathion
1.5.2.2- Activation par les ions Concerne les enzymes qui nécessitent des ions pour leur activité Mg2+ est un activateur des kinases
Exemple:
1.5.2.3- Activation par action sur les subunités enzymatiques Protéine kinase protéine +
Protéine-P +
ATP
ADP
Les protéines kinases sont activées par l’AMPc
Site actif Site de fixation de l’activateur
C
+
R
E inactive
AMPc
C
+
R
AMPc
Subunité catalytique active
S
3- ENZYMES ET EFFECTEURS ALLOSTERIQUES 3.1- Cinétique des E allostériques
3.1.1- V en fonction de [S] Interprétation de la courbe des E allostériques V
E michaelienne
- Les petites quantités de substrat sont transformées lentement - La vitesse augmente à partir d’un seuil
E allostérique - Effet coopératif
[S] Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostériques n’exercent leur action qu’à des concentrations en substrat élevées
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ont une structure quaternaire, formées d’un nombre pair de sous unités.
S i
1er
La fixation de S au site entraîne un changement A de conformation des autres sites, ce qui modifie l’affinité pour le S. On dit qu’il y a un effet coopératif.
En plus du site actif où se fixe le substrat, l’enzyme possède un ou plusieurs sites allostériques où peuvent se fixer des effecteurs allostériques (activateurs ou inhibiteurs). Ces effecteurs n’ont aucune analogie structurale avec le substrat.
2.2- Action des effecteurs allostériques Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change l’affinité pour le substrat Activateurs allostériques Augmentent l’affinité de l’enzyme pour le substrat, lui permettant d’agir à de faible concentration en substrat inhibiteurs allostériques
Activateur
V
Comme les inhibiteurs non compétitifs diminuent l’affinité de l’enzyme pour le substrat Inhibiteur
Vmax 2
KM(a)KM KM(I)
2.3- Model des E allostériques S S
[S]
Model de Monod Wyman et Changeux (MWC) 1- possèdent 2 sites: site actif et des sites régulateurs (activateur et inhibiteur)
i A
2- formées de plusieurs sous unités identiques (= protomères) 3- existent sous 2 états en équilibre: état catalytique R et état inhibé T
R
A ou S
T
i Relâché Tendu (actif) (inactif) transition allostérique
Allostérie Autre forme
4- effet coopératif: du à la présence de plusieurs sous unités (protomères) la fixation d’une molécule de S sur un protomère déplace l’équilibre vers la forme active
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2.4- Importance des enzymes allostériques Ont un rôle de régulation très important dans la cellule: Permettent l’adaptation du métabolisme au besoin de la cellule En général l’enzyme allostérique catalyse la 1ère réaction, limitante d’une voie métabolique Son activité peut être contrôlée par des activateurs ou inhibiteurs appartenant à cette voie métabolique
E1
A
B
E2
E3
C
D
E
X X= inhibiteur allostérique
E allostérique Inhibition feed back ou retroinhibition
Les effecteurs allostériques ont une action spécifique sur les enzymes allostérique, en se fixant sur leur sites allostériques
MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE 1- Chymotrypsine: hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe R-CO-NH-R’ + H2O
RCOOH
+ NH2-R’
Le site actif : His 57,
Asp 102
et Ser 195
1ère étape: acylation peptide H
O C
O
R'
H
O
N
C
R'
N
N
C
N
O(His 57)
CH2
O N
C
R
O
(Asp102) (His 57)
(Ser 195)
Enzyme
H
O- H
H
(Asp102)
N
O
R
H
CH2 (Ser 195)
Enzyme
acylchymotrypsine
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2ème étape: désacylation
O
H
O C
O
H
H N
C
N
O
C
O
N
N
R
H O-
(Asp102)
CH2
(His 57)
C
H
R
O
(Asp102)
OH
O
O -
CH2
(His 57)
(Ser 195)
(Ser 195)
Enzyme
Enzyme
acylchymotrypsine
2- Acétylcholinestérase enzyme
Site anionique His
NH Site estérasique
CH2
CH3
acétylcholine
N
N+
CH3
CH2
CH2
O
O
OH CH2
C
CH3
Ser
CH3
un déplacement d’électron va fragiliser la liaison ester et provoquer sa rupture
HO
Tyr
H2O
CH3 CH3
N+
O
CH2
CH2
OH
CH3
+
HO
C CH3
Ac. acétique
choline
3- Transaminases Permettent le transfert réversible du groupement amine d’un AA à un acide α cétonique.
Le coenzyme des transaminases est le phosphate de pyridoxal O H
C H
3
N
C HO C H O P
2
29
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Site actif d’une transaminase OH CH3
OH CH3
HOOC
HOOC N
CH NH2C HO R
CH
H2O
CH2 O P
N
N
R
CH2 O P
Base de schiff COOH
OH CH3
R
+ H2O
HOOC C
N
N
C O
OH CH3
+
N
NH2
R
CH2 O P
CH2 O P
Ac. α cétonique
Phosphate de pyridoxamine
DOSAGE DES ENZYMES La quantité d’enzyme peut être mesurée par son activité enzymatique E A + B C Pour déterminer l’activité enzymatique, il faut connaître: 1- la stœchiométrie de la réaction 2- les besoins de l’enzyme en cofacteurs 3- KM 4- le pH optimum de l’enzyme 5- la gamme de température oùl’enzyme est stable 6- une méthode analytique permettant la détermination de la concentration du substrat qui disparaît ou du produit obtenu 1- Unité de l’activité enzymatique Unité internationale (UI) = la quantité d’enzyme qui produit la transformation d’une micromole (µ mole) de S par min à 25oC Le katal (kat) = la quantité d’enzyme transformant une mole de substrat par sec Activité spécifique = le nombre d’UI par mg de la protéine enzymatique
DO = ε [C] l
NAD+ (forme oxydée)
DO
NADH (forme réduite)
260
AH2
+ NAD+
350
E
Longueur d’onde (nm)
A + NADH + H+
30
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2- Intérêt de dosage des enzymes Le fonctionnement normal de l’organisme est le résultat de l’action harmonieuse de tous les systèmes enzymatiques Dosage des enzymes dans les liquides biologiques et les tissus révèle des variations pathologiques: Phosphatase acide dans le sérum Transaminases dans le sérum
Cancer de la prostate Cytolyse hépatique (hépatite)
La présence de certaines enzymes dans le sérum est le signe d’une nécrose tissulaire Mais dans certains cas la même activité enzymatique peut être due à des enzymes différentes selon leur origine tissulaire. C’est le cas des isoenzymes L’électrophorèse des isoenzymes permet de localiser l’origine de la nécrose
3- Les isoenzymes Ce sont des enzymes qui ont la même propriété catalytique mais qui différent par leur propriétés physicochimique. Les isoenzymes peuvent différer d’un tissu à un autre. LDH Ac. pyruvique Ex.: Lactate déshydrogénase (LDH): Ac. lactique LDH: 4 sous unités de 2 types, H et M Séparation par électrophorèse des 5 isoenzymes de la LDH
1
2
3
4
5
-
+ 1 dépôts Cœur
2
3
4
Forme H (Cœur)
5 Muscle et foie
Forme M (muscle et foie)
4- Les enzymopathies héréditaires: Il s’agit des déficits enzymatiques héréditaires Dans certains cas le diagnostic peut se faire par l’étude de l’activité enzymatique sur leucocytes (qui est diminuée) C’est le cas des maladies de surcharge lysosomale Pour d’autres maladies on mesure le substrat qui est accumulé Exs:
maladie
Albinisme:
Enzyme altérée Tyrosine hydroxylase
phénylcétonurie: Phénylalanine hydroxylase homocystinurie: Cystathionine β synthétase
31
