La famille des Enterobacteriaceae des Enterobacteriaceae comprend comprend de nombreux genres bactériens répondant à la définition suivante : Bacilles à Gram négatif aéro-anaérobies mobiles par ciliature péritriche ou immobiles facilement cultivables sur géloses ordinaires fermentant le glucose réduisant les nitrates en nitrites dépourv dépo urvus us d'oxy d' oxydase dase On prendra garde qu'une définition aussi précise ne peut que supporter des exceptions : le genre Plesiomonas va intégrer les Enterobacteries bien qu'oxydase + à ciliature polaire en raison de ses parentés génétiques avec Proteus ! N'oublions pas que les caractères phén phénoty otypi piqu ques es sont sont lilimités.
diff di fférent érentss genres g enres et e t espèces: espèce s: 130 espèces espèc es sont actuell actuellement ement répertori répe rtoriées. ées. Les différents genres actuels (entre parenthèses les espèces) d'après Bactériologie médicale (Le Minor- Véron) avec en gras les genres et espèces fréquents en microbiologie médicale :
Liste des genres et espèces d'Entérobactéries en 1996
Buttiauxella (agrestis) Budvicia (aquatica) Cedecea (davisae,lapagei) , diversus, amalonaticus) Citrobacter ( freundii Edwardsiella (tarda, hoshinae, ictaluri) Erwinia Enterobacter ( aerogenes , cloacae , asburiae, agglomerans (voir Pantoea), gergoviae, sakazakii, taylorae, amnigenus, intermedium) , fergusonii, hermanii, vulneris, blattae, Escherichia-Shigella ( coli Shigella ) Ewingella (americana) Hafnia (alvei) Klebsiella ( pneumoniae , oxytoca , planticola, terrigena) Kluyvera (ascorbata, cryocrescens) Koserella (trabulsii) Leclercia (adecarboxylata) Leminorella (grimontii, richardii) Moellerella (wisconsensis) Morganella (morganii) Obesumbacterium (proteus) Pantoea (agglomerans) genre remplaçant Enterobacter agglomerans Pragia (fontium) Proteus ( vulgaris, mirabilis, penneri, rettgeri , myxofaciens) Providencia ( stuartii, alcalifaciens , rustigianii) Rahnella (aquatilis) Salmonella ( enterica ) Serratia ( marcescens , liquefaciens, rubidae, odorifera, plymuthica, ficaria) Tatumella (ptyseos) Xenorhabdus (luminescens, nematophilus) Yersinia ( enterocolitica , frederiksenii, intermedia, kristensenii, pestis, pseudotuberculosis ) Yokonella (regensburgei)
MORPHOLOGIE: Ce sont des bacilles à Gram négatif de 2 à 3 micromètres de long sur 0,6 de large. Les Proteus sont très polymorphes : formes longues et filamenteuses ou petits bacilles droits. (Protée est un dieu de la mythologie grecque qui changeait de forme à volonté). Les espèces mobiles - les plus nombreuses - le sont grâce à une ciliature péritriche. Certaines sont immobiles ( Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis). Les Klebsiella sont capsulées. La plupart des espèces pathogènes pour l'homme possèdent des fimbriae ou pili communs qui sont des facteurs d'adhésion.
HABITAT: Les Entérobactéries sont présentes dans de nombreux éco-systèmes, en particulier l'intestin qui leur a donné son nom mais aussi dans l'environnement (eau, sol). Elles peuvent être saprophytes, commensales ou pathogènes. Le cas d'E. coli est typique puisque cette bactérie est retrouvée dans les eaux souvent en provenance d'une contamination fécale, dans l'intestin et certains E. coli sont pathogènes chez l'homme ou l'animal.
CULTURE: Les entérobactéries se développent rapidement in vitro sur des milieux "ordinaires". La température optimale de croissance est 37°C mais la culture est possible entre 20° et 40°C. Leur temps de division varie de 20 à 40 minutes. Sur gélose, les colonies sont lisses et régulières et atteignent deux millimètres de large sauf celles des Yersinia qui sont plus petites. Les Proteus ont tendance à envahir la gélose et à
y former un tapis uniforme. Ls Klebsiella forment des colonies souvent très muqueuses, larges, grasses et luisantes. En milieu liquide, les entérobactéries occasionnent un trouble uniforme du bouillon.
CARACTÈRES BIOCHIMIQUES: Les propriétés qui définissent la famille doivent être mises en évidence pour affirmer que la souche est une entérobactérie. Les caractères d'identification sont essentiellement "biochimiques" et utilisent des tests qui étudient le métabolisme protéique (présence d'uréase, production d'indole, dégradation du tryptophane) ou la fermentation des sucres (glucose, lactose, saccharose etc..), la capacité d'utiliser le citrate, la présence d'enzymes (décarboxylases, désaminases), la production d'hydrogène sulfuré ou la formation de gaz. Le tableau ci dessous résume les caractères d'identification des genres les plus fréquemment rencontrés : Esch Citr Ente Kleb
Serr Salm Shig
Prot
Prov Yers
Gluc
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lact
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
ONPG
+
+
+
+
+
-
+/-
-
-
+
Indole
+
-
-
+/-
-
-
+/-
+/-
+
+/-
VP
-
-
+
+
+
-
-
-
-
+*
Citr
-
+
+
+
+
+/-
-
+/-
+
-
Mob.
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+*
Urée
-
-
-
+
-
-
-
+
-
+
PDA
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
H2S
-
+/-
-
-
-
+
-
+/-
-
-
* à 20°C seulement
LA PAROI DES ENTÉROBACTÉRIES: Les entérobactéries sont des bacilles à Gram négatif et possèdent donc une paroi dont la structure en trois couches est particulière à ces bactéries. Cette paroi est constituée de l'extérieur vers l'intérieur : d'une membrane externe, d'une couche mince de peptidoglycane et d'un espace périplasmique qui entoure la membrane cytoplasmique. La membrane externe protège les entérobactéries de l'action des sels biliaires et des ferments digestifs. Elle est constituée d'une double couche lipidique dans laquelle sont inclus des molécules de lipopolysaccharide (LPS) qui comprend trois parties: le lipide A qui est l'endotoxine le core central, polysaccharide de base (constituant l'antigène R) ECBU les polyosides des chaînes latérales (constituant les antigènes O) S'y trouvent aussi des protéines diverses dont les porines (Omp pour Outer membrane protein) qui, en se polymérisant, forment des canaux assurant le passage des molécules hydrophiles à travers cette membrane externe par ailleurs très hydrophobe. Le peptidoglycane constitue une couche rigide, plus mince et plus lâche que chez les bactéries à Gram positif. Il est composé de chaînes linéaires de polyosides reliées entre elles par des peptides. L'assemblage et le remodelage du peptidoglycane sont sous la dépendance de transpeptidases et de carboxypeptidases qui fixent les bêta-lactamines et
sont pour cette raison dénommées PBP (pour Penicillin binding proteins) ou PLP ( pour Protéines de liaison aux pénicillines). Dans l'espace périplasmique s'accumulent des enzymes qui dégradent les substances prélevées dans le milieu extérieur et nécessaires au métabolisme de la bactérie. On y trouve également les bêtalactamases capables d'hydrolyser les bêtalactamines. La membrane cytoplasmique est constituée, comme toutes les membranes cellulaires, d'une double couche phospholipidique hydrophobe dont la perméabilité est rendue sélective par la présence de protéines dénommées perméases . De nombreuses enzymes et notamment celles qui interviennent dans le métabolisme énergétique sont insérées dans cette membrane. S'y trouvent aussi, sur sa face externe, les transpeptidases et carboxypeptidases nécessaires à la synthèse du peptidoglycane.
POUVOIR PATHOGENE: Le pouvoir pathogène des Entérobactéries concerne les syndromes digestifs, les infections du tractus urinaire, et une maladie très particulière, la PESTE. D'autres localisations sont possibles mais liées souvent à la dissémination des germes à partir du foyer initial. N'oublions pas que des Entérobactéries sont phytopathogènes comme Pantoea (Enterobacter agglomerans)
Syndromes digestifs De nombreuses Entérobactéries sont capables d'infecter l'individu. Certaines sont toutefois plus pathogènes que d'autres : les Salmonella et particulièrement les Salmonella Typhi et paratyphiques les E. coli-Shigella Yersinia enterocolitica Les divers modes d'action des bactéries entéropathogènes sont les suivants :
la production d'une toxine cytotonique ou sécrétoire (cholera like) dans l'intestin
déclenche les troubles car cette toxine se fixe sur les entérocytes ce qui provoque des modifications internes de la concentration de l'AMP cyclique (entérotoxine thermolabile de nature protéique) ou du GMP cyclique (entérotoxine thermostable de nature peptidique) provoquant des modifications de perméabilité ionique d'où la sortie d'eau et donc de la diarrhée.
la production de cytotoxines (shigella-like ou non) provoque les lésions cellulaires. Il en existe évidemment de divers types : - des toxines de type perforine (comme la Streptolysine O ) ou des phospholipases (lécithinases) agissant sur la membrane plasmique ou les membranes internes. - des toxines interférant avec le métabolisme (inhibition de la synthèse des protéines par ex.) comme les toxines Shigella-like ou vérotoxines - des toxines provoquant des modifications du cytosquelette et pouvant provoquer ainsi un relâchement des jonctions serrées et la diarrhée.
la bactérie est capable d'envahir les cellules et de s'y multiplier (virulence ) donc dispose de moyens lui permettant de s'opposer à la phagocytose-digestion : - empèche l'union lysosome-phagosome - détruit la membrane du phagosome - s'oppose aux enzymes lysosomiales en particulier aux peroxydes
la bactérie est capable d'envahir la muqueuse (tissus) et de s'y multiplier (virulence) avec passage intracellulaire ou non la bactérie est capable de disséminer au delà des tissus locaux (vers le sang ou la lymphe) On prendra garde que ces différents facteurs de virulence bactériens sont fonction de l'hôte. De plus, ces différents facteurs de virulence sont exprimés à des degrés forts variables chez les différentes bactéries, sans être toujours bien connus, et peuvent atteindre des lieux variés du tube digestif (intestin grêle (duodénum, iléon, jéjunum), gros intestin). De plus la réaction dépend de l'hôte. Quelques exemples :
Salmonella Typhi est d'abord multiplication intracellulaire suivie éventuellement d'une invasion lymphatique. Elle passe probablement par les cellules M de l'épithélium, cellules assurant le transfert aus système immunitaire (macrophages et celluels dentritiques) Shigella dysenteriae, les EIEC (Entéro-invasifs) sont d'abord à multiplication intracellulaire et toxinogènes. Les EPEC agissent essentiellement par "effacement" des microvillosités par une toxine altérant le cytosquelette cellulaire. Les ETEC libèrent des entérotoxines cytotoniques Les EHEC (entérohémorragiques) libèrent une quantité importante de cytotoxines dans le gros intestin probablement et peuvent être invasifs (peut être seulement chez certains individus). Ils libèrent aussi une toxine agissant sur le cytosquelette. Yersinia enterocolitica et pseudotuberculosis envahissent la muqueuse intestinale près de la fin du grèle
Syndromes urinaires E. coli est le pathogène le plus important au niveau du tractus urinaire. Il s'agit de certains sérovars O très particuliers qui sont en cause, les UPEC (uropathogènes). Ils gagnent le rein par la voie ascendante en remontant l'urêtre. Ce sont probablement des hôtes normaux de la flore commensale de l'individu qui sont en cause. Il existe très certainement une sensibilité individuelle particulière. D'autres bactéries sont mises en cause dans ces infections du tractus urinaire, souvent à la suite de manipulations de type sondage chez des patients malades.
La peste
C'est Yersinia pestis qui est la cause de la peste, maladie redoutable et toujours possible car de nombreux foyers persistent dans le Monde, en particulier à Madagascar ou aus USA. Yersin isola la bactérie de cadavres de pesteux en 1894 et Simond mis en évidence le rôle de la puce comme vecteur. Le rôle de réservoir des rats paraissait évident par la mortalité affectant ces animaux avant l'épidémie humaine. Trois grandes pandémies durant l'histoire : peste de Justinien au 6° siècle peste noire de 1347 à 1352 (et persistance en Europe jusqu'en 1845) qui a décimé les populations européenne de façon massive (entre 33 et 50 % des habitants). Honk Kong 1894 où Yersin isola la bactérie et l'étudia. La maladie présente deux aspects possibles : la peste bubonique : les bacilles sont injectés ou déposés par une puce vectrice. Ils se multiplient sans bruit durant un à sept jours puis la maladie se déclare de façon foudroyante, avec une forte fièvre, des vomissements. On observe un bubon, gros ganglion lymphatique de la zone de la piqûre. L'infection se généralise par septicémie très rapidement. Mortalité 70 % en absence de traitement. la peste pulmonaire , causée par une contamination par voie aérienne déclanchant une pneumonie mortelle en absence de traitement en moins de 4 jours et qui est très contagieuse.
CARACTÈRES ANTIGÉNIQUES: Les entérobactéries possèdent différents antigènes :
un antigène commun dénommé ECA (pour Enterobacterial Common Antigen) ou antigène de Kunin. Cet antigène n'existe que chez les entérobactéries et, de ce fait, a un intérêt taxonomique. Sa présence chez les Yersinia a permis d'inclure ce genre dans la famille des entérobactéries.
les antigènes O ou somatiques, correspondent aux polyosides fixés sur les lipopolysaccharides (LPS). Ils sont thermostables et résistent à l'alcool . Les bactéries portant des antigènes O sont agglutinées par les anticorps correspondants ; les agglutinats sont fins, lents à se constituer et difficilement dissociables par agitation (agglutination "corps à corps"). Comme les autres bactéries gram - , la paroi des Entérobactéries est recouverte d'une membrane externe dont le feuillet externe est constitué du LPS
Certaines mutations affectent le core et/ou l'Ag O et on distingue: - mutants R (Rough) = colonies rugueuses - colonies S (Smooth)= colonies lisses ( bactéries non mutées, possédant l'Ag O) La structure de l'Ag O est très variable d'une espèce à l'autre et au sein d'une même espèce, d'où le sérogroupage (E.coli, Salmonella)
l'antigène R correspond au polysaccharide du core central. La disparition de l'antigène O le démasque et rend les souches "rough" (colonies rugueuses) autoagglutinables dans l'eau physiologique, plus sensibles aux substances bactéricides du sérum, plus facilement phagocytées et donc moins pathogènes. les antigènes H ou flagellaires n'existent que chez les souches mobiles.
Constitués de protéines spécifiques dénommées flagelline, ils sont thermolabiles et inactivés par l'alcool. Ils provoquent une agglutination floconneuse (accolement des bactéries par leurs flagelles), rapidement constituée mais facilement dissociable par agitation (rupture des flagelles). les antigènes de surface comprenant : - les antigènes K, capsulaires, de nature polysaccharidique. Chez les Escherichia coli, les Shigella ou chez certaines Salmonella et Citrobacter (alors appelés Vi), ils masquent l'agglutination par les anticorps anti O qui peut être restituée après chauffage de la souche car ils sont détruits par ébullition. - les antigènes d'adhérence ou adhésines de nature protéique, portés par des pili communs (encore appelés fimbriae).
ENTÉROBACTÉRIES ET ANTIBIOTIQUES Le traitement des diarrhées est souvent symptomatique : la diarrhée est avant tout un moyen de défense de l'individu qui élimine ainsi le pathogène. Le grand danger est la déshydratation qui doit être compensée. En cas de fièvre et d'invasion, l'antibiothérapie sera très sûrement nécessaire. Les entérobactéries opposent une résistance naturelle aux Pénicillines G et M, aux macrolides, à la vancomycine. Certaines d'entre elles sont naturellement résistantes à d'autres molécules : les Proteus et Serratia à la colistine, les Klebsiella et Levinea à l'ampicilline. Ces résistances étant naturelles définissent des phénotypes dits "sensibles" ou "sauvages".
RÉSISTANCES NATURELLES: Résistance aux bêtalactamines : En testant quatre molécules : pénicilline A, carboxypénicilline, céphalosporine de 1ère génération (ou C1G) et céphalosporine de 3ème génération (C3G), on peut définir 4 types de comportement des
entérobactéries vis à vis des bêtalactamine s.
Groupe Pen A Carb CG1 CG3 1
SSSS
Escherichia coli,
Phénotypes sensibles
Proteus mirabilis, Salmonella, Shigella
2
RRSS
3
RSRS
Klebsiella, Levinea
Pénicillinase chromosomique
Enterobacter, Citrobacter
Céphalosporinase
Proteus indole +, Serratia, Providencia
4
RRRS
Yersinia enterocolitica
Pénicillinase + Céphalosp.
Résistance aux autres antibiotiques: Les aminosides, quinolones et phénicolés sont normalement actifs contre les entérobactéries mais les résistances acquises sont fréquentes.
RÉSISTANCES ACQUISES: 1° - Par production d'enzymes: - Résistance aux bêtalactamines: C'est surtout en produisant des bêtalactamases que les entérobactéries acquièrent des résistances aux bêtalactamine s. Les pénicillinases (TEM), d'origine plasmidique, rendent les souches qui en produisent résistantes aux péni G, A et aux carbénicillines mais si le niveau de production est élevé, la résistance s'étend aux acyluréido-pénicillines, aux céphalosporines de première et seconde génération (C1G, C2G) et à quelques C3G. Certaines de ces pénicillinases résistent aux inhibiteurs qui sont alors totalement inopérants : on les appelle TRI (pour TEM résistantes aux inhibiteurs) et les souches productrices sont résistantes aux pénicillines A et aux carboxypénicillines même lorsqu' elles sont associées à ces inhibiteurs. La production importante de céphalosporinase (céphalosporinase "déréprimée"), d'origine chromosomique, rend les souches résistantes à toutes les bêtalactamine s sauf aux carbapénems. Depuis peu sont apparues, chez Klebsiella pneumoniae surtout, des bêtalactamases à spectre étendu (SHV) d'origine plasmidique qui inactivent toutes les bêtalactamine s, sauf certaines C2G et les carbapénems.
Les entérobactéries du groupe 1 et Escherichia coli en particulier expriment parfois une pénicillinase sensible aux inhibiteurs (50% des colibacilles) Il arrive que cette pénicillinase soit abondamment produite (pénicillinase de haut niveau) et dans ce cas les inhibiteurs se révèlent moins efficaces. Une pénicillinase TRI est présente chez 3% environ des souches d' Escherichia coli
Les entérobactéries du groupe 2 ( Klebsiella, Levinea) produisent parfois leur pénicillinase naturelle à un haut niveau. C'est également principalement mais non exclusivement chez les klebsielles qu'on rencontre les BLSE
Les entérobactéries du groupe 3 ( Enterobacter, Citrobacter, Proteus indologènes, Providencia, Serratia) produisent naturellement une céphlosporinase qui peut être déréprimée.
- Résistance aux aminosides: Les enzymes qui hydrolysent les aminosides sont : les aminosides phosphotransférases (APH) les aminosides nucléotidyltransférases (ANT) les aminosides acétyltransférases (AAC) On peut, en testant les quatre aminosides les plus fréquemment utilisés (gentamicine, tobramicine, nétilmicine et amikacine), définir les phénotypes suivants : G, GT, GTN, TNA et GTNA. Ces résistances sont parfois difficiles à déceler et il faut une observation attentive et une interprétation correcte des résultats des antibiogrammes. Les phénotypes résistants sont rares : moins de 3% chez Escherichia coli, Salmonella et Shigella, un peu moins rares chez les Proteus mais deviennent plus fréquents, atteignant 20 à 50%, chez les autres entérobactéries : Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia.
- Résistance aux phénicolés Une chloramphénicol-acétyl-tranférase (CAT) est responsable de la résistance des entérobactéries aux phénicolés en particulier de certaines souches de Salmonella.
2° - Autres mécanismes: - Imperméabilité ou modification des cibles sont plus rarement cause de résistance chez les entérobactéries : Une mutation portant sur les porines est cause de résistance à haut niveau chez les Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus indologènes et rarement Salmonella. Les mutations qui affectent le transport actif des aminosides sont également responsables d'une résistance croisée à ces antibiotiques. Une mutation affectant l'ADN gyrase détermine une résistance aux quinolones ( Klebsiella, Serratia, Citrobacter, Providencia) Les mutations qui affectent les protéines ribosomales, entraînent une diminution de l'affinité des ribososomes pour les aminosides. De tels mutants sont rarement isolés en clinique.
En guise de conclusion: Les entérobactéries sont-elles pathogènes ?
Oui, serait-on tenté de répondre puisque ce sont les bactéries les plus fréquemment isolées chez les malades,
Non, au contraire, puisque nous accueillons ces bactéries sans dommages : le colibacille ne constitue-t-il pas l'espèce dominante de la flore commensale aérobie de nos intestins ? En fait, il en est des relations hôte-entérobactéries comme de toute relation : il y a des hauts et des bas . Différentes raisons, tenant tant à l'hôte qu'à la bactérie, expliquent cette versatilité.
Dépendent de l'hôte : les modalités d'entrée du microbe, la présence de certains récepteurs tissulaires d'adhésion, l'état des tissus atteints, les pathologies associées, l'efficacité du système immunitaire. Dépendent de l'(entéro)bactérie : l'importance de l'inoculum, le pathovar auquel elle appartient que définissent, les facteurs de virulence (capacités d'adhésion, de multiplication, élaboration de toxines et sans doute bien d'autres facteurs à découvrir). "C'est de l'union entre la bactérie et l'organisme que dépend la mise en route du processus infectieux..." (V. de Lavergne - La Maladie infectieuse - 1951). La pathogénicité est une notion très relative et isoler une bactérie d'un individu ne fait pas la preuve d'une infection ... encore moins d'une maladie ! En général, il y a beaucoup plus de "porteurs sains" que de malades ... et le médecin doit se garder de découvrir et traiter des malades qui n'en sont pas. Pour le bactériologiste, cependant, les entérobactéries sont des germes d'un prodigieux intérêt : nombreux genres, nombreuses espèces, nombreux biovars, sérovars et lysovars font de ces bactéries de passionnants sujets d'étude. L'antibiologie, la biologie moléculaire, le génie génétique et avec elles toute la bactériologie moderne leur doivent beaucoup. Les entérobactéries méritent respect et considération. Pasteur ne pensait-il pas aux entérobactéries quand il affirmait : " Messieurs, ce sont les microbes qui auront le dernier mot !"
ISOLEMENT ET IDENTIFICATION Isolement: Les Entérobactéries cultivent sur tous les milieux sans inhibiteurs habituels en aérobiose et anaérobiose (GO, GTS, CLED, Gélose au sang, Gélose chocolat enrichie...).
L'isolement polyvalent sélectif utilise le milieu de Drigalki ou EMB. Les agents sélectifs utilisés sont le désoxycholate (pratiquement dans tous les milieux sélectifs des Entérobactéries), le cristal violet, le vert brillant... Pour rechercher les Salmonella des milieux facilitent la recherche des colonies pouvant en être : on utilisera par exemple Hektoen, SS, Rambach agar ... Ls caractères utilisés sont la non-utilisation du lactose, du saccharose et de la salicine ainsi que la production éventuelle d'H2S (Salmonella seulement). On ne peut en aucun cas affirmer que les milieux utilisés "favorisent" les Salmonella : toutes les bacilles gram - risquent d'y cultiver (sauf cas particuliers) mais peuvent donner des aspects différents de celui des Salmonella ou Shigella. Le cas du milieu Hektoen est particulièrement intéressant : il a été inventé pour éliminer les Proteus vulgaris saccharose + de l'analyse ultérieure mais les Pseudomonas y cultivent (donnant des colonies vertes ou bleues) comme les E. coli (donnant des colonies éliminées puisque saumon). La recherche spécifique de Yersinia utilise le milieu Yersinia-CIN.
Identification: Les Entérobactéries sont identifiées essentiellement par des microméthodes, inventées avec la galerie API20E dans les années 1970 pour identifier de nombreuses Entérobactéries pathogènes opportunistes. Ce sont : la galerie API20E, Rapid20E et ID 32 E l'Enterotube II des microméthodes automatisées (Vitek, Microscan...) Galerie conseillée : GO pour le réisolement (ATTENTION : à condition que le milieu d'origine soit ordinaire)
VF ou/et Hugh et Leifson glucosés (pouvant être avantageusement remplacés par Kligler...) Kligler (pour le sérotypage et le caractère lactose) API20E ou équivalent Le sérogroupage est applicable au genre Salmonella, Shigella, Yersinia enterolitica et pour les E. coli entéropathogènes des nourrissons (bien discutable!). La recherche des toxines se fait dans certains laboratoires hospitaliers.
