Endotoksin
Endotoksin merupakan lipopolisakarida yang membentuk envelope (selubung) dari bakteri Gram negative yang yang dapat dilepaskan selama mikroorganisme mengalami lisis lisis atau pembelahan sel. Uji endotoksin merupakan bagian penting dari jaminan kualitas dan control kualitas dari produk injectable, peralatan medis, dan bahan baku.Uji sterilitas biasanya
digunakan untuk
menjamin sterilitas dari suatu produk, namun hal tersebut tidak menjamin karena adanya sifat kimia pada identifikasi endotoksin dan merupakan hasil dari bakteri Gram-Negative saja. Adanya endotoksin dalam aliran darah dapat menyebabkan demam, peradangan, dan shock yang bersifat irreversible.
Awalnya, pengujian endotoksin dan pengujian pirogen adalah
dengan menyuntikkan
sekelompok kelinci dengan injeksi prod-SLT dan pemantauan peningkatan suhu tubuh kelinci. Baru-baru ini dikembangkan uji in vitro yang memiliki tingkat sensitivitas lebih tinggi dari tes kelinci. Test invitro ini menggunakan Limulus amebocyte lisat (LAL), yang merupakan ekstrak sel darah air dari Horse Shoe Crab. Tiga jenis pengujian LAL LAL yaitu metode gel-bekuan, gel-bekuan, metode kromogenik, dan metode turbidimetri, metode ini telah disetujui oleh Amerika Serikat Pharmacopeia untuk evaluasi obat suntik produk akhir, perangkat medical, dan bahan baku. Gel-Clot
Metode Gel-clot melibatkan protein pembekuan yang dilisis oleh enzim pembekuan, di mana titik produk disosiasinya larut menyatu dengan interaksi ionic untuk membentuk gel. Meskipun seluruh reaksi belum ditentukan, dapat dipahami bahwa reaksi yang mengarah ke pembentukan gumpalan ini melibatkan langkah aktivasi enzim. Uji LAL dilakukan dengan menambahkan 100 uL rekonsistusi dari Pyrotell ( Cape Cod, Incorporated, Falmouth, Massachusetts) pada 100 uL spesimen dalam 10 x 75 mm depyrogenated flint (soda lime) tabung reaksi kaca (Product # T100 , Charles River Endosafe, Charleston, Carolina Selatan). Larutan reaksi dicampur secara menyeluruh dan ditempatkan langsung di tempat yang kering-blok inkubator atau noncirculating water bath pada 37 ˚ C ± 1 ˚ C selama 60 ± 2 menit. Pada akhir masa masa inkubasi, tabung diambil dari inkubator dan di balik. Jika gel telah terbentuk dan tetap utuh di dasar tabung reaksi setelah
inversi 180 derajat, tes ini positif. Sebuah tes positif menunjukkan bahwa konsentrasi endotoksin dalam tabung lebih besar dari atau sama dengan sensitivitas Pyrotell. Negara lain dari campuran reaksi merupakan tes negatif, yang menunjukkan konsentrasi endotoksin kurang dari sensitivitas Pyrotell. Tes ini dianggap negatif jika gel telah terbentuk tapi ketika dibalik gel tersebut pecah . Metode gel-clot sering dianggap sebagai prosedur yang paling akurat dan sensitif untuk konten pengujian endotoksin dalam produk injeksi obat karena hasil positif palsu dan negatif palsu yang diamati lebih sedikit. Meskipun beberapa obat berinteraksi dengan zat yang digunakan dalam metode gel-bekuan, tes penghambatan atau tes awal harus dilakukan untuk menentukan apakah materi uji menghambat, meningkatkan, atau tidak berpengaruh pada reagen tes. Banyak obat meningkatkan atau di hambat oleh reagen uji untuk menghasilkan hasil baik positif palsu atau negatif palsu. Meskipun metode gel-bekuan adalah jauh tes yang paling akurat, tapi membutuhkan waktu yang lama. Faktor-faktor lain yang dapat mempengaruhi hasil dari metode gel-bekuan termasuk inhibitor kimia (misalnya, asam ethylenedi-aminetetraacetic [EDTA]) yang menyebabkan chelation kation divalent yang diperlukan untuk reaksi LAL, denaturasi protein dari agen seperti fluorescein , gangguan pH (yaitu, pH tidak berada dalam kisaran 6,0-7,5), dan inhibitor fisika yang dapat menyerap endotoksin atau menghasilkan viskositas.
Kromogenik
Metode kromogenik dikembangkan pada tahun 1977 oleh peneliti Jepang yang menetapkan bahwa endotoksin-diaktifkan LAL akan memecah asam amino pada site tertentu
yang
mengandung peptid kromogenik. Metode tersebut didasarkan pada pemecahan peptida coagulogen, yang disebabkan oleh tahap aktivasi enzim. Produk pemecahan larut yang meliputi coagulogen dan coagulin, yang menyatu dengan interaksi ionik. Bila terdapat coagulin dalam jumlah yang cukup , larutan uji menjadi keruh dan membentuk gumpalan gel
Dengan adanya endotoksin, komponen LAL diaktifkan melalui proteolitik yang menghasilkan pembelahan peptida substrat berwarna pada Pyrochrome LAL. Pembelahan proteolitik substrat membebaskan p-nitroaniline (p NA), yang berwarna kuning dan memiliki absorbansi 405-410 nm. Ketika metode kromogenik digunakan, dua metode mengukur konsentrasi endotoksin dalam sampel tersedia. Metode kinetik bergantung pada jumlah waktu yang dibutuhkan untuk sampel untuk mencapai absorbansi
tertentu (405 nm). Waktu onset ditentukan oleh konsentrasi
endotoksin dalam sampel. Sebagai contoh, reaksi yang lebih singkat interval menunjukkan konsentrasi endotoksin yang lebih tinggi dalam sampel. Dalam metode kromogenik endpoint, pengukuran p NA setelah beberapa waktu inkubasi digunakan untuk menentukan konsentrasi endotoksin. Kedua metode kinetik dan metode kromogenik end-point memerlukan kurva standar untuk menentukan jumlah endotoksin hadir dalam sampel. Keuntungan menggunakan metode kromogenik banyak. Ada sistem otomatis tersedia yang mengurangi jumlah waktu yang dibutuhkan untuk melakukan tes (dan karena itu meningkatkan jumlah tes yang dapat dilakukan). Ketika banyak tes untuk endotoksin harus dilakukan, metode kromogenik otomatis adalah solusi terbaik. Metode tersebut adalah sangat user-friendly, dan hasilnya dapat dihitung dengan mudah. Perhatian harus diambil ketika zat yang bersifat protein, ion kelat, mengikat endotoxin, atau mengubah keadaan hidrofobik endotoksin yang diuji; zat tersebut dapat mengganggu tes. Beberapa protease serin (misalnya, tripsin, faktor darah diaktifkan) menyebabkan hasil positif palsu kecuali mereka telah didenaturasi dengan panas sebelum pengujian. Serum hewan, albumin, plasma, dan zat lainnya dapat mengganggu tes kromogenik p NA karena warna kuning mereka. Kekeruhan Kelebihan dalam sampel juga mengintervensi tes, kecuali kekeruhan dapat dikurangi atau sampel dapat dilakukan preparasi untuk menghilangkan kekeruhan...
Turbidimetri
Metode turbidimetri hamper sama dengan metode kromogenik dan membutuhkan perhitungan yang sama.Pada metode Turbidimetri melibatkan pemutusan protein pembekuan setelah enzim pembekuan diaktifkan. Produk yang dihasilkan tersebut menyatu sebagai akibat dari interaksi ionik yang terjadi setelah pemutusan dan menyebabkan campuran reaksi menjadi keruh. Metode turbidimetri dapat digunakan untuk menentukan endotoxin pada sampel dalam dua cara. Keduanya memerlukan penggunaan kurva baku tapi berbeda dalam titik akhir untuk pengukuran. Konsentrasi endotoksin dapat ditentukan dengan menggunakan pengukuran optical density untuk membandingkan sampel dengan standar, sehingga dapat mengukur tingkat kenaikan kekeruhan. Cara selanjutnya yaitu dengan melihat waktu yang digunakan sampai tingkat kekeruhan tertentu yang diinginkan tercapai, atau tingkat kekeruhan setelah waktu inkubasi ditentukan. Sebuah sistem otomatis yang membantu penetapan ini tersedia untuk metode ini dan metode kromogenik. Seperti metode kromogenic, metode turbidimetri dapat digunakan untuk tes
darah, serum, albumin, plasma, dan bahan serupa. Metode turbidimetri sensitif terhadap bahan keruh yang dapat menghasilkan hasil positif palsu jika sampel tidak disiapkan dengan benar. Tripsin adalah contoh lain dari sampel itu, ketika diuji, yang dapat menyebabkan hasil positif palsu kecuali sampel didenaturasi dengan benar. Kesimpulan
Semua tiga metode endotoksin-pengujian yang dijelaskan dalam artikel ini telah disetujui oleh USP untuk digunakan dengan obat suntik dan produk lainnya. Meskipun masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan, semua dapat digunakan secara akurat dan efektif untuk penetapan adanya endotoksin dalam berbagai produk. Banyak ilmuwan percaya bahwa metode gel-bekuan adalah metode yang paling akurat untuk menentukan konten endotoksin. Ketika metode gel-bekuan yang digunakan, interaksi yang dapat mengganggu reaksi sedikit, tetapi proses persiapan sangat panjang sehingga
dapat menunda hasil. Metode turbidimetri dapat
dilakukan dengan sistem otomatis. Hal ini juga mudah dilakukan, tetapi banyak orang merasa bahwa hasil positif palsu sering terjadi ketika metode yang digunakan. Metode kromogenik sangat user-friendly dan dapat dilakukan dengan sistem otomatis, tetapi banyak senyawa dapat berinteraksi ketika metode yang digunakan. Akibatnya, metode kromogenik tidak dapat digunakan dalam banyak kasus. Selain memiliki kelebihan dan kekurangan, masing-masing dari ketiga metode yang direkomendasikan oleh USP, kesalahan yang dilakukan oleh teknisi dan salah tafsir dari hasilnya juga menjadi masalah yang biasa. Apapun metode yang digunakan, laboratorium dan apotek harus memastikan bahwa teknisi mereka terlatih dan terdidik dalam metode pengujian endotoksin. International Journal of Pharmaceutical Compounding vol 6 2001, Timoty J. Joiner, Paul F. Kraus., Thomas C. Kupiec, Phd, analytical Research Laboratories, Oklahoma City, Oklahoma. Methode for Pharmaceutical Products.
Uji Endotoksin
Bacterial Endotoxin Test (BET) digunakan untuk mendeteksi atau menghitung endotoxin dari bakteri Gram Negative menggunakan amobocyt lysate dari Limulus polyphemus atau Tacypleus tridentatus. Beberapa metode yang direkomendasikan adalah A. Gel-Clot berdasarkan pembentukan gel B. Turbidimetri berdasarkan pengembangan kekeruhan
setelah pemutusan dari agen
edogen. C. Kromogenik berdasarkan pembentukan warna yang terjadi dari pemutusan peptid yang bereaksi dengan reagen kromogenik.
Contoh Product Lonza QCL-1000 : produk ini merupakan untuk uji endotoksin secara invitro dengan menggunakan LAL test, tetapi hanya untuk obat, biological product (produk biologi), dan alat-alatkesehatan. Metode yang digunakan adalah dengan memodifikasi LAL dan subtrat pewarna sintetik untuk mendeteksi endotoksin secara kromogenik. Pada bulan desember 1987, FDA telah mempublikasikan guidline tentang validasi
dan
penggunaan LAL, “ Guideline on the validation and use of the limulus amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, And Medical Devices” guideline ini berisi tentang prosedur penetapan batas endotoxin pada produk farmasi dan alat-alat kesehatan dan validasi penggunaan LAL sebagai uji endotoxin dan Pengembangan rutin protocol uji. Penjelasan Uji
End-Point Chromogenic LAL Test adalah uji quantitative untuk endotoxin dari bakteri Gram Negative. Sampel dicampur dengan LAL dan diinkubasi pada 37 C + 1 pada waktu 10 menit, lalu substrat pembentuk warna ditambahkan pada campuran LAL-Sampel diinkubasi pada 37 C dengan tambahan waktu 6 menit. Reaksi dihentikan dengan Stop Reagent. Jika Endotoxin positif, maka akan terlihat warna kuning . pengukuran menggunakan spektrofotometri dengan lamda 405-410 nm. Absorbansi berbanding lurus dengan jumlah endotoxin , dan konsentrasinya dihitung dengan kurva baku.
Sejarah Penemuan LAL
Penemuan LAL pertama kali oleh observasi
Bang, dimana pada waktu itu bakteri
Gram-
Negative menginfeksi Limulus polyphemus (Horse Shoe Crab), infeksi ini menyebabkan koagulase pada cairan intra-vascular. Levin dan Bang, mempublikasikan bahwa penjendalan yang terjadi adalah reaksi antara endotoxin dan protein pembekuan pada sirkulasi pembentukan amebocytes dari limulus.
Pengembangan penelitianya dengan mempersiapkan lysat dari
amebocytes yang merupakan indicator sensitive dari adanya endotoxin. Solum dan Young, Levin dan Prendergast memurnikan dan mengkarateristik protein pembekuan dari LAL dan mempunyai reaksi dengan endotoxin secara enzimatik. Reaksi antara LAL dan Endotoxin dapat mengaktivasi enzyme yang dapat melepas P-nitroaniline (pNa) dari substrat sintetik yang menghasilkan warna kuning. Prinsip Pengujian
Endotoxin dari Bakteri Gram-Negative mengkatalisis aktivasi dari proenzym pada LAL, enzyme ini dapat mengkatalisis bagian dari pNA dari substrat yang tidak berwarna (Ac-IIe-gluAla-Arg-pNA) menjadi peptide dan melepaskan pNA yang dapat diukur secara fotometrik pada 405-410 nm .
