9.10.2009r. ĆWICZENIA 1 Techniki histologiczne
(technika parafinowa, celloidynowa, mrożeniowa) Technika parafinowa
1. Pobieranie materiału Przy pobieraniu materiału należy zwrócić uwagę na dwie zasadnicze sprawy: • fragment pobranej tkanki powienien być stosunkowo niewielki (do celów mikroskopii świetlnej przynajmniej jeden wymiar nie powinien przekraczać 5 mm, a do celów mikroskopii elektronowej 1 mm), aby zapewnić dobrą i możliwie szybką penetrację płynów stosowanych w dalszych etapach procedury (utrwalacz, płyny odwadniające i pośrednie); przy pobraniu większego fragmentu należy go przed utrwaleniem pokroić na mniejsze kawałki; • jeżeli materiał pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobranie materiału powinno się odbyć za życia lub natychmiast po śmierci zwierzęcia, aby zapobiec zmianom rozkładowym w tkankach. Z tego samego powodu, jeżeli po pobraniu materiału trzeba go gdzieś przetransportować, należy użyć do tego celu pojemnika z lodem. 2. Utrwalanie materiału Utrwalanie materiału materiału ma na celu: natychmiastowe natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych metabolicznych w komórkach i tkankach, tkankach, przede wszystkim poprzez denaturację enzymów. Można w ten sposób zapobiec zmianom autolitycznym, czyli samostrawieniu komórek przez ich własne enzymy lizosomowe, oraz wtórnym zmianom rozkładowym i gnilnym wywołanym przez obecne w materiale lub zawleczone z zewnątrz bakterie; związanie i wytrącenie (precypitację) niektórych zawartych w tkankach substancji rozpuszczalnych, co zapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie; wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury; niekiedy również poprawę optycznego zróżnicowania tkanki poprzez wywołanie w niej reakcji chemicznych ułatwiających późniejsze barwienie. Niew Niewąt ątpli pliwie wie naji najist stot otnie niejs jsze ze znac znacze zeni niee mają mają trzy trzy pierw pierwsz szee cele cele utrwa utrwala lani niaa i prawie prawie wszys wszystk tkie ie utrwalac utrwalacze ze spełniaj spełniająą zawarte zawarte w pierwszy pierwszych ch trzech trzech punktac punktachh warunki. warunki. Umożliwi Umożliwiają ają one zachowan zachowanie ie w utrwalonym materiale struktury możliwie najbardziej zbliżonej do naturalnej struktury żywych komórek i tkanek. Rodzaje utrwalaczy Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Do utrwalaczy chemicznych należą (w nawiasach podano najczęściej stosowane stężenia): aldehydy: formaldehyd (aldehyd mrówkowy, formalina - 2-10%), aldehyd glutarowy (1,5-6,0%), akroleina (10%); alkohole: etylowy i metylowy (50-100%); ketony: aceton (50-100%); kwasy organiczne i nieorganiczne: kwas octowy (50-100%), kwas pikrynowy (1%), kwas chromowy (2%), kwas taninowy (1%); związki metali ciężkich: chlorek rtęci (sublimat - 5-7%), dwuchromian potasu (2,5-5,0%), czterotlenek osmu (0,5-2,0%) Utrwalacze chemiczne podzielić można na proste i złożone. Utrwalacze proste (czyli jednoskładnikowe): - kwasy mineralne i organiczne (kwas chromowy, kwas octowy, kwas pikrynowy, kwas trójchlorowy) - formalina 10% rozkłada glikogen, nie rozkłada tłuszczy) - alkohol etylowy 70% (rozpuszcza tłuszcze, nie rozpuszcza glikogenu) - alkohol metylowy - aceton - sole metali ciężkich
Utrwalacze złożone, będące mieszaniną dwóch lub kilku utrwalaczy prostych oraz niekiedy innych substancji. Do najczęściej stosowanych utrwalaczy złożonych należą np.: utrwalacz Bouina (kwas pikrynowy i octowy, formalina), utrwalacz Susa (chlorek rtęci, chlorek sodu, kwas trójchlorooctowy, kwas octowy lodowaty, formalina, woda destylowana) utrwalacz Carnoya (alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy), utrwalacz Zenkera (sublimat, chlorek rtęci, dwuchromian potasu, siarczan sodu, woda destylowana, kwas octowy, siarczan sodu). Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, a w niektórych przypadkach również alkohole. Utrwalan Utrwalanie ie fizyczn fizycznee pole polega ga na oddzi oddział aływa ywaniu niu na mate materia riałł mikro mikrofal falam amii lub lub promi promieni eniowa owani niem em jonizującym. 3. Płukanie materiału w wodzie W przypadku większości utrwalaczy określony jest maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tego czasu czasu może może spowod spowodowa owaćć niek niekorz orzyst ystne ne zmiany zmiany struk struktur tural alne ne w komórk komórkac achh i tkanc tkance. e. Dlate Dlatego go też też proce process utrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału. W zależności od rodzaju planowanych badań mikroskopowych (rutynowa mikroskopia świetlna, histochemia, mikroskopia elektronowa) płukanie przepr przeprowa owadz dzaa się się bądź bądź w wodzi wodziee (najl (najlepi epiej ej bież bieżąc ącej) ej),, bądź bądź w bufora buforach ch,, któ które re służ służyły yły uprze uprzedni dnioo jako jako rozpuszc rozpuszczal zalnik nik dla utrwalacz utrwalacza. a. Jeżeli Jeżeli użyto użyto alkohol alkoholoweg owegoo (bezwodn (bezwodnego) ego) roztworu roztworu utrwala utrwalacza, cza, płukani płukaniee przeprowadza się w kilku zmianach alkoholu o nieco wyższym stężeniu. 4. Odwadnianie Po utrwaleniu materiału, dalsze etapy procedury uzależnione są od rodzaju docelowego preparatu mikro mikrosko skopow powego ego.. W przypa przypadku dku rozmaz rozmazów, ów, rozgni rozgniotó otów w czy czy hodowl hodowli,i, mo można żna od razu razu przyst przystępo ępowa waćć do barwienia. Jeżeli natomiast chcemy uzyskać skrawki o przydatnej w mikroskopii bardzo niewielkiej grubości, pokrojenie materiału jest możliwe jedynie pod warunkiem jego należytego utwardzenia. Im cieńsze mają być skrawki, tym twardszy musi być krojony materiał. W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem. Proces ten pole polega ga na przep przeprow rowad adze zeniu niu materi materiał ałuu przez przez szere szeregg wodnyc wodnychh roztwo roztworów rów tych tych subst substan ancj cjii o stopni stopniowo owo wzrastających stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%) aż do dwóch zmian bezwodnego (absolutnego) alkoholu lub acetonu. Odwadniania dokonuje się w szczelnie zamkniętych naczyniach - jest to szczególnie istotne podczas ostatniego etapu tej procedury, gdyż zwłaszcza absolutny alkohol jest niezwykle higroskopijny i z łatwością chłonie wodę z powietrza. 5. Przeprowadzenie materiału przez płyny pośrednie: benzen, toluen, ksylen I i II, chloroform Odwodnionego materiału zazwyczaj nadal nie można zatopić, gdyż substancja, którą chcemy go przepo przepoić ić,, nie nie rozpu rozpuszc szcza za się się równi również eż w alko alkohol holuu czy czy aceto acetonie nie.. Istni Istniej ejee zate zatem m konie koniecz czno ność ść wstępn wstępnego ego przepojenia tkanki płynem, który rozpuszczałby się zarówno w odwadniaczu, jak i w środowisku użytym do zatapiania. Płyny takie noszą nazwę płynów pośrednich, bowiem pośredniczą pomiędzy odwadnianiem a zata zatapi piani aniem em.. Dopie Dopiero ro po dokła dokładny dnym m przepo przepoje jeniu niu materi materiał ałuu płyne płynem m pośred pośredni nim m mo można żna rozpo rozpocz cząć ąć jego jego zatapianie. W przypa przypadka dkach ch,, gdy gdy mate materia riałł zata zatapi piaa się się w środow środowisk iskac achh pola polarny rnych ch,, nie jest jest konie koniecz czne ne ani odwadnianie, ani przepajanie płynem pośrednim. 6. Umieszczenie w parafinie ciekłej (początkowo w parafinie o topliwości poniżej 50 oC, później w parafinie o topliwości powyżej 50 oC) Używają Używającc parafin parafinyy do utwardz utwardzani aniaa materia materiału łu przed przed jego skrojeniem skrojeniem wykorzys wykorzystuj tujee się fakt, fakt, iż w temperat temperaturze urze pokojowe pokojowejj parafin parafinaa jest substan substancją cją stałą, stałą, natomia natomiast st po stosunk stosunkowo owo niezna nieznaczn cznym ym ogrzani ogrzaniuu przechodzi w stan płynny. W pierw pierwsz szym ym etapi etapiee um umie ieszc szcza za się materi materiał ał w roztwo roztworze rze płynu płynu pośred pośredni nieg egoo i paraf parafiny iny (1:1) (1:1) w temperaturze 37°C. Pozwala to na wstępne wprowadzenie parafiny do tkanki. Następnie materiał przeprowadza się przez 2 lub 3 zmiany czystej parafiny, aby usunąć zeń nawet śladowe resztki płynu pośredniego, którego obecność wpłynęłaby niekorzystnie na własności materiału podczas krojenia.
W rutynowej technice histologicznej używa się kilku odmian parafiny różniących się twardością i temperaturą topnienia (im wyższa twardość, tym wyższa temperatura topnienia: od 45°C dla parafiny bardzo miękkiej do 60°C dla bardzo twardej). Proces przepajania parafiną odbywa się w cieplarce, w temperaturze o kilka stopni wyższej od temperatury temperatury topnienia użytej parafiny. Czas przepajania przepajania jest zależny zależny od rodzaju tkanki (jej twardości, spoistości, itp.) oraz od rozmiarów zatapianego materiału i wynosi od kilku godzin do kilku dni. Skons Sko nstru truowa owano no urząd urządze zenia nia (tzw. (tzw. proce proceso sory ry tkan tkankow kowe), e), w któ któryc rychh cały cały proce process od odwodn odwodnie ieni niaa materiału do jego przepojenia parafiną odbywa się automatycznie. Są one wykorzystywane w pracowniach wykonujących szczególnie duże ilości preparatów mikroskopowych (np. duże pracownie histopatologiczne). 7. Formowanie bloczków Po zakończeniu procesu zatapiania materiał wkłada się do specjalnych foremek, zalewa płynną parafiną i szybko oziębia, np. przez zanurzenie w zimnej wodzie. Parafina zestala się i tak uzyskany bloczek można następnie przyciąć do pożądanego kształtu i rozmiarów za pomocą ostrego noża. Przy Przy równoc równocze zesny snym m oprac opracowy owywa waniu niu większ większej ej il ilośc ościi materi materiał ałów ów niez niezbęd będne ne jest jest odpow odpowie iedni dniee oznakowanie bloczków. Najprościej można to zrobić przez włożenie do foremki niewielkiego paska papieru zawierającego zawierającego symbol danego materiału w ten sposób, aby po zestaleniu parafiny oznakowany oznakowany fragment paska wystawał poza bloczek.
8. Krojenie przy pomocy mikrotomów Do krojenia skrawków histologicznych służą przyrządy zwane mikrotomami. Każdy mikrotom składa się z czterech podstawowych części: noża mikrotomowego, stolika przedmiotowego, na którym montuje się skrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechanizmu regulującego grubość skrawków. W zależności od typu konstrukcyjniego, częścią ruchomą może być albo stolik, albo (rzadziej) nóż. Istnieje kilka typów mikrotomów: mikrotom rotacyjny, najpowszechniejszy, najpowszechniejszy, w którym obrotowy ruch korby przekształcany przekształcany jest w posuwistozwrotny ruch stolika względem noża; mikrotom wahadłowy, w którym obrotowy lub wahadłowy ruch uchwytu jest przekazywany systemem dźwigni na stolik przedmiotowy, wykonujący ruch wahadłowy (po wycinku koła); mikrotom saneczkowy, w którym stolik wraz z uchwytem przesuwa się ruchem posuwisto-zwrotnym wzdłuż prowadnic, a nóż jest nieruchomy (lub odwrotnie). Nowocze Nowoczesne sne mikrotom mikrotomyy często często wyposażo wyposażone ne są w napęd napęd elektry elektryczn cznyy oraz ukł układy ady elektron elektroniczn icznee umożliwiające regulację szybkości skrawania, automatyczne dosuwanie nowo założonego bloczka do noża, itp. 9. Ułożenie skrawka materiału na szkiełku podstawowym Przy Przy kroje krojeni niuu mate materia riału łu zatop zatopio ione nego go w paraf parafin inie ie tworzy tworzy się się tzw. tzw. wstęga, złoż złożona ona z kole kolejn jnych ych (seryjnych) (seryjnych) skrawków zlepionych zlepionych ze sobą krawędziami. Używane obecnie mikrotomy pozwalają na uzyskanie skrawków parafinowych o grubości 2-10 µ m. Skrawki takie można przechowywać dowolnie długo bądź w formie wstęgi, bądź po ich uprzednim naklejeniu na szkiełka podstawowe. Naklejenie skrawka parafinowego na szkiełko podstawowe wymaga jego rozprostowania, gdyż podczas krojenia skrawki mocno się fałdują. W celu rozprostowania skrawka umieszcza się go na powierzchni wody ogrzanej do ok. 40°C - działają nań wówczas siły napięcia powierzchniowego wody, a parafina staje się miękka. Po podłożeniu szkiełka pod rozprostowany skrawek wyjmuje się go z wody, a skrawek "przykleja" się do powierzchni szkła. Naklejone skrawki suszy się przez ok. godzinę w temperaturze 37°C, co powoduje mocne przywarcie wciąż miękkiej parafiny skrawka do szkiełka podstawowego. W przypadku niektórych materiałów oraz pewnych procedur wiążących się z intensywnym działaniem chemicznym na skrawek (np. utlenianie) lub z gwałtownymi zmianami środowiska (szybkie odwadnianie) skrawki mogą jednak odklejać się od szkiełka podstawowego. Zapobiega się temu przez pokrycie szkiełka przed naklejeniem skrawka cienką warstwą roztworu albumin lub poli-L-lizyny. 10. Odparafinowanie Odparafinowanie – przeprowadzenie przez płyny pośrednie 11. Nawadnianie – przeprowadzenie przez szereg alkoholi o malejących stężeniach: 96%, 80%, 70%, 50% 12. Barwienie W histologii używane są przede wszystkim wodne (rzadziej alkoholowe) roztwory barwników. Przepojone niepolarną parafiną skrawki nie zabarwią się, gdyż cząsteczki barwnika w wodnym środowisku są
"odpychane" przez parafinę. Dlatego z takich skrawków trzeba najpierw usunąć parafinę (przez zanurzenie w ksylenie lub innym rozpuszczalniku organicznym), a następnie przeprowadzić przez szereg roztworów alkoholu o coraz niższych stężeniach (nawadnianie, odwrotność odwadniania), aby w końcu przenieść je do czystej wody. Barwienie: a) naturalne - hematotoksylina (niebieski), - karmin (czerwony) b) sztuczne syntetyczne Najpopularniejszą Najpopularniejszą metodą barwienia jest wykorzystanie barwników kwaśnych (eozyna, floksyna, oranż G) i zasad zasadowy owych ch (hema (hemato toksy ksyli lina na,, błęk błękit it mety metyle lenow nowy, y, safra safrani nina) na).. Barwi Barwieni eniee ma tu chara charakte kterr reakcj reakcjii zobojętniania: barwniki kwaśne wiążą się z tymi strukturami komórkowymi i tkankowymi, które wykazują odczyn zasadowy ( struktury kwasochłonne), jak np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe, itp., nato natomi mias astt barw barwni niki ki zasa zasado dowe we wiąż wiążąą się się ze stru strukt ktur uram amii wyka wykazu zują jący cymi mi odcz odczyn yn kwaś kwaśny ny ( struktury zasadochłonne ), jak np. chromatyna jądrowa (obecność DNA), czy rejony cytoplazmy bogate w rybosomy (obecnoś (obecnośćć RNA). W najpows najpowszec zechnie hniejj stosowa stosowanym nym barwieni barwieniuu przegląd przeglądowym owym z użycie użyciem m hematoks hematoksyli yliny ny i eozyny, jądra komórkowe wybarwiają się hematoksyliną na granatowo, a cytoplazma cytoplazma eozyną na czerwono. W komórkach zawierających liczne rybosomy, cytoplazma barwi się na kolor fioletowy (efekt nałożenia barwy czerwonej i niebieskiej).
progresywne, w którym przerywamy proces Technikę Technikę barwieni barwieniaa można można podziel podzielić ić na barwienie progresywne barwienia w momencie uzyskania pożądanej intensywności koloru, oraz barwienie regresywne, w którym tkankę rozmyślnie przebarwiamy, przebarwiamy, a następnie stosując odpowiednie roztwory odbarwiające doprowadzamy doprowadzamy do wymaganego nasilenia barwy. Może się również zdarzyć, że podczas barwienia progresywnego - zwłaszcza kilkoma różnymi barwnikami - dojdzie wbrew naszej woli do przebarwienia preparatu i trzeba zmniejszyć inte intensy nsywno wność ść kolor koloru. u. Trakt Traktowa owani niee zabar zabarwio wione nego go prepa preparat ratuu roztwo roztworam ramii odbarw odbarwia iają jący cymi mi nosi nosi nazwę nazwę różnicowania i przeprowadza się go oczywiście pod kontrolą mikroskopu. Do różnicowania służą - w zależności od rodzaju użytego barwnika - roztwory alkoholi, kwasów, a także substancji o właściwościach utleniających. 13. Nawadnianie 14. Zamykanie szkiełkiem nakrywkowym za pomocą balsamu kanadyjskiego. Po zabarwieniu i wypłukaniu preparat jest praktycznie gotowy do analizy mikroskopowej - należy go jednak jednak zabezpi zabezpieczy eczyćć przed przed niekorz niekorzystn ystnym ym wpływem wpływem otoczen otoczenia ia (uszkodz (uszkodzeni eniaa mechani mechaniczne czne,, wysycha wysychanie, nie, utlenianie niektórych barwników). Do tego celu służy tzw. zamykanie preparatów, czyli umieszczenie ich pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy oboma szkiełkami substancją, która powinna spełniać dwa podstawowe warunki: powinna powinna posiad posiadać ać taki sam współczy współczynnik nnik załaman załamania ia światła światła jak szkło szkło (w celu celu uni uniknię knięcia cia ugi uginani naniaa i rozpraszania promieni świetlnych na pograniczu środowisk o różnej charakterystyce optycznej); powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spajać oba szkiełka. Oba warunk warunkii najle najlepi piej ej speł spełni niaj ająą niepo niepola larne rne żywic żywicee - albo albo natur natural alne ne (bals (balsam am kanad kanadyj yjski ski), ), albo albo synt syntet etyc yczn znee (DPX (DPX,, Mali Malino nol,l, XAM, XAM, Ente Entell llan an). ). Po Poni niew eważ aż żywi żywice ce te są rozp rozpus uszc zcza zaln lnee jedy jedyni niee w rozpuszczalnikach organicznych, zabarwione preparaty muszą być poddane ponownemu odwodnieniu (tym razem szybkiemu, gdyż dłuższe przetrzymywanie w roztworach alkoholi odbarwia preparaty) i zanurzone w toluenie toluenie lub ksylenie ksylenie (tzw. prześwietlanie). prześwietlanie). Dopiero wówczas preparaty można pokryć kroplą żywicy i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Po wysuszeniu (przez kilka godzin, w temperaturze ok. 60-80°C) oba szkiełka są ze sobą ściśle i hermetycznie spojone, i tak przygotowany preparat zachowuje swe własności optyczne nawet przez kilkadziesiąt lat. W sytuacji, gdy potrzebne jest natychmiastowe zamknięcie preparatu po barwieniu (np. blaknący barwn barwnik ik), ), lub lub gdy prepa preparat ratuu nie nie można można poddać poddać odwod odwodni nieni eniuu i prześ prześwie wietl tlen eniu iu (w niektó niektóryc rychh reakcj reakcjac achh histochemicznych histochemicznych barwny produkt rozpuszcza rozpuszcza się w alkoholu lub rozpuszczalnikac rozpuszczalnikachh organicznych), organicznych), stosuje się mnie mn iejj trwa trwałe łe,, wodn wodnee środ środow owis iska ka zamy zamyka kają jące ce,, któr któree całk całkow owic icie ie speł spełni niaj ająą tylk tylkoo pier pierws wszy zy z dwóc dwóchh wymienionych powyżej warunków. Są to np.: żel glicerolowy (roztwór glicerolu i żelatyny), glicerol w soli
fizjologicznej, roztwór gumy arabskiej i sacharozy, alkohol poliwinylowy. Środowiska te nie zapewniają dłuższej trwałości preparatu (ok. miesiąca); aby ją poprawić, można dodatkowo uszczelnić obrzeża szkiełka nakrywkowego szybko schnącym lakierem.
Zalety metody parafinowej: niskie koszty preparaty są bardzo trwałe, mogą być przechowywane przez wiele lat powstają cienkie skrawki 5-7 mikrometrowe stosun stosunko kowo wo krótk krótkii czas czas trwani trwaniaa proce procedur duryy (1-3 dni od mo momen mentu tu pobra pobrani niaa materi materiał ałuu do otrzy otrzyman mania ia preparatów). Wady metody parafinowej: stoso stosowan wanie ie wysok wysokie iejj tempe temperat ratury ury (50-60° (50-60°C), C), powod powoduj ując ącej ej inak inakty tywac wację ję enzym enzymów ów i obkurc obkurcza zani niee się się niektórych tkanek; konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie z materiału tłuszczów (lipidów); konieczność dodatkowego przygotowania skrawków do barwienia (p. dalej). kruszenie się i rozwarstwianie skrawków przy materiałach twardych lub o niejednorodnej strukturze; znaczne trudności przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni. Technika mrożeniowa
Technika mrożeniowa polega na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie można zatem materiał pokroić na odpowiednio odpowiednio cienkie skrawki bez uprzedniego uprzedniego zatopienia go w substancjach substancjach utwardzających i bez złożonej procedury przygotowawczej (odwadnianie, płyny pośrednie). Technika mrożeniowa ma szereg istotnych zalet: jest krótkotrwała: przy maksymalnie uproszczonej procedurze czas od pobrania materiału do wykonania preparatu nadającego nadającego się do oglądania pod mikroskopem mikroskopem nie przekracza kilkunastu kilkunastu minut. Wykorzystuje się to np. podczas operacyjnych badaniach histopatologicznych; zachowuj zachowujee w materia materiale le biol biologic ogicznym znym wszystk wszystkie ie składni składniki ki chemicz chemiczne ne - również również lipi lipidy, dy, które które ulegaj ulegają ą wypłukaniu podczas zatapiania w parafinie, celoidynie czy niepolarnych żywicach; przebieg przebiegaa w niskiej niskiej temperat temperaturze urze,, która która zapobieg zapobiegaa denatura denaturacji cji białek, białek, zachowu zachowuje je aktywno aktywność ść enzymów enzymów wewnątrzkomórkowych i blokuje procesy autolityczne. Dwie ostatnie zalety sprawiają, że technika mrożeniowa jest szeroko stosowana w histochemii i immunocytochemii. Wady: powstają grube skrawki, które się łamią skrawki nie nadają się do przechowywania Preparaty histologiczne:
- totalne (położone na szkiełko całe fragmenty fragmenty tkanek lub narządów - zazwyczaj zazwyczaj są to wypreparowane wypreparowane warstwy ścian wewnętrznych wewnętrznych przewodów (np. warstwa mięśniowa cewy pokarmowej), pokarmowej), w których bada się przestrzenny układ włókien nerwowych lub sieci naczyniowych. Taki preparat musi być wystarczająco cienki, aby mogło przezeń przechodzić światło) - izolowane - mechanicznie mechanicznie - chemicznie chemicznie - enzymatycznie enzymatycznie - rozmazy (wykonywane z płynów ustrojowych, w których obecne są wolno zawieszone komórki (krew, punkt punktat at szpik szpikuu krwio krwiotwó twórcz rczeg ego, o, płyn płyn mó mózgo zgowowo-rdz rdzen enio iowy, wy, płyny płyny wysię wysiękow kowe), e), a także także z zawie zawiesi sinn komórkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych. Kroplę takiego płynu rozprowadza się na szkiełku podstawowym w taki sposób, aby zawarte w nim komórki utworzyły pojedynczą warstwę. W diagnostyce histopatologicznej wykonuje się rozmazy z materiału pobranego ze śluzówek (jama ustna, nosowo-gardłowa, pochwa) oraz z wydzielin (wydzielina oskrzelowa)) - skrawki skr awki (uzyskane przez pokrojenie pokrojenie materiału na cienkie cienkie "plasterki"z "plasterki"z narządów nar ządów miąższowych, m iąższowych, odwapnionych kości)
- szlify kostne.(uzyskane przez zeszlifowanie zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) (zmineralizowanych) na bardzo cienkie płytki)
