Soluciones Electroforesis
Introducción
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Introducción. Básicamente, la electroforesis se define como un transporte bajo la acción de un campo eléctrico. El parámetro que d etermina el comportamiento de una molécula bajo la acción de un campo eléctrico se denomina movilidad electroforética (“U”) y se define como la velocidad de migración por unidad de campo eléctrico. No existe una relación clara entre dicha movilidad electroforética y el resto de parámetros moleculares, aunque se sabe que depende de forma bastante compleja de la carga, la forma y el tamaño de las moléculas; esto es debido a que, por ejemplo, la carga de las moléculas depende del medio (pH y fuerza iónica) y, además, en disolución las moléculas están rodeadas de un conjunto de iones que forman una esfera de solvatación, de tal forma que bajo la acción de un campo eléctrico se desplaza todo el conjunto, aunque la esfera de solvatación hacia el polo opuesto que la molécula. Existen dos modalidades de electroforesis: • Electroforesis libre. libre . El campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones (figura 1). Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.
Fig. 1. Las moléculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una disolución. • Electroforesis en zona. Es zona. Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y b iología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo (figura 2).
Fig. 2. Electroforesis de zona sobre un soporte. Equipamiento electroforético. Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan los elementos mostrados en la figura 3: • Fuente de alimentación. Proporciona el campo eléctrico mediante dos electrodos, uno positivo (ánodo) y otro negativo (cátodo) entre los que se establece una diferencia de potencial. • Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos. • Soporte electroforético.
Fig. 3. Equipo electroforético. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampón de electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.
El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis responden a un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en 02.2006
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función del soporte que se utilice. En todos los casos, la muestra se dispone inicialmente en una pequeña zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo eléctrico. Para que esta situación sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del proceso de separación, es necesario contrarrestar el efecto de la difusión y las posibles corrientes de convección. Para ello se utilizan reticulados moleculares (el soporte de la electroforesis), que forman un entramado tridimensional que impide o reduce dicha difusión y permite la entrada de agua en sus poros; el tamaño de estos poros debe permitir el paso de moléculas voluminosas como son los ácidos nucleicos y las proteínas. Además, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que interfieran con la migración de las moléculas de la muestra. Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos: • Soportes No Restrictivos Tipo I. El Tamaño de poro no opone impedimento al paso de las moléculas. El agar es el ejemplo más representativo y se obtiene a partir de algas marinas y esta formado por dos tipos de polisacáridos: la agarosa y la agaropectina; ésta última posee varios grupos cargados (grupos carboxilo y sulfato), lo que la hacen inadecuada como soporte electroforético por el efecto electroendosmótico que produce. La agarosa (figura 4) se utiliza ampliamente sobre todo para la separación de ácidos nucleicos y para el análisis de proteínas. Los diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusión (entre 35-95°C), su resistencia física y el grado de electroendósmosis.
Fig. 4. Estructura química de la agarosa, polisacárido lineal formado por la repetición de la estructura básica (agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las características de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales R. La agarosa en polvo se añade sobre el tampón de electroforesis y se calienta a unos 100°C para que se disuelva; la mezcla caliente se deposita sobre un molde colocado sobre un cristal (figura 5). La disolución gelifica al enfriarse, momento en el cual puede retirarse el molde. Las dimensiones y el grosor del soporte corresponden, por tanto, a las del molde y la cantidad de disolución de agar utilizada. Las propiedades del gel de agar se modulan a voluntad variando la cantidad de agar, y así el tamaño de poro, que suele ser lo más crítico, depende de la concentración de agar empleada en la disolución y nunca se conoce con exactitud, ya que durante el proceso de preparación del gel hay pérdidas de agua.
Fig. 5. Preparación de un gel de agarosa. El
molde de plástico se adhiere a una placa de vidrio utilizando grasa. disolución de agarosa caliente se deposita sobre el cristal. Una vez gelificada la agarosa, se retira el molde, quedando el gel preparado para la electroforesis. La
• Soportes Restrictivos Tipo II. El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas. El ejemplo característico son los geles de poliacrilamida, que no sólo evitan la convección y minimizan la difusión, sino que además participan en el proceso de separación. Estos geles son medios porosos en los que el tamaño de poro es similar al de las proteínas, de tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y la separación electroforética depende de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño.
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Factores que afectan a la electroforesis. El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la máxima resolución. • Campo Eléctrico. Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez, depende de diferentes parámetros:
Diferencia de potencial (“V”). Se mide en voltios y es lo que define el campo eléctrico. Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración. Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10.000 voltios.
Intensidad (“I”). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica. Esta relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm: V = I × R
⎧ V ≡ Diferencia de potencial ⎪ ⎨I ≡ Intensidad ⎪R ≡ Resistenci a ⎩
y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas.
Resistencia (“R”). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la concentración del tampón de electroforesis.
Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético. Todo esto justifica, por sí solo, la necesidad de un sistema de refrigeración en las cubetas de electroforesis.
• Muestra. La movilidad electroforética de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye según aumenta su tamaño, ya que mayor es la fricción de la molécula con el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razón, las moléculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta la mínima superficie a igualdad de volumen. Así, moléculas del mismo tamaño y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electroforética diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis. • Tampón. Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las moléculas a separar.
Además, la fuerz a iónica condiciona la movilidad electroforética de las substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegaría a interferir en el sistema. Normalmente, se emplean tampones con fuerzas iónicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la característica que debe ser más controlada, puesto que determina la carga de la muestra. Conviene señalar también que atendiendo a la distribución del tampón, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un único tampón en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y composición diferentes. • Soporte. La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie de fenómenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:
Adsorción. Es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolución, ensanchando las bandas de migración.
Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolución iónica. Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su migración se encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte y otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros (figura 6). Este flujo orientado se llama flujo electroendosmótico. El EEO va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuirá a una mejor resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis
Fig. 6. Efecto electroendosmótico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones migran desplazándose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficie.
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Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes; cuanto más tupida sea la red de fibras, menores serán los poros. El movimiento de las moléculas a través del soporte es más o menos fácil en función de su tamaño respecto al de los poros; aquellas moléculas cuyo tamaño se aproxime al del poro, verá impedido su avance respecto a aquellas cuyo tamaño sea muy inferior. Por esta razón, el soporte actúa como un cedazo que separa o tamiza las moléculas en función de su tamaño.
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