1
1. PENDAHULUAN
Canola merupakan kepanjangan dari Canadian Oil Low Acid. Canola adalah salah satu rape seed (biji-bijian), (biji-bijian), utamanya yang digunakan adalah Oilseed rape (Brassica napus) yang diproduksi oleh petani tanaman Kanada sejak tahun 19! menggunakan pembudidayaan tanaman tradisional dan teknik seleksi ("rown, #$$). %inyak canola digunakan dalam banyak aplikasi, yakni margarine, minyak minyak goreng, dan minyak salad& minyak minyak sayur, selain itu aplikasi yang berkaitan dengan industri adalah industri kosmetik, bahan tambahan makanan, pelumas, dan plastik. "entuk tanaman canola ini dapat dilihat pada Gambar 1.
(a)
(b)
Gambar 1. (a) +etani *ustralia dan lahan canola beserta biji rape seed yang yang telah dipanen, (b) "iji rape seed
%inyak rape seed merupakan merupakan salah satu sumber minyak sayur, dan sering digunakan sebagai minyak salad. 'anaman canola memiliki keunikan tersendiri dibanding minyak biji bijian lainnya, yakni dalam hal kandungan kandungan asam lemak erusit (C##1) yang sangat kecil, yakni # (Kim, #$$9). *sam lemak erusit yaitu asam lemak yang menyebabkan tumpukan
2
asam lemak tinggi pada arteri manusia sehingga sangat berbahaya bagi manusia. *dapun kandungan kimia pada minyak canola dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komponen kimia minyak canola dan produk samping canola
umber icking, (#$$1) +r/ybylski, (#$$) +enurunan kadar asam erusit ini merupakan perkembangan teknologi dari para petani, teknologi yang dilakukan merupakan teknologi tradisional yaitu teknik tradisional, perkawinan silang tanaman dan teknik seleksi. elain memiliki kandungan kandungan asam lemak jenuh yang rendah, minyak canola memiliki kandungan asam lemak tak jenuh tunggal yang sangat tinggi, dimana asam lemak ini tidak akan menurunkan 0, yaitu kolesterol yang baik untuk darah. 0engan kandungan asam lemak tak jenuh yang tinggi maka sangat disarankan bagi kesehatan dalam hal keseimbangan konsumsi antara asam lemak jenuh dan asam lemak tak jenuh, dan merupakan sumber 2itamin "1 yang baik. Canola oil juga kaya akan asam lemak omega-3 dibanding minyak sayur lainnya. 4mega-3 sangat penting bagi tubuh dalam mengurangi resiko penyakit radang seperto penyakit jantung dan kanker. ebagian besar masyarakat mengonsumsi minyak sayur yang tinggi omega-! dan terlalu sedikit omega-3, sehingga konsumsi minyak canola disarankan untuk memenuhi kebutuhan dalam hal asam lemak esensial omega-3. 'anaman 'anaman canola telah banyak dibudidayakan di Kanada, *merika, beberapa negara 5ropa, dan baru-baru ini di *ustralia. ekitar $ tanaman canola yang ada di Kanada merupakan tanaman transgenik, yakni tanaman yang telah mengalami modi6ikasi genetic. 'anaman transgenik canola yaitu canola yang tahan terhadap herbisida, terutama herbisida yang menyerang gulma. %inyak canola telah diterima sebagai 78* (7enerally 8ecogni/ed as a6e) oleh 6ederasi makanan dan obat-obatan *merika, yakni instansi yang mengatur
3
penerimaan maupun larangan makanan dan obat-obatan yang beredar di *merika. *dapun proses pembuatan minyak canola dapat dijelaskan pada Gambar 2 berikut ini
Gambar 2. +roses pembuatan minyak canola (Kim, #$$9).
2. CANOLA TRANSGENIK
aat ini, tanaman canola yang telah mengalami modi6ikasi genetik dapat dibagi menjadi dua macam berdasarkan si6at tanaman yang diinginkan, yaitu 1. 'anaman canola trangenik tahan terhadap herbisida #. 'anaman canola yang mengalami modi6ikasi genetik metabolisme, yakni en/im. +ada makalah ini, canola transgenik yang kami bahas memiliki cakupan yang terbatas, yakni berdasarkan jurnal yang kami temukan. ntuk canola transgenik yang
4
tahan terhadap herbisida, kami hanya membahas dua macam herbisida yang merupakan si6at interest yang akan disisipkan gen-nya pada tanaman canola, yaitu herbisida glyphosate atau glufosinate ammonium dan bromoxynil . ntuk canola yang mengalami modi6ikasi genetik berkaitan dengan metabolisme adalah canola transgenik dengan modi6ikasi oleh ekspresi antisense dari gen pengkode en/im stearoyl-acy carrier protein.
2.1 Canola Transen!" #o$!%!"as! Gen Pen"o$e En&!m Pen$a'lan
"erdasarkan tingkat kebutuhan produsen dalam memproduksi tanaman canola maka tujuan genetic engineering yang digunakan juga berbeda. "erdasarkan kegunaan minyak canola yang bermacam-macam (seperti yang telah dijelaskan pada pendahuluan), maka susunan gen dalam tanaman juga perlu diperhatikan. +ada canola transgenik yang mengalami modi6ikasi pada susunan gen pengkode en/im ini memiliki tujuan produksi yang berbeda dengan canola transgenik tahan herbisida. +ada canola transgenik ini, modi6ikasi gen yang dilakukan bertujuan untuk menghasilkan produk minyak canola yang memiliki karakteristik 6isik dan kimia sebagai minyak goreng. eperti yang telah diketahui sebelumnya bahwa minyak canola memiliki kandungan asam lemak jenuh yang rendah dan asam lemak tak jenuh yang tinggi. al ini memang sangat berman6aat bagi kesehatan jika dijadikan sebagai minyak sayur atau minyak salad yang dijadikan sebagai pelengkap makanan penutup. *kan tetapi, karakteristik ini tidak diinginkan dalam industri minyak goreng, karena kandungan asam lemak tak jenuh pada minyak akan berbahaya bagi kesehatan. al ini disebabkan oleh asam lemak tak jenuh akan mengalami polimerisasi atau penggumpalan jika digunakan untuk menggoreng baik secara deep frying maupun hanya dipanaskan saja. elain itu, akan terbentuk trans fatty acids serta radikal bebas yang bersi6at toksik dan karsinogenik. elama penggorengan, perubahan karakterisik 6isik dan kimia pada minyak sangat berpengaruh pada kualitas minyak goreng. al ini dapat dilihat dari perubahan minyak setelah mendapat perlakuan panas, yaitu bagaimana tingkat degradasi, oksidasi, dan hidrolisis yang terjadi pada komponen-komponen penyusun minyak, utamanya asam lemak. Kecepatan dekomposisi ini tergantung pada komposisi minyak, suhu yang digunakan, lama penggorengan, tipe makanan yang digoreng (+etukho2, 1999). 0ari beberapa 6aktor itu,
5
tingkat ketidakjenuhan dari minyak merupakan 6aktor yang paling penting dalam kestabilan penggorengan pada minyak. 4leh karena itu, tingginya kandungan asam lemak tak jenuh utamanya asam linoleat (C13), yaitu sebesar 9-11,
menyebabkan minyak canola
memiliki keterbatasan dalam kestabilan penggorengan dan cenderung berbahaya bagi kesehatan. 4leh karena itu, dibutuhkan modi6ikasi secara genetik untuk mengurangi kadar asam lemak tak jenuh pada tanaman canola dan yang perlu dilakukan adalah modi6ikasi gen pengkode en/im dalam sintesis asam lemak tak jenuh. *sam lemak tak jenuh yang ada pada tanaman canola yaitu asam oleat C11 (%:*), asam linoleat C1# dan asam linolenat C13 (+:*). *sam lemak ini memiliki persentase yang cukup tinggi dalam canola, sedangkan asam lemak jenuh yang ada dalam canola dalam jumlah sedikit adalah asam palmitat (C1!$) dan asam stearat (C1$). %odi6ikasi pada sintesis asam lemak ini dilakukan pada gen pengkode en/im stearoyl- acyl carrier protein (stearoyl-*C+) desaturase (5C 1.1;.99.!), yaitu en/im yang berperan dalam katalisis pada inisiasi proses pengurangan tingkat jenuh pada asam lemak pada biosintesis asam lemak. 5n/im inilah yang memiliki peran dalam mengatur komposisi asam lemak jenuh (asam stearat) dan asam lemak tak jenuh (asam lemak). 8eaksi biosintesis dapat dilihat pada Gambar .
%odi6ikasi gen pada sistem biosintesis asam lemak pada minyak sayur telah banyak diteliti, seperti pada pengurangan asam erusit dari minyak canola (Knut/on, 1991), pengurangan asam linoleat pada minyak rami, dan peningkatan asam stearat hingga enam kali lipat dari tanaman semula (wild type) safflower (hingga di atas 1#) dan kedelai (hingga di atas 3$). "eberapa penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan komposisi asam lemak yang diinginkan yang sesuai dengan tujuan industri dan dapat digunakan sebagai minyak edible. %etode yang dilakukan dalam modi6ikasi gen ini adalah metode antisense 8<*, metode ini dirasa cukup e6ekti6 dalam pengurangan jumlah en/im tertentu dalam suatu tanaman. "iosintesis asam lemak terjadi pada seluruh jaringan tanaman, sehingga akan lebih e6isien jika teknologi antisense 8<* ini dilakukan pada 6ase benih, maka ekspresi gen akan dilihat pada 6ase benih dewasa tanpa menggangu biosintesis pada membran sem daun dan jaringan lainnya pada tanaman. =enis benih yang akan dimodi6ikasi gen pengode en/imnya ada dua spesies yakni Brassica napa dan Brassica napus.
Gambar . 8eaksi desaturasi dan elongasi pada sintesis asam lemak. (5stiasih, #$1$)
6
+rinsip dari teknologi antisense ini adalah gen yang akan dikloning digabungkan (ligasi) dengan 2ektor dalam orientasi yang berkebalikan. al ini berarti ketika gen kloning direkam oleh 8<* akan dihasilkan m8<* yang bersi6at kebalikan dari normal gen. ehingga bisa disebut bahwa komplemen 8<* ini merupakan antisense dari 8<* gen normal, terkadang ada yang menyebut as8<* ("rown, 1991). 8<* antisense dapat menghambat terjadinya sintesis produk dari gen yang mengkode. al ini disebabkan oleh gabungan antara m8<* dan antisense 8<* yang membentuk untai ganda terdegradasi oleh en/im ribonuklease dan tidak dapat dikenali oleh ribosom, sehingga tidak terjadi proses penerjemahan asam amino (translasi). skema dari teknologi ini dapat dilihat pada Gambar *.
Gambar . kema dari pelaksanaan teknologi 8<* *ntisense (+ur2es et al ., #$$$) Keterangan untai ganda berwarna biru adalah 0<*
#e+o$e $an #a+er!al
*dapun beberapa tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi 1. Isolas! "lon ,DNA $ar! en&!m $esa+rase s+earo-lACP c0<* yang diinginkan diperoleh dari plasmid 2ektor pC7<1>$3 yang diperoleh
dari penelitian sebelumnya (amilton, 199$). +lasmid ini dikonstruksi dari poli8<* Brassica rapa dan en/im restriksi yang digunakan adalah 5co8?. %elalui pendekatan dari penelitian sebelumnya mengenai klon c0<* en/im desaturase stearoyl-*C+ pada minyak jarak (#3), diperoleh ! klon hibrid yang dimurnikan, dan hanya satu saja yang diambil yaitu pada plasmid pC7<3#3@. 0iketahui pada pC7<3#3@, asam-asam amino penyusun en/im ini
7
terdiri dari 3# asam amino dan 1;9@ pasang basa. ?denti6ikasi dari klon c0<* en/im ini telah dicocokkan secara homologi dengan seAuens en/im desaturase stearoyl-*C+ pada tanaman bunga matahari dan jarak yang telah dipublikasikan ('hompson, 1991 hanklin, 1991 Knut/on, 1991). 2. Kons+r"s! /lasm!$ :ragmen ind??? dan +2u?? pada pC7<3#3@ mengkode empat asa m amino untuk
ujung amino dan sembilan asam amino untuk ujung karboksil dari protein prekursor en/im desaturase stearoyl-*C+ yang akan digunakan dalam produksi kontruksi antis ense pada benih. 4rientasi antisense dilakukan dua sekuens yaitu pada seAuens regulator en/im stearoyl-*C+ pada gen napin B. napa yaitu 1,> kb untuk ujung @B dan 1, #@ kb untuk ujung 3B, dan seAuens regulator dari gen *C+ biji B. rapa yaitu 1,@ kb untuk ujung @B dan 1,@ kb untuk ujung 3B. Kedua gen antisense ini diinsersikan di antara sisi ba? dan Kpn? pada plasmis pC7<1@@> untuk memproduksi plasmid pC7<3#;#, yang merupakan gen antisense dari en/im desaturase stearoyl-*C+. kema orientasi sekuens 8<* ini dapat dilihat pada Gambar 0.
Gambar 0. kema 8<* antisense dari gen pengkode en/im desaturase stearoyl-*C+ umber Knut/on (1991)
. Trans%ormas! /a$a +anaman +emindahan plasmid rekombinan dilakukan oleh mediator bakteri *grobacterium.
Explant tanaman hipokotil yang telah berumur > hari yang telah mengalami pretreatment diinkubasi dengan *grobacterium yang telah disisipkan plasmid. +lasmid telah berpindah ke dalam jaringan kalus setelah dua hari dikulti2asi dengan *grobacterium. 'anaman yang dijadikan control adalah benih yang ditanam dalam rumah kaca atau explant hipokotil tanpa disisipkan *grobacterium. *dapun beberapa pengamatan yang dilakukan adalah a. 'ujuh hari kemudian, explant dipindah ke dalam media regenerasi tunas, b. @ D 9 minggu setelah inisiasi kultur, tunas yang berwarna hijau tumbuh dari kalus yang ditanam pada media seleksi kanamisin, c. 0ua minggu kemudian, tunas dipindah ke dalam media induksi akar yang mengandung kanamisin juga,
8
d. 0aun yang tumbuh diuji akti2itas neomisin 6os6otrans6erase dengan uji dot blot, e. etelah menghasilkan biji, maka akan dibandingkan dengan biji yang dihasilkan tanaman control. *. Sele"s! en re"omb!nan %asuknya gen rekombinan ke dalam jaringan kalus diuji melalui ada tidaknya gen
resisten terhadap antibiotik kanamisin. *danya gen resisten ini ditunjukkan dengan adanya germinasi benih yang ditumbuhkan pada analog kanamisin (7;1), atau suatu media yang dapat menguji ada tidaknya akti2itas sel akibat gen resisten antibiotik kanamisin. 'elah diketahui bahwa tunas yang telah berakar dan kotiledon resisten terhadap 7;1. 0. Anal!s!s asam lema" ampel yang berupa biji yang matang dan belum diuji melalui reaksi metanolisis
asam (#>) dan metil ester yang terbentuk akan diuji melalaui Gas Chromatography kapiler. Komposisi asam lemak dalam bentuk persentase akan diketahui melalui perbandingan antara luas area puncak dan standar internal trigliserida 1>$. . U! en&!m $esa+rase s+earo-lACP ji ini dilakukan untuk mengetahui berapa besar akti2itas en/im desaturase stearoyl-
*C+. 3. De+e"s! /ro+e!n en&!m $esa+rase s+earo-lACP
"enih yang telah dewasa diekstrak dalam potassium 6os6at dengan jumlah tertentu. ebanyak #$ mikroliter ekstrak diuji proteinnya dengan elektro6eresis. +rotein en/im desaturase dilihat dengan kit immunodetection dibandingkan dengan desaturase pada safflower ('hompson, 1991).
Has!l
0ari @$ tanaman transgenik (tanaman dengan ode 3#;#-'-1) yang diuji, diperoleh dua kelas yang dibagi berdasar komposisi asam stearatnya. Kelas pertama berisi tanaman yang berjumlah #1 buah, yang memiliki komposisi asam stearat yang tinggi yakni berkisar (#1,@ D 3# ), sedangkan kelas yang kedua dengan jumlah #9 buah, yaitu tanaman dengan komposisi asam stearat yang rendah, hampir sama dengan tanaman kontrol yakni 1,$ D 1, !. Kenaikan persentase asam stearat disertai dengan penurunan persentase asam oleat, yang merupkan produk dari en/im desaturase stearoyl-*C+. ntuk jumlah palmitat yang merupakan precursor bagi stearat tidak mengalami perubahan yang signi6ikan dengan adanya modi6ikasi gen pengkode en/im ini. Komposisi asam lemak dari dua kelas tanaman
9
transgenik ini dapat dilihat pada Gambar . 0ari hasil perbandingan antara dua kelas ini yakni #1 #9 menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signi6ikan dengan teori perbandingan insersi dari konstruksi antisense 8<* yang diharapkan yakni 1 1.
Gambar . Komposisi asam lemak dari dua kelas tanaman transgenik B. rapa 3#;#-' umber Knut/on (1991)
0ari hasil uji akti2itas en/im desaturase stearoyl-*C+, menunjukkan bahwa tidak dideteksi adanya akti2itas en/im pada tanaman yang mengandung asam stearat banyak, tidak seperti akti2itas en/im yang terjadi pada tanaman yang masih normal. al ini dapat disebabkan karena biosintesis akan terhenti jika akumulasi asam stearat yang dihasilkan terlalu banyak, sedangkan en/im yang ada tidak dapat mengimbangi banyaknya stearat yang dihasilkan. +emisahan 6enotip tinggi stearat, penekanan akti2itas en/im desaturase stearoyl*C+, dan pengurangan le2el protein desaturase mengindikasikan bahwa tana man transgenik
10
3#;#-' mengandung insersi 6ungsional antisense 8<*. Komposisi asam stearat beserta akti2itasnya en/imnya dapat dilihat pada Tabel 2.
11
'abel #. Komposisi asam stearat dan akti2itas en/im desaturase stearoyl-*C+.
umber Knut/on (1991)
aat germinasi, tanaman transgenik 3#;#-' hanya mampu bergerminasi sebesar @3 jika dibandingkan tanaman control sebesar 1$$. al ini ada kaitannya dengan tingginya jumlah stearat pada tanaman, terutama dari sisi 6enotip yang dihasilkan. 7erminasi yang terjadi sangat lemah, pelindung biji berwarna cerah dan embrio berwarna hijau-oli2e yang jika dibandingkan dengan tanaman control yang berwarna kuning. *danya perubahan komposisi lemak ini dapat mempengaruhi metabolism sel semua jaringan, dan untuk menyembuhkan tanaman ini maka diberi perlakuan tambahan yaitu pertunasan dipindah pada medium yang berisi garam jenis "@, # sukrosa dan 2itamin (Knut/on, 1991). 0ari 3> tanaman yang dapat disembuhkan yang kemudian dilakukan uji resisten kanamisin, maka dihasilkan ## tunas yang dapat tumbuh akarnya pada media kanamisin, dan 1;-1@ tunas tidak dapat tumbuh media kanamisin, sehingga dapat disimpulkan bahwa yang tidak tumbuh akar merupakan tanaman dengan tipe wild . 0ari hasil ini, dapat disimpulkan bahwa komposisi asam lemak dalam minyak tertentu, utamanya minyak rape seed komersial dapat diatur dengan teknologi rekayasa genetik. Konstruksi gen desaturase stearoyl-*C+ antisense merupakan cara yang e6ekti6 untuk meningkatkan persentase asam stearat dari dua jenis canola, yaitu B. napa dan B. napus. Kenaikan asam stearat pada tanaman transgenik tidak mengubah komposisi lipid dari beberapa jaringan tanaman, seperti daun.
12
0ari penelitian jurnal ini dapat disimpulkan bahwa tanaman rape seed penghasil minyak canola yang memiliki persentase asam stearat tinggi karena mengalami modi6ikasi gen en/im desaturase stearoyl-*C+. 'anaman transgenik ini dapat dapat digunakan dan dipertimbangkan untuk dilanjutkan dalam produksi komersial minyak ca nola yang memiliki stabilitas dalam penggorengan yang baik. elain itu, penelitian ini dapat dijadikan bahan untuk mempelajari regulasi pada metabolism lipid, terutama biosintesis asam lemak. *khirnya, peningkatan kadar asam stearat pada minyak canola melalui rekayasa genetic dapat memprediksi keberhasilan modi6ikasi gen komposisi minyak sayur atau minyak salad. 2.2 Canola Transen!" Ta'an Herb!s!$a
ebuah uji keamanan telah dilakukan pada makanan yang berasal dari canola, yang telah genetiknya dimodi6ikasi menjadi toleran terhadap kelompok herbisida oEynil yang terdiri dari bromoEynil dan ioEynil. Canola hasil rekayasa genetic dipasar kan sebagai canola jenis
13
#o$!%!"as! ene+!"a /a$a ,anola
%etode yang digunakan dalam modi6ikasi genetik Canola ("rassica napus . olei6era %et/g.) ine Festar berubah dengan /lasm!$ /RPA4L105a menggunakan metode *grobacterium tume6aciens-mediated trans6ormasi. train (non phytopathogenic yaitu) dari *grobacterium tumi6aciens, 5* 1$1 yang digunakan (ood et al 19!). *grobacteriummediated sistem trans6ormasi dipahami dengan baik, dan secara luas digunakan dalam bioteknologi tanaman (Gambryski 199#). 8egenerasi tanaman berubah dilakukan di hadapan bromoEynil sebagai satu-satunya agen selekti6. 'rans6ormasi ini menghasilkan pemilihan trans6ormasi tunggal - Festar-4Ey-#3@ - yang kemudian digunakan dalam persilangan seksual dengan elit baris canola untuk menghasilkan 2arietas kanola
tm
digunakan
dalam komersial produksi. 6ns! $an Pera+ran en no7el
'rans6ormasi kanola dengan plasmid p8+*-"-1@$a menghasilkan trans6er dari ekspresi gen tunggal kaset. 7enetik elemen yang terkandung dalam gen kaset ekspresi dijelaskan pada Tabel di bawah ini dan organisasi mereka digambarkan dalam Gambar 3. Tabel . 0eskripsi dari kaset ekspresi gen yang terkandung dalam p8+*-"-1@$a
Se"en Gen
3@ promoter
5nhance r
Smber
Hirus mosaik kembang kol (Ca%H) +romoter 3@ wilayah (7ardner et al 191).
+emimpin non-diterjemahkan dari 8u"isC4 gen subunit kecil berasal dari jagung (ebrun et al 19>).
6ns!
ebuah promotor untuk tingkat tinggi konstituti6(terjadi di semua bagian tanaman dan pada semua tahap pengembangan) gen ekspresi dalam jaringan tanaman.
14
oxy
7en diisolasi dari Klebsiella subspesies pneumoniae o/aenae pengkodean nitrilase en/im talker (et al 19).
?nacti2ates bromoEynil herbisida dan menganugerahkan toleransi bromoEynil bila diekspresikan pada tanaman.
<4 3B
3 Inon wilayah-diterjemahkan dari sintase nopaline gen diisolasi dari *grobacterium tume6aciens plasmid p'i3> ("e2an et al 193).
"erisi sinyal untuk penghentian transkripsi dan mengarahkan polyadenylation.
Gen o8-
7en oEy diisolasi dari bakteri tanah subspesies bakteri Klebsiella pneumoniae. 4/aenae dan mengkodekan en/im yang memetabolisasikan bromoEynil herbisida (talker dan %c"ride 19>). 11@$ pasangan basa gen oEy telah sepenuhnya diurutkan dan dikodekannya en/im, nitrilase, telah sepenuhnya ditandai (talker et al 19). Ketika ditrans6er menjadi tanaman, gen yang telah dikode susunan asam aminonya menghasilkan si6at yang toleran keluarga oEynil herbisida termasuk bromoEynil dan ioEynil. %ekanisme toleransi melibatkan detoksi6ikasi herbisida oleh en/im nitrilase. 0egradasi ini e6ekti6 untuk inakti2asi herbisida dan memungkinkan tanaman bisa hidup dan terus tumbuh meskipun diberikan perlakuan aplikasi herbisida. Unsr ene+!" La!n-a
'he p8+* plasmid-"-1@$a adalah perbatasan ganda tanaman 2ektor trans6ormasi biner yang berisi segmen 0<* dikarakterisasi dengan baik diperlukan untuk seleksi dan replikasi plasmid pada bakteri serta kanan dan kiri terhadap batas perbatasan daerah 0<* ('-0<*) yang ditrans6er ke tanaman genom 0<* (Tabel 2). ?ni adalah wilayah di mana ekspresi gen kaset dimasukkan. 0<* berada di luar daerah '-0<* biasanya tidak bisa ditrans6er ke tanaman 0<* genom (Gambryski 199#). emua kloning 0<* dan konstruksi 2ektor dilakukan dengan menggunakan host bakteri 5scherichia coli 0@J, turunan dari laboratorium umum 5. coli K-1# strain.
15
Gambar 3. 4rganisasi gen pada rekayasa genetic canola toleran herbisida
Kara"+er!sas! en $! +anaman
+emilihan baris tanaman tanaman terjadi setelah trans6ormasi Festar dengan p8+*"-1@$a, regenerasi plantlet yang diambil dari kultur jaringan dan dipindahkan ke tanah. 'anaman berubah kemudian diuji untuk toleransi herbisida, serta karakteristik agronomis lainnya, dalam rangka pilih acara trans6ormasi terbaik. ine Festar-4Ey-#3@ kemudian dipilih dan digunakan untuk semua studi lebih lanjut, serta untuk seksual persilangan dengan garis elit.
16
Kara"+er!sas! /en-!s!/an TDNA
outhern blotting (outhern 19>@) digunakan untuk mengkarakterisasi '-0<* dimasukkan dalam hal menyisipkan jumlah (jumlah kejadian integrasi), integritas masukkan (ukuran gen), dan urutan luar perbatasan '-0<* (termasuk gen resistensi gentamisin dan plasmid asal replikasi). 7enomik 0<* diisolasi dari jaringan daun dari garis induk non berubah, Festar dan dari generasi '3 dari garis kanola berubah, Festar-4Ey-#3@. ntuk menentukan jumlah 0<*-' yang tersisipkan, 0<* genom dicerna dengan baik 5co81 atau ind???, yang berada pada @ Idan 3I ujung gen oksigen, masing-masing (lihat 7ambar 1). =umlah pita hasil hibridisasi terdeteksi akan mewakili jumlah salinan hadir oksi gen di dalam genom tanaman, dan karena itu ber6ungsi sebagai indikator jumlah insersi '-0<*. 0alam waktu tertentu, hanya satu band hybridising yang terdeteksi, menunjukkan bahwa hanya satu salinan gen oksigen adalah hadir dalam Festar-4Ey-#3@. 'idak ada band hybridising terdeteksi dalam 0<* genom terisolasi dari kontrol non-berubah. ntai ganda pada 0<* genom baik 5co81 maupun ind??? menghasilkan sebuah band hybridising tunggal sesuai dengan ukuran dari daerah pengkode gen oksigen (11@$ pb). al ini menunjukkan bahwa seluruh coding daerah telah ditrans6er. ntuk menentukan jika ada urutan dari luar perbatasan '-0<* telah dipindahkan ke genom tanaman, 0<* genom dari kedua-Festar 4Ey-#3@ dan parental control telah diperiksa dengan 6ragmen 0<* yang sesuai untuk wilayah-3## ori dari p"83##. 'idak ada band hybridising yang terdeteksi, menunjukkan bahwa asal mula replikasi bakteri telah belum ditrans6er. *nalisis +C8 digunakan untuk menentukan apakah gen resistensi gentamisin telah ditrans6er selama proses trans6ormasi. 0<* diekstraksi dari jaringan daun dipanen dari Festar-4Ey-#3@ dan garis parental control digunakan dalam analisis. +lasmid 0<*, yang mengandung gen resistensi gentamisin, digunakan sebagai bahan re6erensi dan positi6 kontrol untuk analisis. 'idak ada 6ragmen 0<* gentamisin-spesi6ik dapat ampli6ikasi dari 0<* diekstraksi dari Festar-4Ey-#3@, menunjukkan bahwa gentamisin yang gen resistensi belum ditrans6er. S!%a+ Dar! #o$!%!"as! Gene+!"
"romoEynil-toleran canola line Festar-4Ey-#3@ dihasilkan oleh pengalihan oksi gen dari bakteri tanah Klebsiella oaena, dengan menggunakan *grobacterium-mediated
17
trans6ormasi sistem. Kode gen oEy untuk nitrilase en/i m, yang mengubah bromoEynil herbisida (3,@-dibromo ;hydroben/onitrile) ke dalam non-phytotoEic metabolit 3,@-dibromo;-hidroksiben/oat asam (0"*). 'idak ada gen lain ditrans6er dan kanola berubah itu terbukti 6enotipik dan genotypically stabil oleh studi segregasi dan pemetaan. modi6ikasi tidak melibatkan trans6er dari setiap gen resistensi antibiotik. Kara"+er!sas! /ro+e!n no7el
+rotein baru, nitrilase, merupakan spesi6ik en/im untuk herbisida oEynil. al ini ditemukan mudah terdeteksi dalam ekstrak daun dari tanaman dimodi6ikasi, tetapi hanya hadir di sangat rendah tingkat di biji. 'idak ada protein terdeteksi ditemukan di minyak sulingan. 'oksisitas potensial dan alergenisitas dari nitrilase dianggap dalam penilaian. +rotein dari keluarga yang sama seperti nitrilase yang mana-mana di seluruh binatang dan kerajaan tumbuhan, dan dikonsumsi oleh hewan dan manusia.
. PE#ASARAN G#CANOLA
0ari beberapa
18
dari !$ pengguna man6aat canola. 0ata konsumen canola dapat dilihat pada 'abel ;.
Tabel .
umber 0ept. o6 *griculture (#$$)
Tabel *. 0ata domestic konsumsi dari canola & rape seed
umber 0ept. o6 *griculture (#$$)
Kanada merupakan $ dalam perdagangan canola. 0alam 1$ tahun terakhir (berakhir #$$>&#$$), ekspor Kanada mengalami peningkatan dari ;.$$$ menjadi @.$$$ ton. +engekspor utama Canada yaitu =epang, yaitu berkisar ;$ dari keseluruhan perdagangan canola yang terjadi di
19
Kanada, kemudian diikuti +akistan, Cina, dan %eksiko. 0ata ekspor canola yang terjadi di Kanada dapat dilihat pada Tabel 0.
Tabel 0. 0ata ekspor canola di Kanada
umber Canola Council o6 Canada (#$$9)
*. DA#PAK KESEHATAN9 GI:I9 $an LINGKUNGAN
0alam hal ini, masih banyak pro dan kontra mengenai e6ek pangan transgenik terhadap kesehatan manusia dan lingkungan. 0alam makalah ini, penyusun mengemukakan e6ek pangan transgenik terutama 7% canola pada kesehatan dan lingkungan di *ustralia. al ini dirasa telah mewakili semua
*danya trans6er gen resisten antibotik dari pangan 7% ke dalam tubuh manusia dan hewan
20
•
+embentukan allergen baru atau perpindahan dari pangan tradisional ke dalam 2arietas transgenik
•
ji keamanan pangan tertentu masih belum membuktikan bahwa pangan 7% aman.
"egitu pula e6ek canola transgenik dalam hal lingkungan, masih banyak beberapa potensi permasalahan yang belum terselesaikan hingga saat ini. *dapun permasalahan lingkungan yang berkaitan dengan canola transgenik adalah •
*danya kejadian terbentuknya superweed L yaitu gulma yang dapat bertahan dan resisten terhadap herbisida, sehingga petani harus menggunakan herbisida yang sangat beracun untuk mengontrol gulma yang terin6eksi gen resisten herbisida.
ntuk mencegah kesalahpahaman konsumen terhadap pangan transgenik canola, maka diperlukan pelabelan yang jelas. 'etapi dalam sebuah penelitian yang mencakup tentang produk canola trasnsgenik toleran terhadap herbisida. 0alam penelitian ini, 6aktor kunci adalah
kebutuhan untuk menetapkan bahwa makanan yang bergi/i cukup dan akan mendukung pertumbuhan yang khas dan kesejahteraan. 0alam kebanyakan kasus, ini dapat dicapai melalui pemahaman tentang genetik modi6ikasi dan konsekuensinya, bersama-sama dengan analisis komposisi luas makanan. 0imana, berdasarkan data yang tersedia, masih ada kekhawatiran atau keraguan dalam hal ini, oleh karena itu kita perlu hati-hati untuk kasus studi makan pada hewan dapat memberikan jaminan-ulang lebih lanjut bahwa makanan yang bergi/i cukup. tudi tersebut dapat dianggap perlu jika analisis komposisi menunjukkan perbedaan yang signi6ikan dalam sejumlah komponen atau nutrisi yang penting, atau di mana ada kekhawatiran bahwa bioa2ailabilitas kunci nutrisi dapat dikompromikan oleh si6at perubahan genetik untuk makanan. 0alam kasus yang berasal dari minyak canola transgenic toleran terhadap herbisida memperlihatkan data komposisi untuk menunjukkan kecukupan gi/i minyak.
21
dilakukan di sesuai dengan +rinsip-prinsip 45C0 +raktik aboratorium yang "aik (45C0, 19#). 0ari hari 1 sampai #, setiap jenis kue diberikan l ibitum pada 1$ konsentrasi untuk kelompok lima jantan dan lima ekor tikus betina. tanda-tanda klinis dicatat setidaknya sekali sehari selama penelitian. pemeriksaan 6isik tambahan terperinci dilakukan mingguan. bobot 'ubuh diukur pada hari -1, 1, , 1@, dan ## dan pada akhir pengorbanan. "erat makanan yang diberikan kepada setiap binatang dan yang tersisa di akhir periode konsumsi makanan tercatat untuk setiap minggu di seluruh periode pengobatan. 0ari catatan, konsumsi rata-rata mingguan dihitung untuk tikus masing-masing. 'umpahan makanan juga dicatat. ntuk studi patologi klinis sampel darah, dikumpulkan sebelum nekropsi. +ada pengujian nekropsi makroskopik eksternal permukaan, lubang dan seluruh tubuh major ca2ities, organ dan jaringan telah dilakukan. etiap temuan makroskopik signi6ikan dicatat dan jaringan (kelenjar adrenal, jantung, ginjal, hati dan limpa) sampel yang diambil. Has!l
'idak ada kematian dan tidak ada tanda-tanda klinis toksisitas dalam kelompok. =uga tidak berat badan rata-rata, rata-rata konsumsi harian, hematologi atau kimia klinis dipengaruhi oleh jenis canola diberikan. 0emikian juga, tidak ada perbedaan yang terlihat pada makroskopik obser2asi, atau pemeriksaan mikroskopis organ sampel. +ada tingkat inklusi 1$ dari kue kanola dalam pakan, karena itu, tidak ada perbedaan antara kontrol dan kanola transgenik dalam kemampuan mereka untuk mendukung pertumbuhan dan baik menjadi tikus. 'idak ada gangguan kesehatan masyarakat yang potensial dan masalah keamanan telah diidenti6ikasi dalam penilaian canola line Festar-4Ey-#3@. *tas dasar aplikasi data yang diajukan sekarang, dan in6ormasi lain yang tersedia, minyak berasal dari bromoEyniltolerancanola line Festar-4Ey-#3@ dianggap aman dan bergi/i sebagai minyak halus berasal dari 2arietas kanola kon2ension. 0apat disimpulkan bahwa makanan dari produk canola transgenik toleran terhadap herbisida telah die2aluasi untuk nya keamanan untuk konsumsi manusia. ejumlah kriteria yang digunakan dalam kajian ini termasuk karakterisasi gen, as al mereka dan 6ungsi, perubahan pada 0<*, protein dan tingkat makanan keseluruhan stabilitas gen canola yang diperkenalkan di genom, komposisi analisis, e2aluasi dan perubahan dimaksud tidak diinginkan, dan yang alergenisitas potensi dan toksisitas dari protein yang baru diungkapkan.
22
0. REGULASI
+ada tahun #$$, genetically modi6ied (7%) canola tahan herbisida telah dikomersialisasikan si *ustralia untuk pertama kalinya, yakni dalam skala kecil di
+roduk pangan tidak dapat diimpor jika mengandung 2arietas 7% yang
•
dilarang, Canola dapat diimpor jika mengandung 2arietas 7% yang diijinkan, 'erdapat toleransi sebesar @ untuk keberadaan non 7% pangan dalam
•
•
pangan 7% yang diimpor, 'erdapat toleransi sebesar 1 untuk keberadaan 2arietas 7% pada bahan pangan yang telah diijinkan oleh
•
=epang, ji regular pangan dan impor bahan baku impor dilaksanakan oleh Kementrian +ertanian, Kehutanan dan +angan, serta Kementrian
•
Kesejahteraan dan Kesehatan %asyarakat +rotocol Cartagena dalam Keamanan "iology digunakan di =epang sejak =anuari #$$;.
#. %eksiko %eksiko merupakan pelanggan utama *merika erikat dalam hal produk • •
pertanian, sehingga mengkuti peraturan dalam *merika erikat, %eksiko telah menjadi anggota +royokol Cartagena sejak eptember #$$3.
23
3. China •
+roduk yang diimpor harus memiliki ijin dalam penggunaan dan penjualan produk
•
'elah di2eri6ikasi keamanan produk bagi manusia, hewan, lingkungan, dan institusi yang terkait dengan pengukuran keamanan. •
eluruh pangan 7% yang dijual di Cina harus dilabel secara jelas
;. +akistan •
%engijinkan segala impor pangan 7% untuk pangan dan bahan baku, larangan impor dari Kanada telah dibatalkan sejak tahun #$$3 •
+akistan masih belum bergabung dalam +rotokol Cartagena.
@. *merika serikat •
Mang terpenting dalam penerimaan produk 7% adalah ijin dari (1) #$ %epartment of &griculture &nimal and 'lant ealth nspection $er*ice (#) En*ironmental 'rotection &gency dan (3) #$ %epartment of ealth and uman $er*ices +ood and %rug &dministration. •
*merika erikat belum menjadi anggota +rotokol Cartagena.
!. ni 5ropa •
ni 5ropa telah menerima adanya produk 7%4 dalam jumlah tertentu, tergantunga tanaman transgenik yang akan diimpor, secara garis besar peraturan dalam ni 5ropa sangat ketat untuk mengimpor dan proses serta bukan untuk makanan dan pembudidayaan
•
ni 5ropa mengijinkan keberadaan 7%4 yang tidak memenuhi persyaratan dengan toleransi $,@ untuk impor, perijinan ini dikeluarkan oleh European +ood $afety &uthority.
•
ni 5ropa merupakan anggota +rotokol Cartagena, arus ada pelabelan yang jelas bagi produk 7%, terutama status 7% dan ketersediaan traceability.
>. Kanada •
"adan yang mengatur perijinan impor adalah Canadian +ood nspection &gency Kanada beum menjadi anggota +rotokol Cartagena
24
. "angladesh •
"angladesh tidak mempunyai mekanisme khusus untuk mendeteksi adanya rekayasa genetic terhadap organism dalam komoditas impor, begitu pula perijinan bagi produk yang mengandung organism rekayasa biologi. ecara konsekuen, "angladeh tidak melarang impor dari berbagai komoditas meskipun status produk tersebut adalah produk rekayasa biologi "angladesh tergabung dalam +rotokol Cartagena.
25
RE6ERENCES
"rown, =. ynne. #$$. Pbl!,a+!on o% Canola O!l. +ennsyl2ania *griculture ciences +ennsyl2ania tate ni2ersity. "rown '.*. 1991. Gene Clon!n. K Chapman and all, hal 3$#-3$;. Canola Council o6 Canada. #$$9. Cereals an$ O!lsee$s Re7!e; S+a+!s+!,s Cana$a < Cana$!an Gra!n Comm!ss!on. 8etrie2ed #$ *pril #$$9, 6rom Canola Council o6 Canada website http&&www.canola-council.org&currseedeEp.aspE 5stiasih, '. #$1$. 4!os!n+es!s Asam Lema"9 D!"+a+ Kl!a' 4!o"!m!a. %alang :akultas 'eknologi +ertanian icking 0. #$$1. Canola #eal = 6ee$ In$s+r- G!$e . 8etrie2ed 1 :ebruary #$$, 6rom Canola Council o6 Canada website www.canola-council.org Kim, on. #$$9. In%orma+!on Pa/er %or Gene+!,all- #o$!%!e$ Canola . *ustralia %inisterial 7%4 ?ndustry 8e6erence 7roup. +r/ybylski 8. #$$. Canola O!l P'-s!,al An$ C'em!,al Pro/er+!es. 8etrie2ed 1 :ebruary #$$, 6rom Canola Council o6 Canada website www.canolacouncil.org +etukho2, ?., %alcolmson, .=., +r/ybylski, 8., *mstrong, . 1999. 6r-!n Per%orman,es o% Gene+!,all- #o$!%!e$ Canola O!ls. Canada =*4C, Hol. >!, no. @ Knut/on, 0.., 'hompson, 7.*., 8adke, .5., =ohnson, F.". Knau6, H.C., Kridl, =.C. 1991. #o$!%!,a+!on o% 4rass!,a see$ O!l b- An+!sense E8/ress!on o% A S+earo-la,-l ,arr!er /ro+e!n Desa+rase Gene . +roc. en,e o% a Com/lemen+ar- DNA Clone En,o$!n S+earo-lA,-l Carr!er Pro+e!n Desa+rase %rom Cas+o 4ean9 R!,!ns ,ommn!s . +lant +hysiol (1991) 9!, 3;;3;@. hanklin, =. N omer2ille, C. 1991. S+earo-lA,-l Carr!er Pro+e!n Desa+rase %rom H!'er Plan+s !s S+r,+rall- Unrela+e$ +o +'e An!mal an$ 6nal Homolos. +roc. -#@#.
26
'heologis, *., Garembinski, '.., 4eller, +.F., iang, ., *el, . 199#. #o$!%!,a+!on O% 6r!+ R!/en!n b- S//ress!n Gene E8/ress!on. +lant +hysiol. (199#) 1$$, @;9@@1 nited tates 0epartment o6 *griculture. #$$. Un!+e$ S+a+es De/ar+men+ o% Ar!,l+re 6ore!n Ar!,l+re Ser7!,es Pro$,+!on S//l- an$ D!s+r!b+!on. 8etrie2ed #! 0ecember #$$, 6rom nited tates 0epartment o6 *griculture website http&&www.6as.usda.go2&psdonline&psdOuery.aspE +ur2es, ada2a., eller., 4rians. #$$$. i6e 'he cience o6 "iology. > th edition. ondon.
