FECHA DE ENTREGA: 07-05-2010
-2010-
Bio 131 sección 25
INTRODUCCION
El fraccionamiento subcelular corresponde a una serie de sucesos o metodologías utilizadas para poder observar o reconocer partes celulares ya sean membranas, m embranas, mitocondrias, núcleos, microtúbulos, etc. Para este mecanismo se necesitan de dos etapas que son, primero, la rotura de las células o tejidos y segundo, la separación de la fracción deseada. Las técnicas más comunes para la rotura de las células o tejidos son la sonicación, uso de detergentes que solubilicen membranas celulares, pasar las células a través de orificios o rificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares y homogenización. Posteriormente a ello, la muestra se centrifuga, es decir, se hace girar un tubo a alta velocidad para obtener un sedimento o pellet y así finalmente poder experimentar con este sedimento y ver con qué reacciona, concluyendo de esta manera cual es el contenido de este pellet. El fraccionamiento subcelular subcelular es un tipo t ipo de experimento bastante utilizado y es de gran utilidad para los científicos para conocer la composición de las células y así ratificar si es que determinado tejido o conjunto de células posee tal tipo de membrana o reconocer si contiene un determinado organelo. Es por eso que en esta actividad se desarrolló este procedimiento para conocer los métodos del fraccionamiento subcelular y de qué manera podemos encontrar los organelos celulares mediante un campo gravitatorio utilizando una centrífuga de laboratorio.
Fuente: http://www.ub.e http://www.ub.es/biocel/wbc s/biocel/wbc/tecnicas/fracci /tecnicas/fraccionamiento.htm onamiento.htm
OBJETIVOS
El objetivo principal de este laboratorio es comprender el uso de la técnica de fraccionamiento subcelular y de este manera poder reconocer componentes celulares a través de la centrifugación. Aprenderemos, además, a usar sustancias que nos ayudarán a identificar estos mismos
MATERIALES Y MÉTODOS
A) FRACCIONAMIENTO SUBCLULAR DEL HÍGADO
1) El primer paso fue la disposición de una muestra de hígado de ratón (Rattus novergicus) licuado previamente y agregado a un tubo de Falcon el que se introdujo en un frasco con hielo picado por 5 minutos para mantenerlo fresco y para minimizar la activación del daño generado por fosfolipasas y proteasas. A esta muestra se le agregó 1 mL de IBc fresco y frío y se dispuso en una centrífuga de laboratorio para mezclar la muestra. La velocidad fue de 1600 RPM por 10 minutos.
2) Luego se transfiere el homogenizado a otro tubo e Falcon y se centrifuga a 2500 RMP por 10 minutos a 4°C.
3) Posteriormente, cuando se obtiene el sobrenadante, este se transfiere a otro tubo de centrifugación a 6000 RPM por 20 minutos.
4) Luego de los 20 minutos de centrifugación, se reserva el pellet o sedimento y se le añaden 1 mL de IBc (Buffer) para poder lavar la muestra obtenida y centrifugar nuevamente a 6000 RPM por 20 minutos a una temperatura no mayor a 4°C.
5) Procedimos a descartar el sobrenadante de la última muestra y se re suspendió el sedimento que contiene mitocondrias con 1 mL de buffer IBc igual que la veces anteriores.
6) Esta solución se transfirió a un tubo de Falcon y se reservó en hielo.
7) Finalmente, se midió el contenido de mitocondrias de la muestra utilizando el reactivo de Biuret.
B) EVALUACIÓN DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES
1) Para esta actividad, el primer procedimiento fue la disposición de una gota de la muestra N°1, la del primer centrifugado a 1600 RPM, en un portaobjetos para luego observarlo en un microscopio óptico, la muestra fue tapada por un cubreobjetos. El aumento utilizado fue de 400 X, es decir, el aumento del ocular era naturalmente de 10 X y el aumento del objetivo era de 40 X.
2) La muestra fue observada por los integrantes
3) Luego, se dispuso de otra gota de esta muestra para ser teñida con o tra gota de azul de tripán y se observó de una manera más nítida. Las imágenes obtenidas fueron fotografiadas.
4) Dentro de esta actividad se usaron 4 tubos de ensayo que se congelaron previamente y se rotularon. Al primero se le agregó agua destilada, al segundo fracción nuclear, a la tercera fracción mitocondrial y al cuarto, fracción microsomal. Se le agregaron IBc, vaselina y azul de metileno, finalmente se introdujeron a un baño termorregulador a 37°C y se intentaron observar cambios de coloración.
RESULTADOS:
Actividad N°1:
Luego del primer centrifugado se obtuvo un pellet rico en núcleos.
En el segundo centrifugado se obtuvo un pellet rico en mitocondrias.
Después del tercer centrifugado el pellet era rico en material microsomal.
Luego del buffer, el succinato, el azul de tripan y las gotitas de vaselina, y el baño termorregulador a 37°C los resultados fueron:
a)
[pic]
[pic]
[pic]
[pic]
b) Observación de muestra al microscopio: [pic]
DISCUSIÓN
ACTIVIDAD Nº1
A) El trabajo fue satisfactorio y si se obtuvieron los resultados esperados ya que el tubo que contenía un sedimento con gran cantidad de mitocondrias se decoloró en gran parte (decoloración del Azul de Metileno), en cambio, en dos tubos de ensayo restantes también se observó decoloración pero no de manera significativa, la excepción fue del tubo de ensayo que contenía agua destilada ya que efectivamente no ocurrió nada específico. La razón por la cual solo 1 tubo de ensayo reaccionó de forma notable es porque tenía un sedimento realmente rico en mitocondrias, por lo tanto mayor cantidad de enzima Succinato Deshidrogenasa. Podemos evaluar y acorde a lo obtenido de la bibliografía citada que el procedimiento se cumplió de manera eficiente ya que el Succinato que se añadió a cada uno de los cuatro tubos de ensayo fue catalizado por las mitocondrias las cuales contenían la enzima. De esta forma podemos explicar que la tinción utilizada se desvaneció por perder electrones en el proceso citado anteriormente ya que su estado oxidado es azul y mediante este proceso se aminoró. Así mismo podemos decir que la Vaselina utilizada cumplió su labor ya que debía aislar las muestras del aire atmosférico para que así la reacción no sucediera en presencia de oxígeno ya que el Azul de Metileno se hubiera oxidado y la reacción no hubiese sido observable.
CONCLUSION.
BIBLIOGRAFIA.
o http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm
o Biología celular y molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresión, 1998, Ed. El ateneo, Bs. Aries.
o Biología Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4° Edición, Ed. Panamericana.
o http://morfoudec.blogspot.com/2008/06/tcnicas-de-fragmentacin-y-separacin-de.html
o Universidad Andrés Bello. Guía de laboratorio N°5 Organización subcelular, curso Bio 131, Laboratorio biología celular.
----------------------El tubo con fracción mitocondrial, adquirió una coloración dividida en dos capas, la de arriba tranparente y debajo de color azul.
El tubo con fracción nuclear, reacciono, adquiriendo una coloración dividida, arriba transparente y debajo de color café.
El tubo con fracción microsomal, quedo muy parecido al tubo con mitocondrias, quedando dos capas, una transparente y otra de coloración azul.
En el tubo con agua destilada, se observó una coloración arriba transparente, y abajo azul.
Muestra de fracción nuclear sin tinción: No se alcanza a reconocer nada muy bien, solo se ve un fondo color rosado, con algunas manchas moradas.
En la muestra con tinción se pueden distinguir de mejor manera los núcleos.
