Metode Immunohistokimia
Metode Immunohistokimia Makhyan Jibril Al Farabi* *Program Study Master Biomedik, FKUB
1. PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang
Imunohistokimia merupakan suatu ara pemeriksaan untuk mengukur dera!at imunitas atau atau kadar kadar antibo antibodi di atau atau antige antigen n dalam dalam sediaan sediaan !aringa !aringan" n" Pe#arn Pe#arnaan aan sediaa sediaan n !aringa !aringan n menimbulka menimbulkan n ikatan ikatan antibodi antibodi pada antigen di permukaan permukaan atau didalam sel yang selan!utnya selan!utnya dapat dideteksi dengan ara dilabel dengan en$im,isotop, fluoropore,atau fluoropore,atau coloidal gel. Untuk gel. Untuk mempela!ari mor%ologi sel, sel dalam !aringan di%iksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan di&isualisasikan denganmikroskop elektron atau mikroskop ahaya '(antam, )+ -eknik imunohistokimia
dapat
digunakan
untuk mempela!ari distribusi en$im yang spesi%ik pada struktur sel intak 'normal.lengkap,me ndeteksikom ndeteksikompone ponen n sel, sel, biomak biomakromo romolekul lekul seperti protein, protein, karbohidrat karbohidrat '/ehr et al., l., 0111" 2engan demikian, maka sangat penting sekali untuk memahami teknik imunohistokimia guna penelitian yang berkaitan dengan pengukuran ekspresi protein, karbohidrat maupun antigen lain di permukaan maupun di dalam sel"
1.2. Tuuan
Untuk mengetahui proses pelaksanaan metode immunohistokimia
2. TIN!AUAN PU"TA#A
Imunohist Imunohistokimia okimia merupakan merupakan proses untuk untuk mendeteksi mendeteksi antigen antigen 'protein, 'protein, karbohidra karbohidrat, t, dsb pada sel dari !aringan dengan prinsip reaksi antibody yang berikatan terhadap antigen pada !aringan" 3ama imunohistokimia diambil dari nama 4immune5 yang menun!ukkan bah#a prinsip dasar dalam proses ini ialah penggunaan antibody dan 4histo5 menun!ukkan
!aringan seara mikroskopis" Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidenti%ikasi karakteristik dari e&en seluler seperti proses proli%erasi sel, apoptosis sel" Imunohistokimia !uga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai maam !aringan pada tubuh" '(amos67ara, )8" Untuk mem&isualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibody dapat dilakukan dengan berbagai maam ara, dimana ara yang paling sering digunakan ialah dengan kon!ugasi antibody dengan en$im seperti peroksidase" Selain itu !uga bias digunakan %luorophore seperi %luoresin atau rhodamin" Untuk mempela!ari mor%ologi sel, sel dalam !aringan di%iksasi kemudian dilokalisasi diantara sel dan di&isualisasikan dengan mikroskop elektron atau mikroskop ahaya ' (antam, )+ Seara garis besar, untuk metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode diret maupun indiret" 2imana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibody yang digunakan, yakni9
Metode 2iret
Metode imunohistokimia diret menggunakan antibody primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target seara langsung Metode Indiret
Metode imunohistokimia indiret menggunakan antibody primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan !uga antibody sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan Ig: dari antibody primer"
$. MET%DE
(angkaian pemeriksaan Immunohistokimia dimaulai dengan pengambilan sampel lalu pembuatan para%%in blok" Setelah itu dilakukan pe#arnaan imunohistokimia" Berikut periniannya 9 a.
Pem&uatan 'ara((in &lo)k
0"
Jaringan diui dengan PBS
)"
2i%iksasi dengan %ormalin 0;
+"
2ilakukan dehidrasi menggunakan alohol bertingkat '+;, 8;, <;, =;, 1>; dan absolute
?"
@learing menggunakan ilol ) kali, masing6masing > menit"
8"
In%iltrasi menggunakan para%%in lunak selama > menit pada suhu ?= @"
>"
Blok dalam para%%in keras pada etakan dan diamkan selama sehari"
<"
-empelkan" Pada holder dilakukan pemotongan setebal ?6> mm dengan rotary mirotome"
="
Mounting pada ob!ek dengan gelatin 8;
&.
Proses de'ara(inisasi
0"
Slide direndam ilol ) kali, masing6masing selama 8 menit"
)"
(ehidrasi menggunakan alohol bertingkat '+;, 8;, <;, =;, 1>; dan absolute masing6masing 8 menit
+"
Bilas dengan d)C selama 8 menit
).
Proses imunohistokimia terhada' eN%"
0"
Slide preparat diui dengan PBS p <,?
)"
Aplikasikan +; h)o) 'dao, In selama 0 menit"
+"
@ui dengan PBS p <,? selama 8 menit + kali
?"
Bloking menggunakan serum ); BSA 'Sigma USA selama > menit '0;
8"
Inkubasi dengan antibody primer mouse monolonal &am60 human absorbed semalam pada suhu ?@ '090
>"
@ui dengan PBS p <,? selama 8 menit + kali
<"
-etesi dengan anti body sekunder berlabel biotin 'Santa @rus dan inkubasi selama 0 !am '09)
="
@ui dengan PBS p <,? selama 8 menit + kali
1"
-etesi dengan SA6KP 'Strep A&idin horse radis peroidase '2ako,In selama ? menit '098
0"
@ui dengan PBS p <,? selama 8 menit + kali
00"
Aplikasikan romogen untuk (P yaitu 2AB '2iamono Ben$idine '2ao,In
0)"
Bilas dengan )C
0+"
@ui dengan PBS p <,? selama 8 menit + kali
0?"
@ounter straining dengan mayer ematoilen 'lab 7ision selama 0 menit
08"
@ui dengan tap Dater
0>"
Kering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta o&er :lass
d.
Pem&uatan media
Larutan PB"
a"
3a ) PC? ) )C ),? gram
b"
3a)PC?
"
K)PC?
,< gram
d"
K@I
>,= gram
0,) gram
Pem&uatan
6
2ilarutkan ke + bahan tersebut dengan aEuadest sampai 0 /
6
2iletakkan di atas magneti stirrer agar homogen
6
2iukur pada p <,?" 2istrilisasi
6
Simpan disuhu dingin
6
Jika ingin dienerkan, ambil 0 , tambahkan 1 m/ AEuades
*. HA"IL
+. #E"IMPULAN
Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bah#a imunohistokimia merupakan metode semi6kuantitati% yang berman%aat untuk mempela!ari distribusi en$im yang spesi%ik pada struktur sel intak 'normal.lengkap, biomakromolekul seperti protein, karbohidrat dengan prinsip prinsip immunoassay"
DA,TA- PU"TA#A
/ehr S, Kot$ka J, erkner A, Klein , Sietho%% @, Knebel B, 3oelle 7, BrGning J@, Klein D, Meyer , Krone D, MGller6Dieland 2" 0111. Identification of tyrosine phosphorylation sites in human Gab-1 protein by EGF receptor kinase in vitro. Biohemistry" Jan 8H+='0908061" (amos67ara, JA" )8" "echnical !spects of Immunohistochemistry". 7et Pathol ?) '?9 ?8?)>" doi90"0+8?.&p"?)6?6?8" PMI2 0>>>0" (antam, Fedik A" )+" Metode Immunologi" Airlangga Uni&ersity Press" Surabaya" 0?86088
imunohistokimia IMUNOHISTOKIMIA (IHK)
Pendahuluan Imunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi label. Dengan menggunakan imunohistokimia, kita dapat melihat distribusi dan lokalisasi dari komponen seluler spesifik diantara sel dan jaringan lain di sekitarnya dengan menggunakan mikroskop cahaya biasa. Komponen seluler tersebut dapat terlihat karena kompleks antigen-antibodi yang sudah dilabel akan memberikan warna yang berbeda dari sekitarnya. Imunohistokimia dibagi menjadi 2 metode, yaitu metode direct dan indirect. Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut. !elanjutnya dalah metode indirect, pada metode ini antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan modifikasi pada antibodi ini. "amun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. #ntibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut.
!etiap $ antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari $ antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut. %angkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrie&al untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. !ampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. !ampel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Tujuan $. 'elatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan Imunohistokimia 2. 'elihat sel kanker pada preparat jaringan buli-buli dari hasil Imunohistokimia Metode (ari pertama $. Deparaffinisasi a. )eteskan *ylol 2+$ menit b. )eteskan ethanol absolute $+ menit c. )eteskan ethanol / $+ menit d. )eteskan ethanol 0/ $+ menit e. )eteskan ethanol 1/ $+ menit f. )eteskan !terile auades 3+ menit
2. !lide siap untuk dilakukan Imunohistokimia 4 a. Dicuci P5! steril 3+ menit b. Dikeringkan dengan tissue c. Ditambah (262 3/ dalam methanol inkubasi $ sampai dengan 2menit d. Dicuci P5! steril3+ menit 3. 5locking unspesifik protein 4 a. Ditambah ,2 triton-+$ dalam blocking buffer 5!# selama $ jam pada suhu ruang b. Dicuci dengan P5! steril 3+ menit
7. Inkubasi antibodi primer 4 a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer 5!# b. Inkubasi semalam pada 789 c. Dicuci P5! steril 3+ menit
(ari kedua $. Inkubasi antibodi sekunder 4 a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi : menit pada suhu kamar ;walapun menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya< b. Dicuci P5! steril 3+ menit
2. Inkubasi !#(=P 4 a. Ditambah !#(=P kit, inkubasi 7 menit pada suhu kamar b. Dicuci P5! steril 3+ menit c. Dicuci akuades steril 3+ menit
3. #plikasi kromagen D#5 ;dipilih D#5 karena lebih awet< 4 a. Ditambah ;D#5 4buffer D#5 > $4<, inkubasi 2 menit pada suhu kamar
b. Dicuci P5! steril 3+ menit diaminobenidine
7. 9ounterstain dengan mayer hemato+ilen 4 a. Ditambah ;mayer 4 tap water >$4$<, inkubasi -$ menit pada suhu kamar b. Dicuci tap water steril 3+ menit c. Dikeringkan anginkan . 'ounting dengan entellan Dikeringkan anginkan :. #mati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop
Hasil
?ambar hasi Imunohistokimia Dari Imunohistokimia pada preparat jaringan buli-buli yang diperkirakan terdapat sel kanker, sel kanker tersebut akan terwarnai dengan warna coklat. Dari preparat pertama didapatkan sedikit warna coklat, sehingga diperkirakan hanya ada sedikit jumlah sel kanker, sedangkan pada preparat kedua dan ketiga terdapat banyak warna coklat sehingga diperkirakan ada banyak sel kanker pada jaringan buli-buli tersebut. Diskusi Pada pelatihan penelitian ini langkah-langkah Imunohistokimia sudah dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur Imunohistokimia ini. "amun proses preparasi sampel tidak seluruhnya dilakukan oleh peserta. Preparasi sampel terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrie&al untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Peserta pelatihan memulai pada saat preparat sampel sudah dilakukan deparafinisasi, sehingga hanya proses bloking protein tidak spesifik dari proses preparasi sampel saja yang dilakukan oleh peserta. "amun telah dilakukan penjelasan secara rinci dari laboran biomedik tentang preparasi sampel. Proses antigen retrie&al diperlukan setelah dilakukan deparafinisasi karena proses tersebut akan membuat epitop dari jaringan tersebut lebih terlihat atau lebih dominan dibandingkan dengan tidak dilakukan antigen retrie&al sehingga nantinya antibodi primer yang diberikan akan dapat mengenali epitopnya dengan baik. !elanjutnya dilakukan bloking protein tidak spesifik, hal ini bertujuan untuk menutupi sisi protein lain, sehingga anti bodi tidak mengenali protein lain yang tidak dimaksud. (al ini dapat mengurangi bias. Pelatihan penelitian ini menggunakan teknik Imunohistokimia secara indirect. Pada proses selanjutnya adalah sampel labeling yang terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. #ntibodi primer yang digunakan adalah antibodi yang spesifik terhadap protein sel kanker buli-buli. !etelah diberikan antibodi primer, preparat dicuci, sehingga antibodi primer yang tidak berikatan akan terbuang. 5erikutnya diberikan antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer, sehingga antibodi sekunder ini akan berikatan dengan antibodi primer. #ntibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Pada pelatihan penelitian ini, molekul indikator yang digunakan adalah !#(=P yang berikatan dengan ( 262. !etiap $ antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari $ antibodi sekunder yang memiliki !#(=P. !elanjutnya diberikan kromagen diaminobenidine ;D#5<. D#5 ini akan bereaksi dengan ( 262 yang terdapat pada !#(#=P antibodi sekunder dan akan dihasilkan produk reaksi berwarna coklat yang dapat kita lihat. 6leh karena lebih dari $ antibadi sekunder yang berikatan dengan antibidi primer, maka D#5 yang bereaksi dengan ( 262 akan semakin banyak dan akan menghasilkan warna yang lebih jelas dibandingkan dengan metode direct yang tidak menggunakan antibodi sekunder. Proses terakhir
adalah counterstaining, yaitu memberikan warna lain pada jaringan yang tidak terwarnai oleh proses Imunohistokimia. Pada pelatihan penelitian ini menggunakan mayer hemato+ilen sebagai counterstaining yang nantinya akan memberikan warna kebiruan pada jaringan lainnya. 9ounterstaining bertujuan untuk memberikan warna kontras terhadap hasil Imunohistikimia, sehingga jaringan berwarna coklat dapat terlihat jelas dibandingkan dengan jaringan sekitarnya. Pada hasil Imunohistokimia dari pelatihan penelitian ini, terlihat adanya sel kanker yang terwarna coklat diantara jaringan lain yang berwarna kebiruan. Kesimpulan $. 'ahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur Imunohistokimia dengan baik sehingga diperoleh preparat jaringan buli-buli dengan adanya warna coklat pada pelatihan prosedur Imunohistokimia ini. 2. Pada preparat jaringan buli-buli yang dilakukan Imunohistokimia menggunakan antibodi spesifik terhadap sel kanker buli-buli, terlihat adanya jaringan berwarna coklat yang menunjukkan sel kanker pada jaringan tersebut dengan menggunakan mikroskop cahaya.
