UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGIA, XALAPA
E. E.: PROTISTA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE PROTISTA
Académico: Dra. Ibiza Martínez Serrano, Dra. Elizabeth Valero Pacheco y M. en C. Margarito Páez Rodríguez
Fecha de Elaboración: Junio 2014 Fecha de Modificación: Julio 2016
UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA
Este manual de prácticas ha sido tomado t omado de: Prácticas 1, 2, 3a y 3b. Aladro---Lubel, M. A. 2009. Manual 2009. Manual de prácticas de laboratorio de protozoos. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. 124 pp. Prácticas 4 – 4 – 15. 15. S/A 2009. Manual 2009. Manual de Prácticas Protozoarios y Acelomados. Facultad de Biología. Universidad Veracruzana. Xalapa, Veracruz. 71 pp.
UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA
Este manual de prácticas ha sido tomado t omado de: Prácticas 1, 2, 3a y 3b. Aladro---Lubel, M. A. 2009. Manual 2009. Manual de prácticas de laboratorio de protozoos. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. 124 pp. Prácticas 4 – 4 – 15. 15. S/A 2009. Manual 2009. Manual de Prácticas Protozoarios y Acelomados. Facultad de Biología. Universidad Veracruzana. Xalapa, Veracruz. 71 pp.
Tabla de Contenido
Introducción ........................................................................................................................................ 1 1. Micrometría ..................................................................................................................................... 2 2. Métodos de recolecta, transportación y mantenimiento de protozoos dulceacuícolas ........... ................ ..... 4 3. Observación de los protozoos ......................................................................................................... 9 4. Medios de cultivo de protozoos de vida libre ............................................................................... 16 5. Preparaciones temporales ............................................................................................................ 23 6. Preparaciones permanentes ......................................................................................................... 28 7. Foraminíferos bentónicos ............................................................................................................. 39 8. Epibiontes de crustáceos ............................................................................................................... 44 9. Endosimbiontes de anélido e insectos .......................................................................................... 52 10. Epibiontes de peces..................................................................................................................... 59 11. Observación de Opalinas ............................................................................................................. 66 12.Phylum Porifera ............................................................................................................................ 70 13.Phylum Cnidaria ........................................................................................................................... 73 14. PhylumPlatyhelminthes .............................................................................................................. 79 15. 1. Práctica Extramuro Extramu ro ................................... .................. ................................... ................................... ................................... ................................... ......................... ........ 84 15.2 Protozoarios Asociados a Erizos de Mar. .................................................................................. 89 Bibliografía General ....................................................................................................................... 93
Introducción Actualmente el conocimiento teórico de biodiversidad y principalmente de los grupos de organismos que integra a los Protozoarios así como a los Acelomados, han sido apoyados por diferentes tipos de publicaciones, discutiendo principalmente sus características, su biología, pero sobre todo su posición taxonómica (Aladro-Lubel, 2006). Este manual proporciona una información general sobre los trabajos prácticos que se pueden implementar, utilizando material sencillo y de fácil acceso.
El objetivo general del manual es proporcionar a los alumnos la metodología de estudio de los protozoos, una guía de prácticas para su observación en los diferentes hábitats naturales, así como en los diversos sustratos orgánicos animales y vegetales, y finalmente una serie de prácticas de carácter experimental. Los objetivos particulares son: 1) Introducir al alumno en el estudio de los diversos grupos de protozoos, incluyendo las principales técnicas de recolecta, mantenimiento en el laboratorio, cultivo, fijación y tinción e impregnación, entre otras. 2) Conocer los diferentes ambientes en que se encuentran y las asociaciones simbióticas que presentan con una diversidad de organismos. 3) Comprobar con una serie de prácticas experimentales varios de los procesos biológicos fundamentales. En cada práctica se incluye algunas citas bibliográficas del tema, sin embargo, sería recomendable continuar la búsqueda bibliográfica por parte de los alumnos y profesores, con el fin de enriquecer el conocimiento del tema de estudio y para enfatizar la importancia que tiene esta actividad en el quehacer científico. Este manual de prácticas ha sido compilado de: Aladro‐Lubel, M. A. 2009. Manual de prácticas de laboratorio de protozoos. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Autónoma de México. 124 pp. (Prácticas 2-6) S/A 2009. Manual de Prácticas Protozoarios y Acelomados. Facultad de Biología. Universidad Veracruzana. Xalapa, Veracruz. 71 pp. (Prácticas 1, 7-15). 1
1. Micrometría Introducción La unidad de medida para objetos microscópicos, es la micra que equivale a una milésima de milímetro. El micrómetro objetivo es un portaobjetos con una escala de uno o dos milímetros, grabada o fotografiada, dividida en 100 o 200 partes, de manera que cada división corresponde a 0.01 mm, ósea 10 micrómetros. Esta escala permite valorar, con cada objeto, la del micrómetro ocular. El micrómetro ocular es la escala arbitraria, es decir, sin medida alguna, constituida por una línea grabada o fotografiada y dividida en partes iguales numeradas. Debe dársele valor en micrómetros con el micrómetro objetivo. La calibración del micrómetro ocular se logra colocando sobre la platina del microscopio el objetivo micrométrico y ocular en su sitio. Ambas escalas se enfocan y se hacen coincidir desde su inicio. Se cuenta el número de divisiones del objetivo que correspondan a “cierto número de divisiones del ocular”.
En la que D es igual al diámetro que se desea conocer y N el numero de divisiones de la regla que abarca el objetivo. Objetivo Habilitarse en la medición de organismos microscópicos. Material Microscopios compuestos Micrómetro objetivo Micrómetro ocular Portaobjetos Cubreobjetos Pipetas Pasteur Preparaciones fijas de diferentes Géneros y/o Especies de Protozoarios. 2
Procedimiento metodológico Calibrar el microscopio utilizando los micrómetros objetivo y ocular, según las indicaciones siguientes y realizar de la medición de al menos tres protozoarios. Mediciones mediante micrómetro objetivo y ocular El factor de calibración se calcula de la siguiente manera:
Ejemplo: 10 divisiones del objetivo corresponden a 20 divisiones del ocular, por lo tanto:
Con lo que sabemos que cada división del ocular para el sistema óptico usado, corresponde a 5 micrómetros. El factor de calibración se calcula una sola vez para casa objetivo de cada microscopio, de tal manera que cuando se quiere efectuar una medición, se realiza con el ocular micrométrico contando las divisiones que alcanza el objetivo problema y multiplicando este dato por el factor de calibración determinado previamente. 1. Anotar el coeficiente micrométrico obtenido para cada uno de los objetivos (10X, 40X y 100X). Señalar con qué tipo de ocular (6X o 10X) se calculó y el número del microscopio calibrado. 2. Anotar las medidas obtenidas para cada organismo. 3. Proceda a medir los distintos organismos proporcionados. 4. Haga un esquema de los organismos medidos y anote las medidas obtenidas. 5. De respuesta a las preguntas anexas a la presente práctica. Cuestionario 1. ¿Qué entiende por medir un organismo? 2. ¿Cuál es la importancia de realizar esta medición? 3. ¿De qué otra forma podríamos medir a los organismos? Bibliografía Mille, P.S., Pérez Ch. A y R Villaseñor. 2001. Biología de Protozoarios e invertebrados no artrópodos. IPN
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2. Métodos de recolecta, transportación y mantenimiento de protozoos dulceacuícolas Métodos de recolecta y transporte La recolecta de protozoos es relativamente sencilla. Se realiza de forma manual capturando en un frasco limpio y de boca ancha (Fig. 1A), agua del medio que contenga detritos, animales pequeños, vegetación, hojas en descomposición y algas. De esta forma se obtienen organismos de vida libre, bentónicos y sésiles, incluyendo los que se adhieren a un sustrato orgánico. Los organismos de vida libre, incluyendo los fotosintéticos y los heterótrofos, pueden ser recuperados fácilmente de la columna de agua; algunos otros se obtienen directamente del sustrato o entre la vegetación o detritos. Se sugiere que el agua y material recolectado ocupen solamente dos terceras partes del volumen del frasco, dejando un tercio libre. También pueden ser colocados portaobjetos u otros sustratos artificiales como tiras de plástico (ver práctica de colonización) en los sitios de recolecta, que se mantienen por un corto periodo y se recuperan para observar organismos sésiles que se fijaron a estos sustratos. Para recolectar muestras de sedimentos en lugares someros, se utiliza un cucharón, el cual se sumerge y arrastra. El sedimento se deposita en un frasco de boca ancha (Fig. 1B) y se le agrega un poco de agua del medio, teniendo la precaución de no llenar el frasco por completo, dejando por lo menos, una tercera parte. Para los organismos planctónicos se requiere el uso de una red de plancton de abertura de malla de 20 a 64 µm. Se realiza el arrastre de la red en una lancha por un periodo de 10-15 minutos (Fig. 2) y la muestra se coloca en un termo o frasco de boca ancha para ser trasladada al laboratorio. La revisión de las muestras debe de realizarse inmediatamente después de la recolecta. El registro de los parámetros ambientales de los sitios de la recolecta, tales como el ph, temperatura, concentración de oxígeno, entre otros, se debe realizar en el momento de la recolecta utilizando el equipo o material apropiado, como en el caso de potenciómetro o tiras de pH, oxímetro y termómetro (Fig. 3). Se recomienda el monitoreo de estos parámetros en el laboratorio en el caso de que se desee realizar algún trabajo ecológico, por ejemplo, la sucesión de poblaciones o comunidades de una muestra dada, lo que permitirá establecer la aparición de las mismas respecto al cambio de las condiciones. 4
En todos los casos, las muestras deben transportarse en una hielera, debidamente cerradas y etiquetadas con los datos de la localidad, fecha, nombre del colector y en su caso, anotaciones complementarias.
Fig. 1. A) material necesario para la recolección de muestras y B) recolecta de muestras.
Fig. 2. Recolección con la red de plancton. A) Frasco, B) abrazadera y C) red de plancton.
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Fig. 3. Equipo para la medición del pH, temperatura y oxígeno.
Métodos de mantenimiento en el laboratorio Las muestras deben ser mantenidas en recipientes que ofrezcan, entre otros, la cantidad de luz y oxígeno necesarios para los protozoos. Se recomienda el uso de cristalizadores o de acuarios pequeños de los cuales es factible tomar muestras para llevar a cabo el cultivo. Las muestras que contengan protozoos con pigmentos deben ser colocados en sitios donde estén expuestos a la luz solar; las muestras de todos los demás protozoos pueden ser mantenidas en sitios con temperatura y luz artificial y en su caso, con oxigenación. En el caso de las amebas, es más recomendable el uso de cajas de Petri con una fracción de la muestra recolectada, mantenidas resguardadas de la luz, a temperatura ambiente o en estufa a una temperatura de 20-25°C (Fig. 4A). Para el estudio de los protozoos desde diferentes perspectivas, se requiere un número elevado de individuos, los cuales se obtienen preparando diferentes medios que proporcionan las condiciones para su reproducción, como son las infusiones, medios de cultivo elaborados exclusivamente con una mezcla de sales o medios de cultivo específicos para un género o especie (axénico) (ver práctica de medios de cultivo). En algunos casos, los medios deben ser esterilizados previamente a su uso (Fig. 4B). Los medios de cultivo deben ser revisados y remplazados constantemente para lo cual los protozoos se transfieren a medios o infusiones nuevas con el uso de pipetas Pasteur y en ocasiones pueden ser concentrados a través de centrifugación (Fig. 4C). 6
Fig. 4. Equipo de laboratorio: A) estufa, B) olla de presión y C) centrífuga
Para los protozoos que se encuentran adheridos a sustratos orgánicos es indispensable proveer las condiciones propias para el mantenimiento de los mismos, así se requiere de oxigenación constante, temperatura e iluminación adecuada, alimento para los metazoos, etc., lo cual permite que las poblaciones no decaigan. Material Campo Oxímetro Termómetro Papel ph o potenciómetro Red de plancton Hielera estándar o de poliuretano Cubeta Cucharón Tijeras Frascos de boca ancha Etiqueta 7
Masking-tape Plumón indeleble
Laboratorio Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Estufa Parrilla Autoclave u olla de presión Centrífuga Acuarios de diferente tamaño Bombas de aireación Portaobjetos y cubreobjetos Caja de Petri de diferente diámetro Pinzas Tijeras Masking-tape Plumón indeleble Cristalizadores de diferente diámetro Tiras de plástico Pipetas Pasteur Infusiones (ver medios de cultivo)
Bibliografía Finlay, B. J., Rogerson, A. y Cowling, A. J. 1988. A beginner´s guide to collection, isolation, cultivation and identification of freshwater Protozoa. CCAP. Titus Wilson y Son LTD, Kendal. Jahn, T. L., Bovee, E. C. y Jahn, F. F. 1979. How to know the Protozoa.2 da ed. Wm. C. Brown, Dubuque, Iowa. Kudo, R. R. 1977. Protozoology.5ta ed. Charles C. Thomas Pub.Springfield.
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3. Observación de los protozoos En el estudio taxonómico de los protozoos, es imprescindible seguir una serie de pasos con el fin de llegar a una identificación adecuada de la (s) especie (s), por lo que es importante tomar en cuenta las siguientes consideraciones: 1. La observación en vivo de los organismos es fundamental y no puede ser sustituida por sólo la observación de los organismos teñidos e impregnados. Ambas observaciones son fundamentales en el estudio de los protozoos. 2. Para la observación de los protozoos en vivo, se recomienda las técnicas microscópicas de campo claro y obscuro, la utilización de los microscopios de contraste diferencial y de fases, este último, es satisfactorio para las especies muy planas. La revisión preliminar de la muestra recolectada, bajo el microscopio estereoscópico es recomendable, para localizar a los protozoos, especialmente las especies grandes. 3. Para la observación microscópica de los protozoos, se debe tomar una cantidad mínima de la muestra recolectada con una pipeta Pasteur, inmediatamente después se agrega una gota sobre el portaobjetos (2.6 x 7.6 cm), y sobre ésta se coloca el cubreobjetos (22 x 22 mm o 32 x 22 mm). Sólo se requiere una pequeña gota para la observación de los protozoos, si se excede la cantidad de agua, el cubreobjetos quedará flotando sobre el portaobjetos, en caso de que esto sucediera, es recomendable utilizar una pequeña porción de un papel absorbente y colocarlo a un lado de la preparación para eliminar el sobrenadante. Algunos protozoos requieren de un tiempo para recuperarse del paso de la pipeta al portaobjetos y de unos minutos para volverse a activar y poderse observar, éste es el caso de los protozoos que se encuentran en el detrito, los cuales requieren de unos minutos para separarse de este. Es importante señalar, que es indispensable el uso del cubreobjetos para no ensuciar los objetivos y mejorar la calidad de la imagen. Tanto los portaobjetos como los cubreobjetos deberán estar perfectamente limpios, antes de su uso. Las muestras recolectadas deberán ser revisadas lo antes posible, con el fin de observar el mayor número de especies y en su mejor estado morfológico y fisiológico. Cuando las muestras son mantenidas en sus recipientes originales, la mayoría de las especies se encontrarán cerca del sedimento o asociado a la película superficial o sobre las plantas y animales recolectados, por lo que son los sitios adecuados para la captura de los protozoos. 4. En la rutina del estudio de los protozoos, primero se debe utilizar la lupa y el objetivo de 10x, pasando posteriormente al 20x y 40x; es preferible utilizar una iluminación moderada. 9
Muchas especies de protozoos, principalmente los ciliados se caracterizan por un rápido movimiento, por lo que varios autores han sugerido métodos (físicos y químicos) que permiten retardar el movimiento de éstos, con el fin de poder observar varios detalles estructurales. Ejemplos de estos son: el sulfato de níquel al o.1% (químico) que los inmoviliza y la metilcelulosa o resina Polyox (físico) las cuales incrementan la viscosidad del medio, disminuyendo por lo tanto la movilidad de los ciliados (Fig. 1). Sin embargo, el uso de éstos puede cambiar la forma de la célula o causar alteraciones posteriores de varias estructuras.
Fig. 1. Preparación para la observación de los protozoos.
Otros métodos son utilizados para inmovilizar a los protozoos, uno muy sencillo es el usar una porción pequeña de papel absorbente a un lado del cubreobjetos para quitar el exceso de líquido, de esta manera el cubreobjetos se empuja contra el portaobjetos y los protozoos quedan atrapados, pudiéndose observar durante varios minutos, antes de que se distorsionen. Si es necesario se puede agregar a un lado del cubreobjetos una gotita del líquido, para liberar los protozoos de su compresión terminal. Un método sugerido por vario autores es el de colocar los organismos en un portaobjetos y sobre éste un cubreobjetos, al cual previamente se le pone en los cuatro extremos una porción mínima de vaselina, posteriormente se presiona sobre estos cuatro extremos con el mango de una aguja de disección, hasta que los ciliados sean retenido firmemente entre el portaobjeto y el cubreobjeto (Fig. 2 A, B, C). A medida que aumenta la presión los ciliados disminuyan su movimiento y se observan más transparentes, permitiendo a su vez la localización de varios orgánulos como aparato nuclear, vacuola contráctil, en muchos casos el aparato oral y extrusomas entre otros.
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Fig. 2. Preparación utilizando vaselina en los cuatro extremos del cubreobjetos.
Varias especies de ciliados son muy frágiles y se distorsionan o fragmentan realizando este procedimiento de presión, por lo que su observación se deberá hacer directamente utilizando objetivos de menor aumento y grabarlos por medio de un video, con el fin de observar su comportamiento de desplazamiento. En lo general, para todos los protozoos es importante su registro utilizando para ello una cámara de video y una cámara fotográfica adaptada al microscopio. Adicionalmente, se debe hacer un esquema de los organismo en estudio, incluyendo el mayor numero de estructuras visibles, así como, la medición de los organismos (longitud y anchura) y los orgánulos que los caracterizan (ver medición). 5. Con el objetivo de obtener mayor número de individuos es importante elaborar diferentes medios de cultivos, los cuales promoverán la reproducción de muchas de las especies que se encuentran en la muestra recolectada (ver medios de cultivo). 6. Después de la observación en vivo de los protozoos (Fig. 3 A y B), así como su registro iconográfico, fotográfico y video, es fundamental llevar a cabo diferentes técnicas de tinción e impregnación (ver técnicas). Los protozoos teñidos conservados en las preparaciones permanentes, también se les registrará iconográfica y fotográficamente. Tanto los organismos en vivo como los procesados con las diferentes técnicas, deberán se medidos, utilizando para ello un microscopio calibrado (ver medición de los protozoos). 7. Si es posible, el uso del microscopio de barrido también es recomendable porque permite tener una imagen tridimensional de los organismos, así como detalles de su morfología externa, los cuales no se revelan con otros medios.
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Fig. 3. Microscopios A) óptico y B) estereoscópico.
Medición de los protozoos Es de suma importancia en el estudio de los protozoos, conocer el tamaño que tienen. Se puede tener una estimación aproximada (1) o una más precisa (2). La unidad de medición utilizada para los protozoos es el micrómetro (la millonésima parte del metro o la milésima parte del milímetro). 1. Con un ocular de 10x y un objetico de 10x, el diámetro de campo del microscopio es de 1,600 µm. Sí un organismo ocupa la mitad del diámetro de campo, éste tendrá aproximadamente un tamaño de 800 µm. Sí el organismo ocupa una 1/5 parte de campo, medirá más o menos 320 µm (Fig. 4). Con un objetivo de 40x, ocular 10x, el diámetro de campo es de 372 µm, si l organismo ocupa la mitad del campo, el organismo medirá alrededor de 186 µm y si ocupa 1/5 parte tendrá cerca de 75 µm.
Fig. 4 Medición aproximada de los protozoos con un objetivo 10x y ocular 10x. 12
2. Para calibración del microscopio se requiere de una reglilla ocular micrométrica y una reglilla objetivo micrométrica. Estas se colocan respectivamente en el tubo ocular y en la platina del microscopio. Se enfocan ambas y centran ambas haciendo coincidir en ambos extremos ambas escalas, colocándolas paralelamente y sobrepuestas. Con mucho cuidado y observando muy bien, ver que otras divisiones de la dos reglillas coinciden exactamente, si con varias, se debe tomar la más alejada de las primeras. Se cuentan las divisiones que coinciden en ambas reglillas (Fig. 5). Las divisiones de la reglilla objetivo se multiplican por 10 de entre el número de divisiones de la reglilla ocular. Si por ejemplo, encontramos que 16 divisiones de la reglilla del ocular corresponden a 23 de la reglilla objetivo tendremos: Coeficiente micrométrico=
= 14.3 µm
Esta cifra representa el valor en micrómetros de cada una de las divisiones del micrométrico ocular. Debe calibrarse de la misma forma con los otros objetivos del microscopio 40x y 100x, para este último se usa el aceite de inmersión para enfocar la reglita del objetivo. Al observar al microscopio un objeto que se a va a medir, se utiliza la reglita ocular calibrada (cada división de esta corresponde a determinado nuero de micrómetros ej. 14.3) se cuentan el numero de divisiones que ocupa el objeto a medir y se multiplican por el coeficiente micrométrico. De esta manera se obtendrá la medida en micrómetros del objeto. Siempre debe usarse en el microscopio que se calibró y con las mismas lentes y tubo, con la finalidad de que las medidas no varíen.
Fig. 5 Calibración del microscopio, utilizando las reglillas ocular y objetivo (modificado del manual de Carl Zeiss de México). 13
Registro iconográfico, fotográfico y video se los protozoos Es de suma importancia que además de observar a los protozoos, se tengan varias formas de registro de las especies. Una de ellas, la más simple, es hacer un dibujo a línea. Al realizar el dibujo de un objeto de estudio, en este caso de los protozoos, nos permite registrar un mayor número de detalles, como su forma, posición de los orgánulos intracitoplásmicos (núcleo, citosoma, vacuolas contráctiles incluyendo su dimensión), orgánulos de locomoción (tamaño, grosor, densidad y posición de los flagelos y cilios), y de esta maneta tener una imagen mental que será recordada. Cuando se tenga la oportunidad de volverlos a observar en vivo, otras anotaciones como el comportamiento de la vacuola contráctil, el contenido de las vacuolas digestivas, patrones d locomoción, la estructura del citosoma y la presencia de extrusomas deben ser también contempladas. Al hacer un dibujo completo de una especies es necesario incluir sus medidas (ver medición de los protozoos) y observar varios individuos repetidamente e incluir el color que tienen los diversos orgánulos citoplásmicos. Algunos autores sugieren que los dibujos de cada una de las especies se hagan en tarjetas blancas, anotando su tamaño y su clasificación correspondiente y de esta manera ordenarlos taxonómicamente. Se pueden incorporar adicionalmente otros datos (al reverso), como el nombre y caracterización del lugar donde se recolectó y la fecha y posteriormente se irán incorporando los datos de las nuevas recolecciones en donde se observó y la fecha. Para hacer dibujos con más precisión, existen accesorios microscópicos como la cámara lúcida o clara, con la cual se puede elaborar un dibujo detallado y proporcionado del organismo, previamente inmovilizado. Con la cámara lúcida se logra reflejar el papel en donde se va a elaborar el esquema y la punta del lápiz dentro del campo microscópico donde se encuentra el organismo, facilitando de esta manera el dibujo. Existen actualmente una gran cantidad de accesorios microscópicos adaptados a los microscopios que nos permiten tener el registro de los protozoos en fotografías y videos. Todo este material es fundamental para el estudio completo de las diferentes especies de protozoos. Tanto el dibujo como la toma de fotografías debe realizarse de los organismos vivos como los que has sido tratados con las diversas técnicas de coloración e impregnación, en el caso de los organismos en vivo se pueden utilizar diferentes técnicas microscópicas como contraste de fases, diferencial campo claro y obscuro.
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Material Microscopio óptico con contraste diferencial y de fases Reglillas ocular y objetivo micrométricas Cámara lúcida Microscopio estereoscópico Cámara fotográfica adaptada al microscopio Cámara fotográfica adaptada al microscopio Videograbadora y casetes Portaobjetos y cubreobjetos Pipetas Pasteur y goteros Aguja de disección Vaselina Sulfato de Níquel al 1% Metilcelulosa Papel absorbente Infusiones diversas (ver medios de cultivo) Colorantes vitales (ver preparaciones temporales) Colorantes supravitales (ver preparaciones permanentes)
Bibliografía Aguilar, M. M., Coutiño, B.B. y Salinas, R. P. 1996. Manual general de técnicas histológicas y citoquímicas. Las prensas de Ciencias. Facultad de Ciencias UNAM. Finlay, B. J., Rogerson, A.yCowling, A. J. 1988. A beginner´s guide to collection, isolation, cultivation and identification of freshwater Protozoa . CCAP.Titus Wilson y Son Ltd, Kendal. Foissner, W. 1991.Basic light ans scanning electron microscopic methods for taxonomic studies of cilliatedprotozoa.Europ. J. Protistol . 27:313-330. Jahn, T. L., Bovee, E. C. y Jahn, F. F. 1979. How to know the Protozoa .2da ed. Wm. C. Brown, Dubuque, Iowa. Kudo, R. R. 1977. Protozoology .5ta ed. Charles C. Tjomas Pub. Springfield. Patterson, D. J. y Hedley, S. 1992. Free-living freshwater Protozoa .AcolourGuide.Wolfe Pub. Ltd, England.
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4. Medios de cultivo de protozoos de vida libre Introducción Los medios de cultivo proporcionan a los protozoos un microhábitat adecuado. Para que un medio tenga resultados positivos, requiere de condiciones biológicas, químicas y físicas adecuadas, similares a las del ambiente natural. Los cultivos pueden favorecer un nivel poblacional adecuado y mantenerse por un tiempo razonable. Se clasifican frecuentemente de acuerdo con la presencia y ausencia de otros organismos acompañantes de la especie que se pretende cultivar. Polixénico. El cultivo contiene varias especies, en el caso de que no se conozca su identidad se le denomina agnotoxénico o agnotobiótico. Monoxénico. El cultivo contiene además de la especie que se intenta cultivar, otra especie la cual frecuentemente es su alimento. Axénico. En el cultivo sólo está presente la especie que se desea cultivar. Los organismos se alimentan de los nutrientes en solución del medio de cultivo, el cual proveerá de todos los requerimientos nutricionales de la especie en estudio.
Material Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Autoclave u olla de presión Perilla eléctrica Muestras de agua recolectadas en diferentes localidades Portaobjetos y cubreobjetos Frascos de boca ancha de 1 L Frascos de boca ancha de 50 ml Cajas de Petri Cristalizadores de 1 L Cristalizadores de 250 ml Tubos de ensayo Tapas de vidrio esmerilado Pipetas Pasteur con bulbo Vasos de precipitado de 250 ml 16
Vasos de precipitado de 1 L Vasos de precipitado de 50 ml Rollo de plástico adherente Rollo de papel encerado Ligas Algodón no absorbente Etiquetas adherentes Granos de arroz Granos de cebada Granos de chícharo Granos de maíz Granos de trigo Paja Suelo de jardín Tamices 16, 8, 3.4 mm
Cultivos polixénicos El cultivo Polixénico permite la observación de la diversidad de protozoos que se pueden encontrar en una muestra recolectada en un cuerpo de agua y es el que se sugiere para iniciar a los alumnos en el conocimiento de los protozoos. Se recolecta una muestra de agua y sedimento en un ambiente dulceacuícola como Xochimilco, Chapultepec u otro cuerpo de agua (ver métodos de recolecta) utilizando los frascos de 1 litro. También puede será adecuada el agua de floreros, que tenga más o menos 5-8 días de haberse colocado las flores, o el agua de acuarios (anotar en la etiqueta la localidad o procedencia de la muestra, así como la fecha). En el laboratorio se hace una revisión preliminar, observando bajo el microscopio preparaciones frescas de las muestras, y con ayuda de la bibliografía especializada de hace una determinación preliminar de los diferentes protozoos observados.
Preparación de infusiones Las infusiones de granos y hojas de plantas aumentan la cantidad de compuestos orgánicos que estimulan el crecimiento bacteriano y como consecuencia el crecimiento de los protozoos, en especial de flagelados y ciliados bacterívoros. 17
El agua que se utiliza para las infusiones puede ser la recolectada en el medio natural, o agua de la llave o agua destilada. Algunos recomiendan utilizar agua mineral embotellada (no carbonatada) la cual provee una composición química adecuada. El agua del medio natural debe contener muy poca contaminación de compuestos químicos o residuos animales la cual se filtra inmediatamente después de su recolecta y posteriormente se hierve por unos minutos. La utilización del agua de la llave es muy frecuente, pero debe tener un bajo contenido de metales. Se recomienda que cualquier agua que se utilice, se hierva y se deja por un día para que se acumule el oxígeno disuelto, antes de que sean inoculados los organismos. Algunos substituyen el agua por una solución de sales conocida como medio Chalkley: Cloruro de sodio Cloruro de potasio Cloruro de calcio Agua destilada
0.1 g 0.004 g 0.006 g 1000 ml
Infusión de paja a) En un vaso de precipitados colocar 1 L de agua corriente con 10 g de paja y poner a hervir en una parrilla durante 5 minutos. b) Dejar que se sedimente la paja y se enfríe completamente. c) En una caja de Petri o en un tubo de ensayo o en un frasco pequeño agregar 1 parte de la infusión de paja (el sobrenadante) con 4 partes de la muestra recolectada.
Infusión de trigo, cebada o chícharo a) En un vaso de precipitado se coloca de 25-35 ml de agua de la llave con 3 granos de trigo o cebada o chícharo y se pone a hervir por 5 minutos. b) Dejar enfriar completamente. c) En una caja de Petri o en un tubo de ensayo o en un frasco pequeño agregar 1 parte de la infusión y granos de trigo, cebada o chícharo con 4 partes de la muestra recolectada.
Infusión de maíz
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a) En un vaso de precipitado de 25-50 ml de agua de agua de la llave con un grano de maíz y se pone a hervir por 10 minutos. Después hacerle una pequeña perforación al grano. b) Dejar enfriar completamente c) En una caja de Petri o en un tubo de ensayo o un frasco pequeño agregar 1 parte de la infusión con el grano con 4 partes de la muestra recolectada.
Infusión de arroz a) En el caso de utilizar granos de arroz (3 granos por 25-30 ml de agua) se recomienda que se agreguen después que haya hervido el agua para que no se desintegren, o se colocan en el agua hervida fría y se dejan dos días antes de ser agregados a la muestra. Si se utiliza arroz con cáscara se siguen los mismos pasos que las infusiones de trigo, cebada y chícharo. b) Los granos se pueden esterilizar, sólo pasándolos rápidamente por una flama, esto eliminará a los hongos y ácaros que se encuentren en la superficie. c) También se pueden hervir los granos, dejarlos enfriar y colocarlos directamente a la muestra recolectada. Es importante señalar que no se utilicen más granos que los recomendados en las proporciones anteriores.
Extracto de suelo Se utiliza el suelo como medio de cultivo, el cual no debe ser muy ácido, no contener mucha materia orgánica, ni alta concentración de sales. Se recomienda el suelo de jardines calcáreos o suelo agrícola, el cual se seca directamente al sol e en un cuarto caliente. Se le quitan las piedras y se pulveriza en partículas lo más finas posible o también se pueden tamizar, utilizando los tamices de 16, 8, 3.4 mm. a) El suelo se mezcla con el agua en una proporción de 220 ml de agua por 35 g de suelo utilizando un cristalizador de 250 ml, o si se utilizan tubos de ensayo, se colocan 15 ml de agua por 2 g de suelo. b) En un cristalizador hervir el agua varias veces. Para algunos autores el uso del autoclave es importante (a 15 psi, 121°C por 15 minutos) por obtener más sustancias en solución y por una eliminación total de los organismos que contiene el suelo. Posteriormente se deja por lo menos una semana antes de usarse. 19
c) Cuando el medio esté completamente limpio con un color amarillo profundo dorado a pálido se decanta y filtra o se puede usar con el sedimento en el fondo (cultivo bifásico). d) Agregar 1 parte de la muestra. A este medio se le puede agregar unos granos e cebada hervidos, con la finalidad de promover un rápido crecimiento bacteriano. Se pueden utilizar otros granos, pero si se usan granos de arroz, deben agregarse después que hirvió el agua, para que no se desintegren. Existen varias modificaciones para este procedimiento como el colocar un poco de carbonato de calcio debajo del suelo en los tubos de ensayo, debido a que algunos medios pueden ser muy ácidos. En general, algunos autores consideran que los organismos aumentan su número más rápidamente en las infusiones de granos, aunque si el extracto de suelo se coloca en cristalizadores más grandes, esto permitirá más estabilidad después de que se alcanza un alto nivel de organismos. También sugieren que para algunos géneros como Paramecium y Stentor si las poblaciones empiezan a bajar, se deben poner algunos individuos en una infusión en una caja de Petri y cuando el número de organismos haya aumentado en la infusión, inocularlos en un cristalizador con extracto de suelo.
Recomendaciones Los medios de cultivo en general pueden durar varios meses, pero es muy importante en consideración los siguientes puntos: 1) Todo el material deberá estar perfectamente limpio, para lo cual se recomienda que se laven y enjuaguen perfectamente, algunos autores recomiendan el uso de desinfectantes o la autoclave. 2) Los frascos, tubos de ensayo, cajas de Petri o cristalizadores, en donde se encuentran los cultivos, deberán cubrirse, con el objeto de retardar la evaporación y sobre todo evitar la contaminación por pequeños insectos, esporas de hongos y bacterias, dejando que pase sólo el oxígeno. Para cubrir los medios de cultivo se utiliza plástico adherente, en el caso de los cristalizadores también se utilizan tapas de vidrio esmerilado o papel encerado el cual se asegura con una liga. A los tubos de ensayo se les coloca antes en la abertura una porción de algodón no absorbente. 3) Los cultivo s deberán mantenerse en lugares sombreados retirados de los rayos solares directos y si es posible en un lugar con orientación norte. 20
4) La temperatura es un factor muy importante. Los protozoos como otros organismos tienen un intervalo de temperatura donde pueden vivir y una temperatura óptima donde se desarrollaran mejor. Varios protozoos tienen un intervalo de temperatura muy amplio y generalmente se multiplicaran más rápidamente hacia la parte superior del intervalo, pero sin llegar al límite. Sin embargo, es importante considerar que una rápida multiplicación llevará a una rápida disminución del alimento y a una acumulación de productos de desecho. Para mantener un cultivo adecuadamente se recomienda que a) el cultivo se deje por varios días a una temperatura que de un buen número de protozoos y después mantenerlo a una temperatura más baja; este método prolongara la vida del cultivo y no será necesario subcultivarlos frecuentemente b) idear un método para mantener los cultivos permanentemente a una temperatura moderada, varios autores recomiendan una temperatura promedio de 20°C. 5) Cuando se inocula a un medio de cultivo nuevo (subcultivo) utilizando una pipeta, se deberán transferir e mayor número de organismos, teniendo cuidado de no transferir grandes cantidades del medio de cultivo viejo. Es importante señalar que una gran variedad de protozoos pueden cultivarse, utilizando estos medios de cultivo, para algunos será más fácil su crecimiento que para otros, por ejemplo aquellos protozoos que crecen en altas concentraciones de bacterias en estos medios crecerán sin mayor esfuerzo, en cambio para algunas especies con necesidades nutricionales específicos, se requerirá de medios especiales para su cultivo. Todos los protozoos tienen algunos requerimientos básicos que deben ser considerados para el cultivo de determinada especie, por lo que el siguiente paso sería cultivar diferentes especies de protozoos por separado, tomando en cuenta lo anterior. Existen actualmente una gran variedad de medios monoxénicos y axénicos específicos para varios géneros de protozoos (ver medios de cultivo para amebas). 6) En cada uno de los frascos, tubos de ensayo, cajas de Petri o cristalizadores en donde se encuentran los cultivos, anotar en una etiqueta los siguientes datos: Fecha Tipo de infusión (arroz, maíz, trigo, paja, chícharo o cebada) Localidad
Bibliografía Finlay, B. J., Rogerson, A.y Cowling, A. J. 1988. A beginner´s guide to collection, isolation, cultivation and identification of freshwater Protozoa . CCAP.Titus Wilson y Son Ltd, Kendal. 21
Kudo, R. R. 1977. Protozoology .5ta ed. Charles C. Tjomas Pub. Springfield. Lee, J. J. y Soldo, A. T. 1992. Protocols in Protozoology .Society of Protozoologists. Allen Press, Lawrence. Page,
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free-living
Protozoa
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5. Preparaciones temporales Introducción En las preparaciones temporales se utilizan los colorantes vitales y en su elaboración no se incluye fijación, deshidratación, aclaramiento ni montaje. A la gota con los protozoos que se están observando en vivo, se le coloca directamente una pequeña gota del colorante vital o se le agrega por capilaridad en uno de los extremos del cubre objetos. Son varios los colorantes que se utilizan con la finalidad de destacar varios orgánulos citoplasmáticos (Tabla 1 y figs. 1-3). Generalmente los colorantes se preparan en solución alcohólica o acuosa (Tabla 2).
COLORANTE
ESTRUCTURA QUE TIÑE
Azul de cresil brillante
Aparato parabasal
Azul de metileno
Gránulos citoplasmáticos, núcleo
Azul de toluidina cc
Cilios, flagelos
Lugol
Almidón, glicógeno, cilios, flagelos, (quistes vivos)
Nigrosina
Citoplasma, membranas, tricocistos, vacuolas contráctiles, flagelos y cilios
Rojo Congo
Vacuolas digestivas (indicador)
Rojo neutro
Vacuolas contráctiles
Verde de Metilo
Núcleos, mitocondrias, cromosomas, núcleo
Verde Jano
Mitocondrias
Verde rápido
Citoplasma, núcleo (colorante de contraste)
Violeta de metilo
Citoplasma, cilios, flagelos, mitocondrias, núcleo, plastos
Tabla 1. Algunos colorantes para la observación de los principales orgánulos de los protozoos.
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Tablas 2. Preparación de algunos colorantes.
AZUL DE METILENO
VERDE JANO
Azul de metileno……………….1 g
Verde Jano…………………0.1 g
Agua destilada…………………..100 ml
Agua destilada……………1000 ml
AZUL DE TOLUIDINA
VERDE DE METILO
Solución acuosa al 0.5%
Solución Verde de metilo…………1 g Agua destilada……………100 ml
Acidulado Ácido acético glacial…..1 ml Agua destilada…………….100 ml Verde de metilo…………..0.5 g
LUGOL
VERDE RÁPIDO
Yodo……………………………..0.4 g
Solución A:
Yoduro de potasio…………4.0 g
Solución saturada de verde rápido en alcohol absoluto…………………….1 ml
Agua destilada………………100 ml
Metilcelosolve en igual cantidad de alcohol etílico absoluto………………………1 ml Si el Lugol está muy concentrado rebajar 24
con agua destilada 50:50
Alcohol etílico absoluto………….25 ml Aceite de clavo………………………75 ml Mezclar ambas soluciones
ROJO CONGO
AZUL CRESIL BRILLANTE
Rojo Congo.....................0.1 g
Solución stock al 1% en alcohol absoluto
Agua destilada……………..100 ml
Diluirlo 10 veces para utilizarlo Colocar una gota en el porta objetos Evaporar el alcohol, colocar una gota de organismos y dejar de 5-10 minutos.
ROJO NEUTRO
VIOLETA DE METILO
Rojo neutro………………….1 g
Violeta de metilo………………..1 g
Agua destilada……………..100 ml
Agua destilada…………………….100 ml
En general se puede diluir de 1:10,000 y hasta 1:180,000 con agua destilada o agua del medio donde viven los protozoos. Lo más adecuado es hacer pruebas para determinar la mejor concentración del colorante en relación con el tiempo de supervivencia de organismos en estudio.
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Fig. 1. En el género Euplotes se encuentra el macronúcleo den forma de banda. Colorante vital verde metilo, 40x.
Fig. 2. Se observa el macronúcleo de Paramecium color verde. Colorante vital verde de metilo, 40x.
Fig. 3. Las vacuolas de Paramecium se observan de color azul después de varios minutos de haber sido aplicado un colorante indicador como el rojo congo. Adicionalmente se observan principalmente en la parte anterior la expulsión de los tricocistos. 40x. 26
En el siguiente organigrama se detallan los pasos a seguir en lo referente a las técnicas de tinción de los protozoos. RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA
Preparaciones Temporales
Preparaciones permanentes
En el portaobjetos coloca una gota de colorante
Fijación
Agregar una gota y/o un corte de la muestra
Tinción Diferenciación
Lavado
Lavado Mezclar Deshidratación Cubrir con un cubreobjetos
Aclaración
Sellar los cuatro lados del cubreobjetos con vaselina
Montaje Etiquetado
Bibliografía Aguilar, M.M., Coutiño, B.B. y Salinas, R.P. 1996. Manual general de técnicas histiológicas y citoquímicas. Las prensas de Ciencias. Facultad de Ciencias UNAM. Gaviño, G.T., Juárez, L.C. y Figueroa, T.H.H. 1980. Técnicas biológicas selectas de laboratorio y campo. Ed. Limusa. México. Kudo, R. R. Protozoología. 1era ed. En español. C.E.C.S.A. México.
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6. Preparaciones permanentes Introducción No existe un solo método que pueda revelar todos los detalles necesarios para una buena descripción de protozoos. Asimismo, un método de tinción no es igualmente apropiado para todos los tipos de protozoos. Las buenas descripciones generalmente demandan, por lo menos la observación en vivo, una impregnación de nitrato de plata y protargol o carbonato de plata. Además es importante para los detalles realizar dibujos y tomar fotografías. Al final del capítulo se incluyen una serie de microfotografías que ilustran las diferentes técnicas.
Técnica de Giemsa Tinción utilizada frecuentemente para parásitos, destacándose su núcleo y flagelos. Reactivos Colorante de Giemsa Alcohol metílico 30 ml Glicerina 10 ml Giemsa 0.25 ml Mezclar y conservar el colorante en un frasco oscuro. Metanol absoluto. Bálsamo de Canadá o euparal. Procedimiento 1.- Hacer frotis y dejar secar al aire. 2.- Para fijas a los protozoos, cubrir el frotis con metanol absoluto, durante minuto, escurrir 3.- Teñir con el colorante de Giemsa de 1-30 minutos. Escurrir y revisar la intensidad de la coloración bajo el microscopio. 4. Lavar con agua destilada y escurrir. 5. Lavar con agua corriente y escurrir.
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6. Dejar secar al aire. 7. Montar en bálsamo de Canadá o euparal.
Técnica de hematoxilina de Harris Para diferenciar núcleo y citoplasma. Reactivos Fijador Nissenbaum Cloruro mercúrico o bicloruro de mercurio (Sol. Acuosa saturada-60 g en un litro de agua destilada) Ácido acético glacial Formol comercial t-butanol Formol al 5% Cloruro de magnesio al 8% Hematoxilina de Harris (Sigma) Alcohol etílico 50%, 70%, 96% y absoluto Xilol Bálsamo de Canadá o euparal
10 ml 2 ml 2 ml 10 ml
Procedimiento 1. Colocar en un portaobjetos una gota concentrada de organismos y agregar una gotita de cloruro de magnesio al 8%-10 minutos, principalmente para los ciliados contráctiles-, dejar secar la gota con la finalidad que de que los protozoos queden adheridos al portaobjetos. Se puede utilizar para la adhesión de los organismos al portaobjetos la albúmina que se indica en la siguiente técnica. 2. Agregar 1 gota de fijador Nissenbaum o formol al 5% durante 5 minutos. 3. Lavar con agua destilada dos cambios de 5 minutos. 4. Teñir con la Hematoxilina de Harris 5 minutos. Agregarla sólo donde están los organismos. 5. Lavar con agua de la llave. Escurrir. 6. Lavar con agua destilada. Escurrir. 29
7. Deshidratar con alcoholes 50%, 70%, 96%, 5 minutos cada uno, y dos cambios con alcohol absoluto de 5 minutos cada uno. 8. Aclarar con xilol dos cambios cada 5 minutos cada uno. 9. Montar con bálsamo de Canadá o euparal.
Técnica tricrómica (Modificación de Masson) Para diferenciar el núcleo, orgánulos citoplasmáticos y de locomoción. Reactivos Albumina-glicerol de Mayer Albúmina filtrada 30 ml Glicerol 20 ml Formol comercial 3 gotas Se diluye la mezcla (9 ml) con agua destilada (1ml) Fijador Schaudinn Solución saturada de Cloruro de mercurio 66 ml Alcohol absoluto o de 96% 33 ml Alcohol acético glacial 1 ml Mordente (mezclar en 100 ml de etanol al 70% - 1 minuto) Yodo 7.0 g Yoduro de potasio 5.0 g Colorante (Mezclar en 100 ml de agua) Cromotropo 2R 0.6 g Verde rápido 0.15 g Verde brillante 0.15 g Ácido fosfotúngstico 0.7 g Ácido acético 1 ml (por 100 ml de agua) Alcohol acidificado Alcohol de 95% 10 ml Ácido acético glacial 1 gota Alcohol 70%, 100% Xilol Bálsamo de Canadá o euparal Procedimiento 30
1. Colocar una gota de albúmina sobre el portaobjetos y se hace un frotis y dejar secar. 2. Concentrar a los organismos y agregar una gota sobre la albúmina. 3. Fijar los protozoos con Schaudinn por 10 minutos. 4. Agregar el mordente 1 minuto. 5. Dos cambios de alcohol de 70%, cada uno por 1 minuto. 6. Agregar el colorante de 2-6 minutos. 7. Diferenciar con alcohol de 95% acidificado de 5-10 segundos. 8. Sumergir dos veces en alcohol de 100%, 1 minuto cada uno. 9. Xilol de 1-3 minutos. 10. montar en bálsamo de Canadá o euparal.
Técnica Nigrosina-cloruro de mercurio-formol (NMF) de Borror (1968, 1969) Para destacar cinetosomas, cilios, fibras citoplasmáticas y ornamentaciones superficiales. Reactivos Cloruro de magnesio 8% Fijador-colorante Solución Nissenbaum Solución acuosa saturada de bicloruro de mercurio Ácido acético glacial t-butanol Formol comercial Mezclar y conservar la solución en un frasco oscuro Solución Deroux-Faidy Formol comercial Nigrosina Agua destilada Mezclar y conservar la solución en un frasco oscuro
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10 ml 2 ml 10 ml 2 ml
40 ml 4g 100 ml
Mezclar 12 partes de solución Nissenbaum y una parte de solución Deroux-Faidy y conservar la solución en un frasco oscuro. Esta mezcla se prepara en el momento que se va a utilizar. Alcoholes 70%, 80%, 96%, 100% Xilol Bálsamo de Canadá o euparal Procedimiento 1. Concentrar los protozoos: centrifugar el cultivo o la muestra durante 2-5 minutos a 150-500 rpm, esto dependerá del tipo de protozoos en estudio y decantar el sobrenadante o utilizar una pipeta Pasteur y bajo el microscopio estereoscópico recolectar los protozoos y concentrarlos en un vidrio de reloj. 2. Colocar con una pipeta 1-2 gotas del concentrado sobre un portaobjetos y agregar cloruro de magnesio al 8% por 5-10 minutos, principalmente para lo ciliados contráctiles. Se puede dejar la preparación durante 5-10 minutos para que se evapore el líquido y se adhieran los organismos al portaobjetos o se agrega al fijador-colorante inmediatamente después del cloruro de magnesio. 3. Añadir 2-3 gotas del fijador-colorante a una altura de 2-3 cm, en posición perpendicular a la preparación. 4. Después de uno segundo, agregar varias gotas del fijador-colorante en uno de los extremos del portaobjetos, dejando que corra al centro del portaobjetos, después de 15 25 segundos, escurrir el exceso. 5. Deshidratar en alcoholes 70%, 80%, 96% y absoluto, de 3-5 minutos en cada uno. 6. Aclarar con Xilol (dos cambios 5 minutos en cada uno). 7. Montar en bálsamo de Canadá o euparal.
Técnica de nitrato de plata “en seco” de Klein (1926, 1958)
Para destacar el sistema de líneas argénticas (argiroma) Reactivos Nitrato de plata 5% Bálsamo de Canadá o euparal Opcional: Cloruro de magnesio 8% (para especies muy contráctiles) 32
Generalmente para esta técnica se utiliza una lámpara de rayos ultravioleta. Procedimiento 1. Colocar una gota de cultivo sobre un cubreobjetos, está se extiende con una aguja de disección y se deja secar. 2. Introducir el cubreobjetos en una solución de nitrato de plata al 5% durante 5 minutos. 3. Lavar en agua destilada dos veces. 4. Colocar el cubreobjetos en una caja Petri con agua destilada baja la lámpara de rayos ultravioleta durante 5 minutos. Colocar una hoja debajo de la caja Petri. 5. Lavar con agua destilada. 6. Dejar secar al aire. 7. Montar con bálsamo de Canadá o euparal.
NOTA: Si los ciliados son muy contráctiles utilizar cloruro utilizar cloruro de magnesio al 8% como primer paso, antes de sacar la gota. Si no se tiene lámpara de rayos ultravioletas se deja la preparación directamente expuesta a los rayos solares después del nitrato de plata. Otros recomiendan nitrato de plata al 2% durante 6-8 minutos. Otros dejan el nitrato de plata en la preparación y la colocan bajo los rayos solares por 10 minutos.
Técnica de protargol de Silva-Neto (Modificación de las técnicas de protargol de Tuffrau, 1964, 1967) Para detectar el aparato nuclear, cinetosomas, cilios, cinetodesmata, fibras corticales y citoplásmicas. Reactivos Fijador Stieve (preparar antes de usarse; los componentes se pueden guardar) Bicloruro de mercurio saturado (disolver 60 g de HgCl 2 en un litro de agua destilada y hervida) 38 ml Formol comercial 10 ml Ácido acético glacial (=Ácido acético concentrado) 3 ml Hipoclorito de sodio 3% gotas 33
Albumina de Mayer Albúmina filtrada 30 ml Glicerol 20 ml Formol comercial 3 gotas Se diluye la mezcla (9 ml) con agua destilada (1 ml) Alcohol absoluto-formol concentrado (8:2) Protargol al 0.8-1% (Esparcir sobre la superficie del agua y dejar que se disuelva el protargol son mezclar y calienta en una estufa de temperatura constante). Revelador Sulfito de sodio 2.5 g Agua destilada 50 ml Se disuelve y se agrega hidroquinona 0.5 g Tiosulfato de sodio al 2.5% Alcoholes de 50 al 100% Xilol Bálsamo de Canadá o euparal Procedimiento Para los primeros cuatro pasos se puede utilizar la centrifuga. 1. Concentrar a los protozoos (baja velocidad y unos segundos). 2. Quitar el exceso de agua. 3. Fijar con Stieve 2o minutos. También se pude fijar con Bouin, glutaraldehido al 2.5% o tetróxido de osmio al 2%*. 4. Lavar tres veces en agua destilada. Agregar en los dos últimos lavados 3 gotas de hipoclorito de sodio al 3%. Observar en el microscopio que se hayan aclarado. 5. Lavar otras tres veces o más. 6. Los protozoos se colocan en el portaobjetos y se agrega un pequeña gota de albúminaglicerol. El material se distribuye homogéneamente y se deja secar a temperatura ambiente por varias horas o se mete a la estufa a 40-50 °C. 7. Antes de la impregnación, cubrir la preparación con una mezcla alcohol-formol (8:2) dejar 1 minuto y lavar 2 minutos, dejar secar. Este procedimiento evita que se desprendan las células. 34
8. Para la impregnación se puede usar una charola de vidrio, con una tapa. En el fondo se pone un papel filtro húmedo y se distribuyen las preparaciones secas sobre éste. Con una pipeta se cubren las preparaciones con protargol al 0.8 -1%. La charola se pone en la estufa a 45-50 °C por 30-60 minutos, dependiendo el tamaño del protozoo. Evitar que el protargol se evapore. 9. Lavar las preparaciones una por una con agua destilada y pasar rápidamente al revelador, 10-20 segundos. 10. Lavar rápidamente con agua destilada y observar la impregnación bajo el microscopio. Si es necesario, se puede dejar más tiempo en el revelador, el cual puede variar en concentración. 11. Cuando se alcanza la impregnación deseada, se pasa al tiosulfato de sodio 2.5%, 30 segundos para fijar la impregnación. 12. Lavar con agua destilada 1 minuto. Sí la impregnación decrece, se coloca nuevamente en el revelador. 13. Deshidratar en una serie de alcoholes de 50-100%, 3 minutos en cada uno. 14. Xilol, tres cambios de 3 minutos. 15. Montar con bálsamo de Canadá o euparal.
*Los fijadores utilizados por el autor varían según las especies: Fijador Stieve para Lacrymaria olor, Spirostomumminus, Colpodacucullus, Paramecium Aurelia, Euploteswoodruffi yFebrea salina. Bouin alcohólico para Diophrysappendiculata y Colepssp. Glutaraldehido al 2.5% para Trichinymphasp.y las opalinas. Tetroxido de osmio al 2% para Tracheloraphisphoenicopterus.
Técnica de Carbonato de plata piridinado de Fernández-Galiano (1976) Para destacar aparato nuclear, cinetosomas, cilios, cinetodesmata, extrusomas, fibras corticales y citoplásmicas. Reactivos Formol Piridina 35
Solución de Río-Hortega Solución acuosa de nitrato de plata al 10% 50 ml (Se coloca en un frasco) Solución acuosa carbonato de sodio al 5% 150 ml (Ésta se va agregando poco a poco a la solución de nitrato de plata, agitándola constantemente) Agregar amoniaco al 25%, gota a gota y agitar hasta que el precipitado se disuelva, teniendo en cuenta de no agregar en exceso. Agregar agua destilada hasta un volumen total de 750 ml. La solución es estable por varios años. Solución de proteasa-peptona Agua destilada 96 ml Proteasa-peptona (bacteriológica) 4g (Esparcirla sobre la superficie del agua y dejar que se disuelva sin mezclar) Formol 0.5 ml Desechar si se coloniza con bacterias y hongos Tiosulfato de sodio al 5% 15 ml Procedimiento 1. Colocar en una cápsula de porcelana 3 ml de cultivo. 2. Fijar con 3 gotas de formol por 2 minutos. 3. Agregar 10 gotas de piridina. 4. Agregar 2 ml de la solución de Río-Hortega. 5. Agregar 10-15 gotas de proteasa-peptona con dos gotas de formol. 6. Agregar 20 ml de agua destilada. 7. Calentar sobre una placa de calentamiento a 60 °C, hasta obtener un color amarillo-Pardo (color de cognac). 8. Vaciar el contenido a otra cápsula de porcelana que contenga 15 ml de tiosulfato de sodio al 5%. 9. Lavar con agua destilada (varios cambios). Para ello se utiliza una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no tomar el material que está depositado en el fondo de la capsula, donde se encuentran los especímenes impregnados. 10. tomar una gota del fondo de la cápsula y ponerla sobre el portaobjetos y cubrirla con el cubreobjetos. 36
En esta técnica, los ciliados son observados en preparaciones temporales, a partir de las cuales se toman fotografías. Se si se desea obtener preparaciones permanentes: 1. Los protozoos se colocan en el portaobjetos y se agrega una pequeña gota de albúmina-glicerol. El material se distribuye homogéneamente y se deja secar a temperatura ambiente por varias horas o se mete a la estufa a 40-50 °C. 2. Cubrir la preparación con una mezcla alcohol-formol (8:2) dejar 1 minuto y lavar 2 minutos, dejar secar. 3. Deshidratar en una serie de alcoholes de 50-100%, 3 minutos cada uno. 4. Xilol, tres cambios de 3 minutos. 5. Montar con bálsamo de Canadá o euparal NOTA: Existen otros medios de montaje sintéticos y neutrales, adicionales al bálsamo de Canadá y el euparal, los cuales pueden ser utilizados, por lo que se recomienda consultar a los proveedores para su orientación.
Bibliografía Aladro-Lubel, M.A., Martínez-Murillo, M.E y Mayén-Estrada, R. 1990. Manual de ciliados psamófolos marinos y salobres de México . Cuaderno 9. Instituto de Biología. Universidad Nacional Autónoma de México. Finalay, B.J., Rogerson, A. y Cowling, A.J. 1998. A beginner’s guide to collection, isolation, cultivation and identification of freshwater protozoa. CCAP.Tutis Wilson y Son Ltd, Kendal. Foissner, W. 1991.Basic light and Scanningelctron microscopic methods for taxonomic studies of ciliated protozoa.Europ. J. Protistol. 27: 313-330. Kudo, R.R. 1977. Protozoology .5ta ed. Charles C. Thomas Pub. Springfield. Lee, J.J., Small, E., Lynn, D., y Bovee, E. 1985. Some techniques for collecting, cultiving and observing protozoa. En: Lee, J., Hutner, S. y Bovee, E. (eds). An illustrated guide to the Protozoa.Society of Protozoologist. Allen Press. Kansas.
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7. Foraminíferos bentónicos Introducción Los foraminíferos son protozoos que presentan tamaños que van de menos de milímetros hasta algunos que alcanzan a medir 10 cm o un poco más. Se caracterizan por tener estructuras extracelulares conocidas con el nombre de testas, las cuales son parecidas a caparazones y están compuestas por una cámara (unicelulares) o por más (multiloculares) (Fig.1), estas últimas presentan una variedad de arreglos. Las cámaras están separadas por tabiques denominadas septos, además presentan forámenes (perforaciones) y un orificio conocido con el nombre de abertura y es precisamente por estas dos últimas estructuras por donde salen los pseudópodos de tipo granuloreticulópodos; la mayoría de la masa citoplásmica sale por la abertura. De acuerdo a la composición química, las testas pueden ser calcáreas, arenosas y silíceas. Los foraminíferos se caracterizan por presentar ciclos de vida muy complejos. La mayoría son marinos y bentónicos y los foraminíferos planctónicos se distinguen por sus cámaras globosas como Globigerina. Por su gran cantidad en el medio marino, son importantes en la reconstrucción paleogeográfica, en las condiciones del medio marino de épocas pasadas, como índices de localización de pozos petrolíferos.
Objetivo Generales Conocer la diversidad morfológica de los foraminíferos bentónicos y elaborar una placa de montaje para su conservación. Particulares Identificar por lo menos a nivel de familia o género los foraminíferos en estudio. Separar los foraminíferos de una muestra de arena. Elaborar una placa de montaje sencilla.
Material Microscopio estereoscópico Muestra de arena con foraminíferos 39
Vidrio de reloj o caja Petri Agujas de disección Pincel Cajita de cartón Portaobjetos Cartulina Negra Papel Cascarón Tijeras Perforadora Plumón indeleble Barniz de uñas transparente Pegamento Procedimiento 1. Coloque en una caja de Petri una pequeña porción de la muestra de arena y obsérvela bajo el microscopio estereoscópico. Con la ayuda de una aguja de disección o pincel se esparce la muestra y se localizan las testas de los foraminíferos. Utilizando la aguja o pincel (algunos mojan la punta) se seleccionan y se separan una por una las testas y se colocan en una cajita de cartón o en un vidrio de reloj. 2. La elaboración sencilla de una placa de montaje para foraminíferos (Fig. 2) se realiza de la siguiente manera: Se cortan dos rectángulos del mismo tamaño de un portaobjetos, una de cartulina negra y el otro de papel cascarón; el primero se pegar directamente sobre el portaobjetos, al segundo se le hacen peroraciones simétricas y regulares con una perforadora (por ejemplo dos filas de seis orificios cada una), teniendo la precaución de no perforar un espacio razonable del lado izquierdo para poder anotar los siguientes datos: nombres científicos de los foraminíferos (se sugiere que se haga una abreviación de ellos), localidad, fecha. Este rectángulo de papel cascarón perforado se pega sobre el rectángulo de cartulina negra previamente colocado y pegado sobre el portaobjetos. Para montar a los foraminíferos en la placa, se recolectan de la cajita de cartón o vidrio de reloj, utilizando el microscopio estereoscópico y la punta de un pincel ligeramente mojado o una aguja de disección y se trasladan un por uno a los diferentes orificios de la placa. Para su adhesión se utiliza una mínima cantidad de barniz de uñas. Si se tienen varios individuos de una especie, estos se pueden colocar juntos en el mismo orificio, con una ligera distancia entre ellos. Una vez que todos los foraminíferos están colocados y pegados en sus correspondientes orificios, así como hechas las anotaciones 40
correspondientes: nombre científico *, localidad y fecha de muestreo, se puede pegar sobre el rectángulo de papel cascarón perforado un portaobjetos para proteger a los foraminíferos montados. Al reverso de la preparación se anota el nombre de los alumnos que elaboraron la placa.
*para
la determinación de la familia o género o especies de foraminíferos se utilizará la literatura especializada necesaria.
Fig. 1. Conjunto d testas de foraminíferos multiloculares, 40x.
41
Fig. 1. Placa sencilla de foraminíferos.
Cuestionario 1. Selecciones tres especies de foraminíferos y haga un dibujo de cada una de sus testas señalando sus principales estructuras. 2. Mencione las principales formas en que se disponen las cámaras de las testas y haga un dibujo de cada una de ellas. 3. ¿Cuál es el ciclo de vida de un foraminífero?
Bibliografía Boltovskoy, D. 1981. Atlas de zooplancton del Atlántico Sudoccidental y métodos de trabajo con zooplancton marino. Pub. Esp. Inst. Nac. Invest. Desarr. Pesq. Mar de plata, Argentina. Cushma, J.A. 1959. Foraminifera , Their classification and economic use. 4ta ed. Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts. Hausman, K y Hülsman, N. 1996. Protozoology . Georg TheimVerlag, Stuttgart. Lee, J.J., Leedale, G.F y Bradbury, P. (eds.). 2000. An illustrated guide to protozoa. 2da Ed. Society of Protozoologist. Allen-Press, Kansas. 42
Loeblich, A.R. Jr. y Tappan, H. 1988. Foraminifera genera and their classification . Van Nostrand Reinhold, New York. 2 Vols. Sen Gupta, B.K. 2002. Modern foraminidera. Kluwer Academic Pub. Dordrecht, The Netherlands. Sleigh, M.A. 1989.Protozoa and other Protist. Cambridge Univ. Press.Cabrigde.
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8. Epibiontes de crustáceos Introducción La epibiosis es la relación facultativa en la cual, uno de los miembros (epibionte) se adhiere a un hospedero o basibionte. Esta relación no implica dependencia de ninguno de los miembros; sin embargo, en ocasiones se torna específica, de tal manera que el epibionte ocupará exclusivamente como sustrato a un taxón o incluso una región del cuerpo del basibionte. En la naturaleza, numerosos organismos establecen una relación epibiótica. Los protozoos ciliados son, sin duda, un taxón relevante y han sido observados sobre diferentes basibionte como son: fanerógamas acuáticas, algas, crustáceos (anfípodos (Figs. 1 y 2), isópodos, cladóceros, copépodos, decápodos), moluscos, etc. Los grupos de ciliados que más frecuentemente establecen relaciones epibionticas con crustáceos corresponden a los peritricos, donde géneros como Epistylis, Vorticella, Zoothamnium, Carchesium, ConthuriayLagenophrys (Fig. 3 y 4), han sido ampliamente documentados. Los suctores, grupo de ciliados que carecen de ciliatura en su fase adulta, también albergan una serie de especies Epibiontes, como aquellas incluidas en los géneros Acineta, Tokophrya, Trichophryay Dendrocometes (Fig. 5 A y B). Cada taxón de ciliados muestra una serie de adaptaciones morfofisiológicas que lo posibilita para establecerse sobre el exoesqueleto o branquias de su basibionte. En el caso de la epibiosis entre protozoos ciliados y crustáceos, se ha documentado el papel funcional de basibionte y del epibionte. El basibionte, invertebrado acuático perteneciente al phylum Arthropoda, provee el substrato adecuado para la fijación del epibionte. Provee además, el flujo continuo de agua que proporciona al ciliado las partículas de alimento y el oxígeno necesario para su metabolismo. Asimismo, el ofrece un refugio adecuado (debido a la arquitectura del crustáceo, por ejemplo las setas de los pereiópodos) que lo protege contra los depredadores. El epibionte, puede ser considerado inocuo o causante de alguna anomalía; poco se ha documentado del daño físico que provoca el contacto del ciliado sobre el exoesqueleto o las branquias. Entre los daños indirectos que pueden provocar se tiene un entorpecimiento en la locomoción del basibionte, y en grado extremo, puede interferir en el intercambio gaseoso si la carga de Epibiontes es muy alta. Sin embargo, en la epibiosis, el grado de importancia difiere con relación a la continuidad de la especie como Epibiontes o si su presencia es ocasional. Esto implica una diferencia en el grado de especificidad del epibionte por su basibionte, de tal manera que es posible distinguir especies que se adhieren a una amplia gama de 44
substratos (por ejemplo Acineta tuberosa y Vorticella campánula), los que se adhieren exclusivamente a substratos animales ( Epistylis branchiophila) y los que se asocian exclusivamente a un grupo particular de basibionte y/o regiones del cuerpo (por ejemplo especies de Lagenophrys ).
Objetivos Generales Conocer el tipo de asociación denominada Epibiosis entre protozoos ciliados y crustáceos. Particulares Caracterizar las especies de ciliados Epibiontes que utilizan como sustrato a diferentes grupos de crustáceos. Establecer la distribución espacial de los Epibiontes en el cuerpo de los Basibiontes Comparar las comunidades de ciliados adheridos a la superficie corporal externa de diferentes crustáceos.
Material Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Lupa Muestras de agua que contengan diversos crustáceos y vegetación Portaobjetos excavados y cubreobjetos Acuario Bomba de aeración Pincel Pipeta Pasteur Agujas de disección Bisturí Pinzas de disección Charola de disección Colorantes vitales Colorantes supravitales Bálsamo de Canadá 45
Procedimiento 1. En un cuerpo de agua, por medio de un arrastre con un frasco o bolsa de malla, recolecte una muestra que contenga diversos crustáceos. 2. Coloque la muestra en una bolsa de plástico y añada vegetación del medio y agua. 3. Traslade la muestra al laboratorio y colóquela en un acuario con oxigenación constante. 4. En una charola de disección, utilizando una lupa o un microscopio estereoscópico, separe los crustáceos con la ayuda de un pincel o pipeta Pasteur. Posteriormente coloque cada crustáceo en un portaobjetos excavado con agua del acuario. Determine el grupo al cual pertenece el ejemplar. 5. Realice la disección del basibionte para obtener por separado los diferentes apéndices o regiones corporales. 6. Observe al microscopio óptico para detectar la presencia de ciliados Epibiontes. Con la ayuda de bibliografía, identifique el grupo al cual pertenece el epibionte. Utilice colorantes vitales para destacar diferentes caracteres. De ser necesario emplee diferentes técnicas micrográficas para establecer la identidad específica de los protozoos (ver practica de técnicas). 7. Vacíe los datos en la hoja de registro (Tabla 1). Utilizando estos datos, elabore: a) esquema general de la distribución espacial de los Epibiontes para cada basibionte y b) cladograma de presencia/ausencia por casa especie de epibionte y para casa basibionte. 8. Catalogue el grado de especificidad de cada epibionte tomando en cuenta su presencia en uno o más basibionte y la región del cuerpo o apéndice donde se observó adherido.
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Fig. 1. Fotografía de un anfípodo.
Fig. 2. Esquema de la l a anatomía de un anfípodo.
Fig. 3. Ciliado colonial; en vivo, 10x.
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Fig. 4. Ciliado lorigado Lagenophrys sp. ; En vivo, 20x.
Fig. 5. Suctores A) Acineta sp. 20x. B) Dendrocometes sp. 4. Técnica de hematoxilina de Harris.
Cuestionario 1. Describa los mecanismos utilizados por los basibiontes para a) eliminar sus Epibiontes, b) para adquirir los epibiontes. 2. Documente la relación entre el ciclo de vida de los ciliados epibiontes con el de los crustáceos basibiontes. 3. Señale la repercusión de la epibiosis entre protozoos ciliados y crustáceos. 4. Mencione los caracteres que se utilizan para la identificación de los protozoos ciliados que se adhieren al exoesqueleto de los crustáceos. 48
Tabla 1. Registro de ciliados epibiontes en crustáceos. Basibionte:
Localidad:
Fecha
Nombre
REGISTRO DE CILIADOS EPIBIONTES EN LAS REGIONES DEL CUERPO DE LOS BASIBIONTES Número Basibionte
Cabeza, antenas y partes bucales
Pereionitos y pereiópodos
Pleonitos y pleópodos
Uronitos y urópodos
49
Telson
Otros
Notas
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Bibliografía Fernández-Leborans, G. y Tato-Porto, M.L. 2000. A review of the species of protozoan epibionts on crustaceans. I. Peritrich Ciliates. Crustaceana, 73(6): 643-683. Hausmann, K. y Hülsmann, N. 1996. Protozoology. Georg TheimVerlag, Stuttgart. Kudo, R. R. 1977. Protozoology. 5ta ed. Charles C. Thomas Pub. Springfield. Lee, J.L., Leedale, G.F. y Bradbury, P.C. (eds). 2000. An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologist, Lawrence. Mayén-Estrada, R. y Aladro-Lubel, M.A. 1998. Tres especies de Suctores (Protozoa: Ciliophora) ectosimbiontes de acocil Cambarelluspatzcuarensis. An. Inst. Biol. UNAM. Ser. Zool., 69(1): 1-12. Mayén-Estrada, R. y Aladro-Lubel, M.A. 2002. Distribution and prevalence of 15 species of
Bibliografía Fernández-Leborans, G. y Tato-Porto, M.L. 2000. A review of the species of protozoan epibionts on crustaceans. I. Peritrich Ciliates. Crustaceana, 73(6): 643-683. Hausmann, K. y Hülsmann, N. 1996. Protozoology. Georg TheimVerlag, Stuttgart. Kudo, R. R. 1977. Protozoology. 5ta ed. Charles C. Thomas Pub. Springfield. Lee, J.L., Leedale, G.F. y Bradbury, P.C. (eds). 2000. An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologist, Lawrence. Mayén-Estrada, R. y Aladro-Lubel, M.A. 1998. Tres especies de Suctores (Protozoa: Ciliophora) ectosimbiontes de acocil Cambarelluspatzcuarensis. An. Inst. Biol. UNAM. Ser. Zool., 69(1): 1-12. Mayén-Estrada, R. y Aladro-Lubel, M.A. 2002. Distribution and prevalence of 15 species of epibiontsperitrich ciliates on the crayfish Cambarelluspatzcuarensisvillalobos, 1943 in lakePátzcuaro, Michoacán, Mexico.Crustaceana, 74(11): 1213-1224. Mayén-Estrada, R. y Aladro-Lubel, M.A. 2006. LagenophryslenticulaandL. patina (Peritricha), epibionts of Hyalella Azteca ( Amphipoda Amphipoda).A study using scanning electron microscopy to reveal detail of the loricaaperture .Protistology 4(4): 339-345. Sleigh, M.A. 1989. Protozoa and other protists. Cambridge Univ. press. Cambridge. Wahl, M. 1989. Marine epibiosis.I. Fouling and antifouling: some basic aspects. Marine EcologyProgress Series, 58: 175-189.
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9. Endosimbiontes de anélido e insectos Introducción Varios grupos de protozoos establecen algún tipo de simbiosis con otros organismos. En los integrantes del reino Animal, la asociación se establece con vertebrados o con invertebrados. Dentro de estos últimos, algunos miembros del phylumAnnelida, particularmente loe oligoquetos conocidos como lombrices de tierra, pertenecientes a la clase Clitellata, albergan a protozoos como son las gregarinas. Los artrópodos donde se incluyen los insectos, como son los chapulines (orden Orthoptera), termitas (orden Isoptera) y cucarachas (orden Blattodea) establecen simbiosis con representantes de varios grupos de protozoos, como son los hipermastiginos, tricomonádidos y gregarinas. Los protozoos Parabasálidos, incluyen los grupos denominados hipermastiginos y tricomonádidos. Los hipermastiginos se caracterizan por poseer numerosos flagelos que se insertan en la región anterior de los organismos, alineados longitudinal o espiralmente; los cuerpos parabasales aparecen como múltiples. Presentan además axostilos. Sus ciclos de vida incluyen una reproducción de tipo asexual por fisión binaria. Habitan exclusivamente en el intestino de insectos que se alimentan de madera y presentan bacterias asociadas intra y extracelularmente. Como ejemplos de hipermastiginos se pueden citar los siguientes géneros: Trichonympha , Barbulanympha , Joenia, Lophomonas . Los tricomonádidos poseen de cuatro a seis flagelos, axostilo, costa y membrana ondulante. Un ejemplo de simbionte de termitas es Mixotrichaparadoxa, el cual presenta cuatro flagelos que actúan en la locomoción como organelos guía en forma coordinada con numerosas espiroquetas, localizadas en la superficie celular. Los apicomplexos se caracterizan por poseer un complejo apical con tres componentes diferenciables morfológicamente: el conoide, el complejo anular y un par de orgánulos denominados roptrías. Las gregarinas, un grupo incluido dentro de los apicomplexos son parásitos obligados de varios grupos de animales, habitando en el intestino o cavidades del cuerpo de anélidos, artrópodos, moluscos, equinodermos y tunicados, de lo cuales los hexápodos como las cucarachas y chapulines, son los hospederos más frecuentes, albergando por ejemplo a Monocystislumbrici , sin embargo los efectos del parasitismo se conocen solo en pocas especies.
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Objetivos Generales Conocer los grupos de protozoos Endosimbiontes de invertebrados (anélidos e insectos). Particulares Observar y caracterizar los grupos de hipermastiginos, tricomonádidos y gregarinas. Aplicar técnicas de estudio de organismos endosimbiontes. endosimbiontes.
Material Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Lombriz de tierra de tierra previamente previ amente purgada Termitas Cucaracha Portaobjetos y cubreobjetos Frascos de vidrio con tapa Pipetas Pasteur Vidrio de reloj Caja de Petri Caja de Petri con cera Navaja de un solo filo o bisturí Agujas de disección Alfileres Algodón Mechero Solución salina 0.75% Acetato de etilo Alcohol etílico 50% Cloroformo Colorantes vitales Colorantes supravitales Bálsamo de Canadá
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Procedimiento Disección de oligoqueto (lombriz de tierra) 1. Recolecte a las lombrices y colóquelas en un frasco a cuyo fondo se le adiciono una capa de papel higiénico húmedo y trozos pequeños de este mismo material. Este procedimiento de purga permitirá que el contenido del aparato digestivo sea remplazado paulatinamente por el papel higiénico y sea factible la localización de los órganos internos. 2. Previo a la disección, sacrifique a la lombriz con cloroformo o alcohol etílico 50% en una cámara húmeda, lo que permitirá que la lombriz no se contraiga. 3. Coloque a la lombriz en una caja de Petri con cera. Realice un corte medioventral y longitudinal, con la ayuda de un bisturí o navaja de un solo filo, hasta el nivel del clitelo. Separe cuidadosamente la epidermis y fije los extremos con alfileres, colocando estos en posición oblicua (Figs. 1 y 2). 4. Corte los tabiques peritoneales que se localizan entre cada uno de los segmentos. 5. Distinga el aparato digestivo, los corazones y localice los tres pares de vesículas seminales (Fig. 3). Separe estas ultimas en una caja de Petri o vidrio de reloj que contiene solución salina 0.75%. 6. En un portaobjetos coloque una gota del contenido de las vesículas seminales, solución salina y colorante vital; coloque un cubreobjetos y observe al microscopio óptico. 7. Distinga las diferentes fases del ciclo de vida de Monocystis, u otro género asociado a la lombriz (Fig. 4). 8. Para elaborar preparaciones temporales o permanentes, coloque una gota con el contenido de las vesículas en un portaobjetos, seque con calor (mechero) y fije con alcohol y añada hematoxilina de Harris (ver practica de técnicas); seque nuevamente con calor; añada bálsamo de Canadá y coloque un cubreobjetos para observar al microscopio.
Disección de termita 1. Después de la recolecta de las termitas, proceda a su sacrificio utilizando cloroformo en una cámara cerrada. 54
2. Coloque las termitas en una caja de Petri con cera y sujétela firmemente con alfileres. Coloque una aguja de disección entre el tórax y el abdomen y separe este ultimo en un vidrio de reloj con solución salina 0.75%. 3. Macere cuidadosamente el abdomen, elimine los restos de cutícula y elabore una preparación temporal para observar los hipermastiginos y tricomonádidos (Figs. 5 y 6). 4. Utilice colorante vitales para relatar los orgánulos. Elabore preparaciones permanentes utilizando algunas de las técnicas (ver preparaciones permanentes). Disección de una cucaracha* 1. Recolecte a la cucaracha y deposítela en un frasco cuya tapa tenga perforaciones para la entrada de aire. 2. En el frasco, introduzca un algodón impregnado con acetato de etilo (maneje el acetato con cuidado) y mantenga el frasco cerrado por 15 minutos la tapa no debe tener perforaciones. 3. Coloque a la cucaracha en un acaja de Petri con cera, en posición ventral y sujétela con alfileres. Realice un corte longitudinal y medioventral, con la ayuda de una navaja de un solo filo o con bisturí (Fig. 7). Una vez abierto el abdomen, reconozca el aparato digestivo y sepárelo para colocarlo en un vidrio de reloj con solución salina 0.75%. Corte un fragmento y macerelo para colocarlo en un portaobjetos, observe al microscopio y localice las gregarinas (Fig. 8). Utilice los colorantes vitales para destacar los orgánulos de los simbiontes.
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Fig. 1. Esquema de la disección de la lombriz de tierra. (pág.85)
Fig. 2. Extremo anterior de la lombriz; en vivo.
Fig. 3. Disección de la lombriz en donde se observan las vesículas seminales.
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Fig. 4. Gregarínidos de las vesículas seminales de la lombriz. A) gametoquiste, 20x b) esporoquiste; en vivo, 40x.
Fig. 5. Hipermastiginos endosimbiontes de las termitas; en vivo, 40x.
Fig. 6. Tricomonádido asociado a las termites; en vivo, 40x.
Fig. 7. Disección d la cucaracha en sonde se observa parte del intestino.
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Fig. 8. Gregarínido (esporoquiste) endosimbionte de la cucaracha; en vi vo, 40x.
Cuestionario 1.- Señale las características morfológicas de cada uno de los organismos observados que representan adaptaciones a la endosimbiosis. 2.- Describa el tipo de simbiosis de cada uno de los organismos observados. 3.- Fundamente la importancia que revisten estos organismos como endosimbiontes en sus hospederos.
Bibliografía Brusca, R. C. y Brusca G. J. 2003. Invertebrates.Sinauer Inc. Pub., Sunderland. Guillan, P. J. y Cranston, P. S. 2000. The insects. An outline of Entomology . Blackwell Sci., Oxford. Hausmann, R. y Hülsmann, N. 1996. Porotozoology . George ThieeVerlag, Stuttgart. Kudo, R. R. 1977. Protozoology .5ta ed. Charles C. Thomas Pub. Springfield. Lee, J. L., Leedale, G. F. y Brandbury, P. C. (eds). 2000. An illustrated guide to the Protozoa. Society of Protozoologists, Lawrence. Sleigh, M. A. 1989. Protozoa and other Protists .Cambridge Univ. Press.Cmbridge.
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10. Epibiontes de peces Introducción El término acuicultura se define como “el arte de multiplicar y cultivar los animales y plantas acuáticas”; engloba las actividades que tienen por objetivo principal, la producción de especies acuáticas, bajo condiciones controladas o semicontroladas por el hombre, se trate de plantas, de animales de agua dulce, salobre o salada. La acuacultura se centra sobre todo en cuatro grandes categorías de producciones: las algas (esencialmente cultivadas en el sudeste asiático), los moluscos, los crustáceos y los peces, objeto de esta práctica. Hoy en día, la acuacultura es el área del sector de producción alimenticia con el mayor crecimiento a nivel mundial, en 1980 tan solo el 9 por ciento del pescado para el consumo humano procedía de la acuacultura, esta cifra se ha elevado hoy al 43 por ciento, según el estudio del estado mundial se la acuicultura 2006 de la FAO, lo cual equivale a 45.5 millones de toneladas de pescado anuales, con un valor de 63 000 millones de dólares. México produce aproximadamente 204 012 toneladas anuales de pescado, se las cuales 58 660 toneladas son producidas en cultivos dulceacuícolas. De igual manera la producción de peces ornamentales, registró en el año 2000 una ganancia de 900 millones de dólares a nivel mundial. La actual expansión de la acuicultura intensifica la comercialización y la producción, trayendo consigo el aumento de enfermedades, lo que requiere soluciones para evitar pérdidas económicas y el desarrollo social a nivel mundial. Cifras del Banco Mundial indican que, en el mundo, la acuacultura ha llegado a perder hasta tres millones de dólares al año por diversas enfermedades, algunas ya endémicas, que no fueron tratadas de manera oportuna. El cultivo de peces dulceacuícolas, en particular en sistema intensivo, ya sea con fines alimenticios u ornamentales, favorece la proliferación de ciertos parásitos y el consecuente desarrollo de fenómenos patológicos. Existen alrededor de 16 géneros de ciliados asociados con los peces dulceacuícolas, ya sea como parásitos o comensales, facultativos u obligatorios, sin embargo, tres de ellos: Ichthyophthirius, Trichodina y Chilodonella (Fig. 1) son los principales causantes de enfermedades que en ocasiones pueden conducir a la muerte de sus hospederos. Las infecciones comienzan, a menudo, cuando se produce una inmunosupresión debido a una variación brusca de temperatura, posiblemente en combinación con niveles 59
de amonio críticamente elevados o debido a factores relacionados con el estrés ambiental, como cambios bruscos en las condiciones fisicoquímicas del agua, entre otros. Los peces pueden albergar una o más especies de ciliados ectosimbiontes simultáneamente; en ocasiones solo ciertas áreas del pez son afectadas, por ejemplo las branquias o la piel, y en el caso de los parásitos, obtienen su alimento de estos tejidos u órganos del hospedero.
Objetivos Generales Identificar las especies de ciliados asociados (epibiontes) a peces ornamentales (japoneses Carassiusauratus y pez gato Corydorapaleatus ). Particulares Determinar las especies de ciliados y cuantificar el número de ciliados en muestras totales de moco de piel y branquias de los peces. Evaluar los daños tisulares producidos por los ciliados asociados en la piel y branquias de los peces.
Material Microscopio óptico calibrado para la medición de micrómetros (µm) Microscopio estereoscópico Contador digital (4 dígitos) 5 ejemplares de peces de ornato Carassiusauratus (japoneses) o Corydorapaleatus (pez gato) con agua original de la pecera. Portaobjetos y cubreobjetos Agujas de disección Verde de metilo acuoso al 1%
Procedimiento 1. Observe a los peces en el microscopio estereoscópico, detectando lesiones, hemorragias, producción excesiva de moco, etc. 60
2. Obtenga las muestras totales del moco de la piel (en vivo) y de las branquias (después de descerebrar) mediante raspado con portaobjetos, agregue unas gotas de agua de pecera y elabore un frotis, monte la preparación con cubreobjetos y observe al microscopio. 3. Revise la preparación temporal, abarcando toda el área del cubreobjetos. 4. Una vez localizaos los ciliados asociados, observe los aspectos morfológicos y fisiológico esenciales (locomoción, contracción, nutrición, reproducción, entre otros) y cuantifíquelos (elaborar tablas). 5. Resalte el aparato nuclear (macronúcleo (s) y micronúcleo (s)), empleando una gota de verde de metilo acuoso al 1%. 6. Mida los ejemplares de ciliados, en los libres nadadores y anchura de la célula; en peritricossesilinos (solitarios o coloniales, p. ej. Vorticella, Epistylis) longitud y anchura de los zooides, diámetro de la abertura peristomal, anchura del labio peristomal, longitud del pedúnculo, diámetro de la escópula y longitud de la colonia (en su caso); en peritricosmobilinos (tricodínidos) diámetro de la célula, del disco adhesivo y del anillo denticulado, grosor de la membrana del borde, longitud de los dentículos y grados de la espiral adoral. 7. Cuantifique el número de ciliados en las preparaciones temporales (muestras totales de moco de piel y branquias) de los peces (Tabla 1). Calcule prevalencia, abundancia e intensidad promedio (ver Margolis et al . 1982). 8. Haga un esquema detallado de los organismos. 9. Identifique mediante la bibliografía especializada a nivel de género y/o especie.
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Tabla 1. Cuantificación de ciliados en piel y branquias de los peces.
Género de ciliado
PEZ 1
PEZ 2
PEZ 3
PEZ 4
PEZ 5
Número de ejemplares Piel/Branq.
Número de ejemplares Piel/Branq.
Número de ejemplares Piel/Branq.
Número de ejemplares Piel/Branq.
Número de ejemplares Piel/Branq.
Amphileptussp.
Chilodonellasp.
Ichthyophthiriussp.
Apiosomasp.
Trichodinasp.
Colepssp.
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Tetrahymena sp.
Epistylissp.
Carchesium sp.
Vorticellasp.
Colpodasp.
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Fig. 1. Microfotografías de Trichodinasp., IchthyophthiriusmultifiliisyChilodonellasp., principales ciliados parásitos de peces cultivados.
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Cuestionario 1) Realice la búsqueda hemerográfica de un artículo de investigación reciente (no anterior a 2005), ya sea en México o en el extranjero sobre alguno de los siguientes parásitos de peces dulceacuícolas: Ichthyophthirius sp, Trichodinasp, O Chilodonellasp; elabore un resumen en español y entregue la fotocopia del artículo. 2) Investigue sobre los métodos de control de los tres géneros mencionados en la pregunta anterior, tanto en acuarios como en granjas acuícolas
Bibliografía Barnabé, G. 1996. Bases biológicas y ecológicas de la acuicultura . Ed. Acribia, S. A. Zaragoza, España. Baudin-Laurencin, F. y Vigneuelle, M. 1996. Patologías de las explotaciones acuícolas . En: Bernabé, G. (ed.). Bases biológicas y ecológicas de la acuicultura . Ed. Acribia. Zaragoza España, pp. 469-487. Bondad-Reantaso, G. M., Subasinghe, R. P., Richar, J. A., Kazuo, O., Supranee, C., Adlard, R., Tan, Z. y Shariff, M. 2005. Disease and health management in Asian aquaculture.Veterinary Parasitology , 132:249-272. Bruno, D. W. y Stamps, D. J. 1987.Saproleniasis of atlantic salmon, Salmosalar L., fry . J. Fish Diseases, 10:513-517. Ewing, M. S. y Kocan, C. M. 1986. Ichthyophthiriusmultifiliis (Ciliophora) development in gill epithelium. J.Protozool., 33(3): 369-374. FAO 2006. El estado mundial de la pesca y la acuacultura. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), Roma, Italia. Hoffman, G. L. 1987. Ciliates of freshwater fiches, En: Kreier, J. P. (ed.). Parasitic Protozoa.Vol. 2. Academic Press, New York, pp. 583-632. Margolis, L., Esch, G. W., Holmes, J. C., Kuris, A. M. y Schad, G. A. 1982. The use of ecologicalterms in Parasitology. J. Parasitol ., 68(1): 131-133. SAGARPA 2003. Anuario Estadístico de Pesca 2003. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. Schäperclaus, W. 1992. Fish Diseases.Vol.1 y 2.Balkema, Rotterdam. 65
11. Observación de Opalinas INTRODUCCIÓN Los protozoos opalínidos u opalinas fueron descubiertos por Leeuwenhoek en los albores de la microscopía. Estos organismos se parecen superficialmente a los ciliados y al principio fueron clasificados como tales, pero su morfología, su manera de dividirse y su ciclo biológico son diferentes a los ciliados. Son endocomensales del intestino grueso de ranas y sapos principalmente; se han encontrado algunas especies en urodelos, reptiles y en peces. Son organismos muy aplanados, de forma oval a alargada, su cuerpo esta uniformemente cubierto de cilios distribuidos en hileras longitudinales. La mayoría de los opalínidos presentan un gran número de núcleos iguales, aunque existen algunos géneros que solo poseen dos núcleos iguales ( Protoopalina). Carecen de boca, su nutrición es saprozoica; algunos sufren plasmotomía y sexualmente por anisogamia.
OBJETIVO Observar algunos Géneros representativos de esta clase: Opalina, Protoopalina y Cepedea . Observar y conocer las estructuras morfológicas que los caracterizan. Elaborar preparaciones permanentes. MATERIAL Biológico: Rana Cristaleria: Caja Petri Cubre objetos Pipeta Pasteur o gotero Portaobjetos Vaso de precipitado de 250 ml Vidrio de reloj Equipo: Microscopio compuesto 66
Microscopio de disección Lámpara Sustancias: Agua acidulada Agua amoniacal Agua destilada Alcoholes graduales Bálsamo de Canadá Cloroformo Eosina Fijador de Schaudinn Formol al 10% Hematoxilina de Harris Solución salina al 0.7% Xilol Varios: Alfileres Algodón Charola de disección con parafina o láminas de unicel de 25 x 25 cm Estuche de disección Mechero Tela de asbesto Tripie PROCEDIMIENTO METODOLÓGICO 1. En un frasco colocar la rana, introducir un algodón impregnado de cloroformo, tapar el frasco y esperar unos minutos. 2. Una vez anestesiada, colocar la rana en una charola de disección con la superficie ventral hacia arriba, sujetándola con alfileres. 3. Hacer un corte medio ventral y dos transversales (anterior y posterior) para dejar expuestos los órganos internos. Localizar el intestino grueso y extraer la Proción terminal de éste (cloaca). 4. Colocar la cloaca en una caja Petri, cubrir con solución salina y disgregar con las agujas de disección. 5. Tomar una muestra y hacer una preparación temporal, observar al microscopio. 6. Localizar las Opalinas, observar la forma de su cuerpo, su movimiento, esquematizar y señalar sus estructuras principales (número de núcleos, ciliatura y hoz). En base a las características antes mencionadas indicar el o los Géneros observados. 67
7. Puede utilizar verde de metilo para resaltar los núcleos y Nigrosina para observar la disposición de los cilios. (No utilizar dos colorantes en la misma preparación). 8. Elaborar una preparación permanente utilizando la Técnica Hematoxilina – Eosina.
CUESTIONARIO 1. Mencione las características morfológicas que distinguen a los Opalínidos. 2. Explique por qué los Opalínidos no se agrupan dentro de los Ciliofora a pesar de que presentan cilios. 3. Describa el ciclo de vida de Opalina. ¿Qué relación existe entre el ciclo reproductor al anfibio y la división de las opalinas? 4. Explique si en estos protozoarios existe especificidad hospedatoria. Cite ejemplos. 5. Realice una investigación bibliográfica en relación a los estudios realizados sobre este grupo. Anexe fotocopia de dos trabajos o artículos.
BIBLIOGRAFÍA Jahnm T.L., Bovee, Z.C. and F.F. Janhn.1979. How to know the protozoa. W.M.C. Brown Co. Dubuque Iowa. 279 pp. Martínez Pérez J.A. y M.E Gutierrez. 1985. Introducción a la Protozoología. Trillas. México. 207 pp. Sleigh, M.A. 1979. Biología de los Protozoarios. De. Blume, Madrid. 339pp Smyth J. D. 1994.Introduction to Animal Parasitology.C ambridge Univ. Press. 553 pp.
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Fig. 1. Ciclo de vida de Opalina ranarum en una Rana temporaria (Smyth J. D. 1994)
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12.Phylum Porifera Introducción Son animales pluricelulares, individuales o coloniales, su cuerpo está formado por una agregación laxa de células de aspecto masenquemático. Su cuerpo está formado por poros (ostílos y osculos), con canales y cámaras que sirven para el paso del agua. Presentan simetría radial o sin simetría, epidermis de células aplanadas con pinacocitos; gran parte de las cavidades internas tapizadas por células flageladas con embudo o collas (Coanocitos), que provocan las corrientes de agua; una matriz proteínica, gelatinosa, llamada mesohilo (mesoglea) contiene amebocitos de varios tipos y elementos esqueléticos. Esqueleto de espículas cristalizadas, calcáreas o silíceas, o bien proteico (espongina), o combinación de espículas silíceas y espongina. No tienen verdaderos órganos no tejidos; la digestión es intracelular; excreción y respiración por simple difusión. Todos los adultos son sésiles. Se reproducen asexualmente por gemación o bien por gémulas y sexualmente, mediante óvulos y espermatozoides; las larvas, flageladas (anfiblástula y paranquímula), nadan libremente. Todos son acuáticos, la mayoría de las más de 5000 especies de esponjas son marinas, aunque unas 150 viven en aguas dulces. Objetivo Conocer algunos de los Géneros representativos de la Clase Demospongia, así como los elementos que constituyen su exoesqueleto. Elaborar una preparación permanente de espículas y fibras de espongina. Material Biológico Ejemplares de esponjas Sustancias Ácido nítrico concentrado Cloro comercial Rojo neutro Alcoholes (30, 50, 70, 96%) Xilol Bálsamo de Canadá 70
Cristalería Portaobjetos Cubreobjetos Vasos de precipitado Equipo Microscopio Óptico Microscopio estereoscópico Pinzas de disección Goteros Mechero Tripie Tela de asbesto Procedimiento metodológico 1. Observación e identificación de esponjas microscópicas a) observar y esquematizar ejemplares representativos de la Clase Demospongiae, señalando sus estructuras principales (Pinacordemis, ostiolos, ósculos). 2. Elaboración de una preparación permanente de espículas y fibras de espongina a) Para fibras de espongina: Realizar un corte sagital y otro transversal de la esponja, los cortes deben ser muy finos. Colocar el corte en un portaobjetos y agregar agua o una gota de rojo neutro; cubrir la preparación y observar las fibras de espongina y su arreglo. b) Para espículas: Hervir un trozo de esponja en acido nítrico concentrado, o colocarlo en cloro comercial, decantar y añadir agua de la llave, repetir este proceso (lavado) varias veces. Deshidratar en alcoholes graduales (en cada paso dejar sedimentar), hasta alcohol absoluto. Tomar muestra, colocar en un portaobjetos, dejar secar el alcohol y montar. Cuestionario 1. Esquematice los tipos estructurales que se presentan en el PhylumPorifera.
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2. Mencione los tipos celulares que se presentan en este grupo y la función de cada uno de ellos. 3. Mencione las características que se toman en cuenta para la clasificación de las esponjas y describa como es su clasificación 4. Describa la importancia ecológica, económica y médica que presentan los integrantes de este Phylum.
Bibliografía Alcolado Menéndez, P. 1986. Las esponjas. Editorial Científico – Técnica. La Habana, Cuba. 56 pp. Jessop, N.M. 1991. Zoología, Invertebrados. Interamericana. Mc Graw – Hill. España294 pp. Gómez, L.P., 1982. Estudio sistemático de las esponjas marinas de Puerto Morelos, Quintana Roo, México. Tesis profesional. Fac. Ciencias U.N.A.M. 111 pp. Green, G. 1977. Sinopsos taxonómica de 13 especies de esponjas del arrecife, La Blanquilla, Veracruz, Ver. México. Ann. Centro de Ciencias del Mar y Limnología, Méx. 4(1):79-98. Meglitsch, P.A. 1978. Zoología de invertebrados. H. Blume. Madrid. 906 pp.
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13.Phylum Cnidaria Introducción El filo Cnidarios toma su nombre de las células llamadas Cnidocitos que contienen orgánulos urticantes (nematocistos). Son animales completamente acuáticos, algunos de agua dulce, pero la mayoría marinos. Presentan simetría radial, dos tipos básicos de individuos el pólipo y medusa; su cuerpo formado de dos capas, epidermis y gastrodermis, con mesoglea (diblásticos); algunos son considerados como triblásticos ya que la mesoglea presenta células y tejido conectivo (ectomesodermo). Presentan boca rodeada de una corana de tentáculos que comunica con la cavidad gastrovascular (con frecuencia ramificada o dividida por septos). Se reproducen asexualmente por gemación (pólipos) o sexualmente por gametos (medusas y algunos pólipos); formas sexuales monoicas o dioicas; Larva Plánula; segmentación holoblastica. No presentan sistema excretor y respiratorio, presentan un plexo nervioso subepidérmico con sinapsis simétricas y asimétricas, con algunos órganos sensoriales. Objetivo Conocer la morfología de algunos Géneros representativos de las Clases que integran el Phylum (Clase Hidrozoa, Scyphozoa y Anthozoa). Clase Hidrozoa Material Biológico Ejemplares de hidroideos: Obelia, Aglaophenia, Physalia, MIllepora. Hidromedusas: Aglauray/o Liriope. Equipo Microscopio óptico Microscopio estereoscópico.
Procedimiento metodológico 73
1. Observar y elaborar un esquema de Aglaophenia y/o Obelia y señalar las siguientes estructuras: Hidrocaulo, cenosarco, perisarco, hidroteca, gastrozoides, dactiolozoides y gonozoides. 2. Esquematizar la hidromedusa y señalar las siguientes estructuras: Umbrela, tentáculos y bulbos tentaculares, estatocistos, manubrio, boca, canales radiales y circular, gonadas. 3. Millepora, es un hidrozoario colonial denominado falso coral o coral de fuego, el cual se caracteriza por presentar un exoesqueleto de Carbonato de Calcio, similar al que presentan los corales madrepóricos de la clase Anthozoa. Esquematizar y observar detenidamente la forma de la colonia y esquematizar la Fragata portuguesa Physalia, señalar las siguientes estructuras: flotador o pneumatóforo, gonozoides, gatrozoides y tentáculos. Clase Scyphozoa Material Biológico Ejemplares de: Chrysaora yStomolophus Equipo Microscopio óptico Microscopio estereoscópico. Procedimiento metodológico 1. Elaborar esquemas de los ejemplares y señalar en ellos las siguientes estructuras: Boca, brazos orales, bolsa gástrica, gónadas, tentáculos, ropalia. Cuestionario 1. Describa la importancia ecológica, económica y médica de las medusas 2. Señale la importancia de la larva plánula en la filogenia del Phylum. Clase Anthozoa Material Biológico Ejemplares de Anemonas de Mar Madreporarios: Oculina, Diploria, Siderastrea, Montastrea. Corales blandos: Gorgonia, Plexaurella Equipo 74
Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Procedimiento metodológico 1. Las anemonas (pólipos solitarios) se caracterizan por presentar externamente un disco basal, una columnela y una boca rodeada de una corona de tentáculos una faringe y una cavidad gastrovascular septada, con filamentos libres o acantia. Pertenecen a la subclase Zoantharia y al Orden Actiniaria. Esquematizar los ejemplos y señalar las estructuras mencionadas. 2. En la subclase Zoantharia, Orden Madreporaria o Scleractinia se incluyen pólipos coloniales que presentan un exoesqueleto calcáreo. Esquematizar los ejemplares y observar la forma de la colonia y las cavidades septadas donde se alojaban los pólipos. 3. Gorgonia y Plexaurellia son Géneros pertenecientes a la subclase Alcyonaria y al orden Gorgonacea. Observar y esquematizar. Cuestionario 1. Mencione las características de importancia taxonómica en las subclases de la clase Anthozoa. 2. Explique la importancia que presenta el tener una larva planctónica en estos organismos sésiles. 3. Describa como quedaría estructurada una cadena trófica en un arrecife coralino.} 4. Describa cuales son los factores que revisten importancia en la distribución de los arrecifes.
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14. 1. Práctica Extramuro Introducción En el medio marino, las costas rocos constituyen un sustrato firme, que se caracteriza básicamente por presentar perfil muy irregular, pero adecuado para el desarrollo de una gran diversidad de poblaciones, representadas fundamentalmente por invertebrados sedentarios o sésiles. En estos sustratos los organismos presentan patrones de zonación o de distribución, que se explica tomando en cuenta la influencia, de factores abióticos y las interacciones bióticas. Entre los primeros se pueden mencionar características tales como la pendiente, la orientación, conformación, etc., que son variables, por lo que afectan el desarrollo de las poblaciones; sobre este factor actúan los ciclos de mareas, la temperatura, el oleje, la salinidad y la desecación, causas importantes que detrminan la presencia de los organismos en este hábitat. Las interacciones bióticas como son la alimentación, que en los organismos herbívoros depende del gran desarrollo de fitobentos, la competencia por el sustrato y la depredación son preponderantes para la zonación de los organismos en los li torales rocos. En general se reconocer que se pueda dar una regla absoluta en cuanto a la composición faunística y florística característica de cada zona, pues la distribución de los organismos depende tanto de la latitud como de la interacción de las mareas y de las olas.
Objetivo Determinar la composición, abundancia y distribución de la fauna (invertebrados) que tipifica el litoral rocoso del medio marino de Punta Delgada, Veracruz. Se conocerán y utilizarán métodos y técnicas de colecta para algunos grupos de invertrebrados. Se conocerán y aplicaran algunas técnicas y métodos de muestreo.
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Material Para campo (por equipo): Mapas de la localidad Guías de campo para el reconocimiento de los invertebrados 1 libreta y 1 lápiz 2 estacas de 1.70 m 1 estaca de 2.10 m 15 m. de hilo de cáñamo o nylon 1 cinta métrica 1 cuchillo o navaja 3 marcos de madera de 20 x 20 cm 20 ligas y para etiquetas de colgar 10 bolsas de plástico medianas (30 cm) 10 bolsas de plástico chicas (10 cm) 1 plomada 1 cubeta con tapa Salvavidas (chaleco), visor y snorkel Para el proceso de datos: Papel milimétrico 1 regla 1 calculadora Plumones de colores Guías, claves para identificar, artículos y libros de consulta. Procedimiento metodológico En el campo: 1. Observe determinadamente la zona de trabajo, seleccione el sitio donde se puede realizar el transecto y represéntelo gráficamente en su libreta. 2. Coloque las estacas, la primera de 1.70 m. donde se inicia la franja de las litorinas, la tercera de 2.10 m. en donde aparecen los erizos o hasta donde las condiciones de trabajo lo permitan, la segunda estaca se coloca en un punto intermedio entre las dos estacas previamente colocadas. Tienda el hilo nylon lo más recto posible, si se puede, nivele con respecto a la línea de costa. Tome la distancia con ayuda de una plomada y la cinta métrica entre el hilo y el sustrato cada 20 cm (Fig. 1) no olvide tomar la primera medición 80
en al estaca que se ha colocado sobre la franja de las litorinas. Anote los datos obtenidos en una libreta. 3. Ponga los marcos de madera sobre el sustrato, iniciando en la primera estaca, reconozca los organismos encontrados y cuéntelos, anote los datos en su libreta de la siguiente manera: CUADRANTE N°1 Organismo
Número total de individuos por especie
Recolectado (Sí o No)
Especie 1
10
Sí
Especie 2
20
No
Especie 3
20
No
Esto se realiza de manera continua desde la primera estaca hasta la tercera, por lo tanto se estudiaran tantos cuadrantes como se necesiten para abarcar la distancia total de transecto, si se tiene una longitud de 4m., se estudiarán 20 cuadrantes de 20 x 20 cm. Al terminar cada cuadrante, revise que todos los datos estén debidamente anotados en su libreta. 4. En caso de no poder identificar algún organismo in situ, despréndalo cuidadosamente con el cuchillo o navaja para poderlo meter en un bolsa de plástico agragando un poco de agua del medio, anote en una etiqueta sus datos (n° de organismo, fecha, localidad, n° de cuadrante), colóquela en la cubeta previamente cerrada con una liga para poderla transportar al laboratorio donde se procederá a su identificación con la ayuda de la bibliografía especializada. Procesamiento de Datos: 1. Grafique en el papel milimétrico los puntos de muestro cada 20 cm. Contra la altura del hilo para poder obtener el perfil del litoral rocoso estudiado (Fig.2). 2. Para determinar la distribución de los organismos a lo largo del transecto, maneje los datos de la siguiente manera: a) Obtenga el total de los organismos de especie “X” en todos los cuadrantes del tran secto (que representará el 100% de la especie “X”), cuente los organismos de esta especie en cada cuadrante y obtenga su porcentaje respecto al total de la especie correspondiente.
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Esto se hará para cada especie de organismo encontrado por orden de aparición, como en el siguiente ejemplo:
CUADRANTE 1
N° de organismos observados
Porcentaje
Littorinasp.
30
60
Littorianasp.
20
40
Nerita sp.
10
33
Purpura patula
10
33
Nerita sp.
20
66
Purpura patula
20
66
CUADRANTE 2
CUADRANTE 3
Por lo tanto en el cuadrante n° 1 con Littorina sp. 50 – 100% Donde 50= N° total de Littorinas en el transecto 30 – X 30= N° de Littorinas en el cuadrante 1. El porcentaje de Littorina sp. En el cuadrante 1 es igual a 60% Realizar el mismo procedimiento para cada una de las especies en cada uno de los cuadrantes. b) Trace una escala como la que se sugiere e la figura 2, para representar el porcentaje de cada especie en el transecto. c) grafique en el papel milimétrico, puntos de muestreo (cuadrante1, 2, 3, etc.) contra el porcentaje de organismos de especie por orden de parición (Fig. 2), de esta manera se obtendrá una grafica de barras, donde se podrá representar la distribución de los organismos encontrados en el transecto. 3. Haga un grafica de la curva acumulativa de las especies encontradas en el transecto contra el área acumulativa (fig. 3), tomando como ejemplo la siguiente tabla. 82
N° de especies adicionales que se presentan en cada cuadrante
N° acumulativo de especies adicionales
N° de cuadrante
Área acumulativa (cm2)
N° total de especie por cuadrante
1
20
1
1
1
2
40
3
2
3
3
60
2
0
3
4
80
5
3
6
5
100
6
2
8
6
120
7
1
9
7
140
8
0
9
Con esta curva se puede analizar el valor principal de un juego de mediciones para una variable ecológica, en este caso sería el número de especies encontradas en relación al sustrato. En trabajos ecológicos por lo menos se necesitan estudiar dos zonas con condiciones muy semejantes para poder comparar la riqueza especifica en relación a la variable ecológica. Bibliografía Aladro Lubel, M.A., Martínez Murillo, M.E., Lira Galera, I.E. y V.E Rojas Ruiz. 1992. Guías de practicase campo. Protozoarios e invertebrados estuarinos y marinos. AGT editor, S.A. Barnes, D.R. 1990. Zoología de invertebrados. Interamericana, Mc Graw Hill. 5ª. Ed. México. 900pp. Britton, J.C y B. Morton. 1989. Shore ecology of Gulf of Mexico. University of Texas press. Autin.400 pp. Freeman, W.H y B. Bracegirdle. 1982. Atlas de Estructura de invertebrados. Paraninfo, S.A. Madrid. 129 pp.
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14.2 Protozoarios Asociados a Erizos de Mar. Introducción Mucho se ha estudiado acerca de la ecología de los protozoarios de vida libre y algunos parásitos en humanos o en animales con importancia socioeconómica, sin embargo, poco se conoce al respecto de protozoarios asociados a invertebrados. Los animales multicelulares proporcionan un número considerable de hábitats para los protozoarios asociados, presentándose diversos tipos de simbiosis. Los factores que limitan su presencia, abundancia y distribución son los mismos que afectan a los organismos de vida libre, pero la interacción de estos factores es más compleja, ya que se ven afectados indirectamente por las condiciones a las que se encuentra expuesto el hospedero, que se reflejan en sus fluctuaciones fisiológicas internas. Las necesidades más obvias de un simbionte son: el alimento y el oxígeno; aun cuando en el hospedero existe alimento disponible el simbionte es selectivo, lo que trae como consecuencia a que se encuentre específicamente en diferentes regiones del aparato digestivo, en liquido célomico o que sea intracelular, etc. En cuanto al oxígeno, pueden ser anaeróbicos obligados y facultativos, de igual importancia son otros factores físicos y químicos como el pH, la temperatura CO 2 y tal vez cierto contenido de vitaminas. Una de las asociaciones más frecuentes es las que se da entre los ciliados y el erizo de mar, como en el caso de Metopus, Plagiopyla, Cyclidium y Euplotes del aparato digestivo de los erizos.
Objetivo Determinar los ciliados presentes en el intestino de los erizos de mar de Género Echinometra .
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Material Campo 2 Frascos de boca ancha 1 cubeta con tapa 250 mm de agua de mar Laboratorio Microscopio óptico Microscopio estereoscópico Portaobjetos y cubreobjetos Estuche de disección Alfileres Charola de disección 3 Pipetas Pasteur con bulbo Agua de mar filtrada 2 Cajas Petri Anestésico: cloruro de magnesio: solución al 8% en agua dulce o destilada Colorantes vitales: verde de metilo acuoso al 1% y azul de metileno Claves para identificar y libros de consulta. Procedimiento metodológico Campo Recolectar por equipo de ejemplares de erizo de mar de Género Echinometra y colocarlos en la cubeta con agua de su medio, transpórtalos al laboratorio vivos. Laboratorio 1. Anestesiar a los erizos de mar con una solución isotónica de cloruro de magnesio. 2. Despenda las espinas o córtelas con unas tijeras. 3. Cortar con unas tijeras a la altura del ecuador la testa del erizo, para obtener dos mitades iguales con los bordes lisos. 4. En la región oral se localiza la boca con sus 5 dientes, esta se continúa con la cavidad bucal la cual contienen la linterna de Aristóteles o aparato masticador. La faringe y esófago ascienden a partir de la boca, atravesando la linterna, el anillo acuífero y continua sus camino ascendente plegándose sobre si mismo para continuarse con el intestino que da dos vueltas: una que constituye el intestino delgado proximal y la otra en dirección opuesta que corresponde al intestino grueso distal, el cual desemboca en el recto y este en el ano situado en el periprocto en la región aboral. 5. Localizar y extraer el aparato digestivo, colocarlo en una caja Petri y cubrirlo con agua de mar previamente filtrada. 85
6. Abrir con unas tijeras el aparato digestivo, con una pipeta tomar una muestra del contenido intestinal y colocarlo en un portaobjeto añadiendo si es necesario una gota de agua de mar filtrada, colocar encima un cubre objeto. 7. Observar en el microscopio óptico la preparación, utilizando el objetivo 10X, localizar a los ciliados. Esquematizar cada uno de los protozoarios observados y determinar los Géneros con ayuda de bibliografía especializada. 8. Elaborar varias preparaciones utilizando colorantes vitales para resaltar algunas estructuras que serán de utilidad para su identificación. 9. Elaborar una preparación permanente y presentar el listado de los Géneros de ciliados endocomensales presentes en el intestino del erizo de mar. Bibliografía Aladro Lubel, M.A., Martínez Murillo, M.E., Lira Galera, I.E. y V.E. Rojas Ruiz. 1992. Guía de prácticas de campo. Protozoarios y vertebrados estuarinos y marinos. AGT editor, S.A.
Metopus
Plagiopyla
Euplotes
Cyclidium
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