PRODUKSI LIPASE DARI Aspergillus niger DALAM BIOREKATOR ERLENMAYER
ABSTRAK
Percobaan mengenai aktivitas enzim lipase yang diproduksi oleh Aspergillus niger pada bioreaktor erlenmeyer 100 ml telah dilakukan. Medium fermentasi terdiri MgSO4.7H2O 0,5 g/l, KH 2PO4 1 g/l, NaNO 3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l dan 1% (w/v) minyak . Proses fermentasi dilakukan selama 5 hari. Aktivitas lipase tertinggi 4800 U/ml terjadi pada hari ke-2. pH media pada aktivitas tertinggi sebesar 4. Mukosa habis dikonsumsi pada hari ke-2.
PENDAHULUAN
Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk menghasilkan metabolit atau enzim yang diinginkan di bawah kondisi optimal atau suatu lingkungan yang dikendalikan (Crueger dan Crueger, 1984). Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh sel hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium, komposisi medium, suplai O2 dan agitasi. Jumlah mikroba dalam fermentor juga dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Pengendalian diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu medium fermentasi dipengaruhi oleh banyak faktor baik ekstraseluler maupun intraseluler. Faktor intraseluler meliputi struktur, mekanisme dan genetika, sedangkan faktor ekstraseluler meliputi kondisi lingkungan seperti pH, suhu dan aerasi (Crueger dan Crueger, 1984). Dalam prose fermentasi terdapat dua komponen penting yaitu biokatalis berupa enzim atau sel mikroba dan kondisi lingkungan. Lingkungan optimal dapat dicapai dengan menempatkan wahana yang disebut bioreaktor (Mangunwidjaya dan Suryani, 1994). Bioreaktor menjadi wahana penting dalam industri yang menggunakan reaksi-reaksi biokimiawi yang dikatalisis oleh sel atau enzim. Salah satu enzim yang bisa dihasilkan dari proses fermentasi adalah enzim lipase. Lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi dalam
1
hidrolisis lemak, mono-, di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol (Falony, et al., 2006). Enzim ini juga digunakan dalam hidrolisis triasilgliserol (TAG) menghasilkan diasilgliserol (DAG) dan asam lemak bebas (Putanto, et al., 2006).
Gambar 1. Reaksi hidrolisis trigliserida (Berg et al., 2006) DAG adalah ester gliserol dengan dua molekul asam lemak. DAG digunakan sebagai bahan pengemulsi dan penstabil produk-produk makanan, kosmetika, dan farmasetika. Lipase terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis untuk meningkatkan kualitas crude palm oil (CPO) yang lebih baik yaitu minyak sehat (healthy oil). Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan memperpanjang
umur
simpan),
industri
bir
(meningkatkan
aroma
dan
mempercepat fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak). Sedangkan pada industri non pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obatobatan (mempermudah daya cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi. Lipase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, manusia, yeast, jamur, dan bakteri. Kelompok yeast yang dapat manghasilkan lipase adalah dari Candida rugosa, dan dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium
2
aurantiogriseum . Adapun pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan adalah
dari genera Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter , Chromobacterium, Serratia, Vibrio, Aeromonas, dan Staphyloccus (Nurosid,
2008). Kapang adalah penghasil enzim yang diproduksi secara ekstraseluler. Produksi lipase oleh kapang dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya, pH, suhu, sumber karbon dan sumber nitrogen (Rani and Panneerselvam, 2009). Lipase ekstraseluler telah dikenal sebagai biokatalis yang selektif dan efisien pada beberapa industri misalnya biosensor, kimia, farmasi, pestisida makanan, kosmetik dan detergen (Pera, et al., 2006). Kapang Aspergillus niger merupakan salah satu sumber penghasil enzim lipase. Aspergillus niger merupakan mikroba jenis kapang yang dapat tumbuh cepat dan tidak membahayakan karena tidak menghasilkan mikotoksin. Selain itu, penggunaannya mudah karena banyak digunakan secara komersial dalam produksi asam sitrat, asam glukonat dan beberapa enzim seperti amilase, pektinase, amilo-glukosidase dan selulase. Aspergillus niger memiliki daya amilolitik dan proteolitik yang cukup baik, serta dapat menghasilkan enzim fitase ekstraselluler. Hasil fermentasinya dapat digunakan sebagai sumber protein sel tunggal (PST) dan media biakannya sebagai sumber energi potensial. Kapang merupakan mikroba yang 80% kebutuhan substratnya dipenuhi oleh makromolekul yang memiliki rantai karbon. Beberapa jenis kapang diketahui tumbuh pada habitat yang mengandung minyak, misalnya tandan kelapa sawit (Rifaat, et al., 2010). Produksi lipase memerlukan sumber karbon yang dapat berasal dari lipid atau karbohidrat. Untuk memproduksi enzim lipase pada umumnya menggunakan induser berupa minyak zaitun untuk memacu produksinya (Falony, et al., 2006). Pada praktikum ini memanfaatkan minyak goreng sawit sebagai induser, karena minyak goreng sawit ini merupakan produk lokal yang keberadaannya melimpah.
3
BAHAN DAN METODE
Bahan yang digunakan dalam percobaan adalah kapang Aspergillus niger , Potato Dextrose Agar, minyak 1% (b/v), ekstrak khamir 1 g/l, MgSO 4.7H2O 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l, NaNO 3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan, vortex, erlenmeyer, labu ukur, pipet, kertas pH, shaker, autoklaf, kertas saring, oven, alat titrasi dan alat vakum.
Regenasi Kultur Aspergillus niger Aspergillus niger dari stok kultur ditumbuhkan pada media PDA miring
dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah berumur 5 hari, Aspergillus niger siap untuk digunakan.
Pembuatan Media Propagasi
Pembuatan media propagasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g MgSO4.7H2O, 0,1 g KH 2PO4, 0,3 g NaNO 3, 0,1 g ektrak khamir, 3 g pepton dan 1 g glukosa dengan 100 ml aquades pada erlenmeyer, yang sebelumnya sudah ditambah dengan minyak 1% sebanyak 2. Pada saat pembuatan media, larutan gula dipisahkan dengan bahan media lainnya. Selanjutnya media diatur pH-nya menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121 oC, selama 15 menit.
Pembuatan Media Fermentasi
Pembuatan media fermentasi dilakukan dengan melarutkan minyak 1% (b/v), ekstrak khamir 1 g/l, MgSO 4.7H2O 0,5 g/l, KH 2PO4 1 g/l, NaNO3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l. Pada saat pembuatan media, larutan gula dipisahkan dengan bahan media lainnya. Volume untuk seluruh erlenmeyer adalah 1,2 liter. Selanjutnya media diatur pH-nya menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121 oC selama 15 menit.
Produksi Lipase
Kapang Aspergillus niger yang telah tumbuh pada media agar miring, diberi aquades steril sebanyak 10 ml. Kemudian spora A. niger dilepaskan dari
4
agar dengan menggunakan ose. Selanjutnya spora A. niger diinokulasi pada media propagasi sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi pada inkubator goyang (shaker) pada suhu kamar selama 24 jam. Suspensi A.
niger yang
sudah
tumbuh
pada
media
propagasi
diinokulasikan pada kedua jenis bioreaktor sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi pada inkubator goyang (shaker) pada suhu kamar. Selanjutnya pengamatan dan pengambilan sampel dilakukan setiap hari selama hari.
Pengukuran pH
Pengukuran pH dilakukan dengan mengambil sampel dengan volume tertentu, kemudian kertas pH dimasukkan ke dalam suspensi tersebut. Selanjutnya hasil pengukuran dibandingkan dengan indikator pH
Pengukuran Biomassa
Pengukuran biomassa dilakukan dengan mengambil sampel dengan volume tertentu, kemudian disaring pada kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Selanjutnya kertas saring yang telah berisi biomassa o
dikeringkan dalam oven 50 C sampai beratnya konstan. Biomassa dihitung sebagai bobot residu kering hasil penyaringan per ml cairan kultivasi.
Pengukuran Gula Pereduksi
Pengukuran gula pereduksi dilakukan dengan memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan pereaksi DNS sebanyak 3 ml. Selanjutnya dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit kemudian didinginkan. Setelah itu sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Selanjutnya nilai absorbansi diplotkan pada kurva standar untuk dapat mengetahui nilai kadar gula sisa.
Pengukuran aktifitas enzim
Pengukuran aktifitas enzim dilakukan dengan memasukkan 2 g minyak filma ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 4 ml buffer asetat 0,05 M pH 5.6, 1 ml CaCl 2 1 M dan 1 ml larutan enzim. Selanjutnya campuran larutan
5
tersebut
o
iinkubasi pada hot plate stir er 30 C
elama 1 jam. Kem dian
diinaktivasi dengan seton:buta ol (1:1) 10 ml. Setela itu ditam ahkan ind kator PP 1% 2- tetes dan dititrasi de gan KOH 0,01 N sa pai terben uk warna
erah
jambu.
HASIL PENGAMATAN
Tabel 1. K nsentrasi (mM)
ata kurva standar glukosa Absorbansi 550) Ulangan 2 Ulangan 1
0
0
0,073
50
0,018
0,091
100
0,201
0,274
150
0,455
0,528
200
0,679
0,752
250
0,888
0,961
Gambar 2. Hubunga antara Ko sentrasi glukosa dengan Absorbansi pada 5 0 nm
6
Gambar 3. Hubung n antara biomassa ya g dihasilkan () den an konsentrasi gula sis () dan H larutan ()
Ga bar 4. Hub ngan anta a biomassa () dengan aktivitas lipase yang dihasilka () PEMBA ASAN
Selama mas inkubasi, sel A.
iger pada mulanya berbentuk bulat
sempurna seperti bola yang menandakan terbentuk ya miselia dengan u uran
7
yang hampir seragam. Hal ini berarti kultur tersebut secara keseluruhan mendapat asupan nutrisi yang sama sehingga dapat tumbuh secara seragam. Namun pada perkembangan selanjutnya terjadi kompetisi yang bila dilihat tampak pada kepadatan sel yang terdapat dalam labu erlenmeyer. Pengocokan yang kurang merata mengakibatkan sebagian sel berada di atas permukaan dan sebagian tetap berada di bagian bawah permukaan. Sel yang terdapat di atas permukaan menghasilkan spora berwarna hitam, sel yang kurang intens kontak dengan media berakibat pada kurang produktif dalam menghasilkan enzim lipase karena inducernya berada di larutan. Penambahan minyak pada media berfungsi sebagai inducer untuk merangsang agar sel dapat menghasilkan enzim lipase seperti yang diungkapkan oleh Pera et al (2006) bahwa penambahan minyak zaitun (olive oil) merangsang pembentukan enzim lipase A. niger strain MYA 135 dibanding dengan media tanpa penambahan minyak zaitun.
Biomassa
Dari percobaan diperoleh hasil terjadinya peningkatan biomassa selama masa inkubasi dengan jumlah total biomassa yang terbentuk sebanyak 26,42 g/l. Terjadi peningkatan jumlah biomassa sebanyak 195%. Peningkatan biomassa ini sejalan dengan penurunan konsentrasi gula sebagai substratnya. Pola pertumbuhan A.niger meningkat hingga hari ke 2, kemudian cenderung mendatar hingga hari ke 3 dan terjadi penurunan pada hari ke-4. Kenaikan yang terjadi pada hari ke-5 tidak tampak signifikan sehingga dapat dianggap konstan karena konsentrasi glukosa pada hari ke-5 sudah habis.
pH
Nilai pH lingkungan merupakan faktor yang sngat menentukan dalam pembentukan miselia dan produksi enzim lipase pada A niger (Rifaat et al., 2010). Pada masa inisial, pH kultur awal adalah 6, hal ini menurut penelitian Falony et al (2006) merupakan pH optimum untuk aktivitas lipase dan pada pH ini juga mendukung kestabilan enzim lipase dari A. niger J1. Hal serupa juga diperoleh dari penelitian Crueger et al (1993) yang menggunakan A. niger tipe lain.
8
Pada 48 jam setelah inkubasi, terjadi penurunan pH hingga mencapai 4 dari nilai pH awal 6. Hal ini dapat dijelaskan dengan melihat aktivitas enzim lipase yang terbentuk selama kurun waktu tersebut. Sel memproduksi lipase pada kurun 48 jam pengamatan, sehingga terjadi degradasi trigliserida (minyak) menjadi asam lemak yang bersifat asam karena gugus karboksil yang ada di ujungnya. Akumulasi asam lemak yang terbentuk megakibatkan tingginya konsentrasi ion hidrogen yang berakibat pada penurunan pH larutan. H3C-(CH2)n-COOH
-
H3C-(CH2)n-COO + H
+
+
Ionisasi asam lemak pada larutan menghasilkan ion hidrogen (H ) yang berakibat pada penurunan pH larutan. Selama masa inkubasi terjadi fluktuasi pH yang menandakan terjadinya metabolisme, hal ini ditandai dengan menurunnya konsentrasi glukosa karena dikonsumsi oleh sel untuk pertumbuhannya. Nilai pH pada awal reaksi adalah 6 kemudian menurun setelah 48 jam pertama menjadi 4. Setelah hari ke-2 terjadi trend peningkatan pH hingga khirnya mencapai pH 5,5. Hal ini diakibatkan oleh terakumulasinya produk hasil metabolisme A.niger yaitu berupa amonia (NH 3) yang bersifat basa. Terbentuknya amonia
dapat terjadi akibat metabolisme protein yang terpotong menjadi asam amino untuk kemudian tereksresi sebagai amonium akibat aktivitas amonifikasi. Kenaikan pH pada hari ke-3 menandakan terjadinya konsumsi asam lemak bebas oleh sel untuk pemenuhan kebutuhan sumber karbon dan energinya. Akibatnya, pH larutan kembali meningkat hingga pH 5,5 di akhir masa inkubasi.
Sumber Karbon
Karbon merupakan komponen utama sel, sehingga asupan karbon merupakan hal yang snagat penting. Berbagai sumber karbon yang bisa dipakai untuk produksi enzim lipase seperti laktosa, fruktosa, xylosa, glukosa dan gliserol (Rodriguez et al., 2006). Rifaat et al (2010) memperlihatkan bahwa berbagai sumber karbon memberikan pengaruh yang berbeda pada hasil produksi biomassa dan aktivitas lipase yang dihasilkan. Hasil penelitian tersebut memberikan hasil bahwa karbohidrat sebagai sumber karbon lebih bagus untuk produksi bimassa sementara trigliserida lebih baik untuk produksi lipase dengan aktivitas lipase
9
tertinggi dihasilkan pada media yang mengandung minyak zaitun sebagai sumber karbonnya. Sumber Nitrogen
Produksi lipase memerlukan sumber nitrogen yang dapat berupa nitrogen organik dan anorganik. Sumber nitrogen anorganik berada dalam bentuk NO
3-
,
efektif untuk produksi lipase tetapi bukan untuk produksi biomassa sel. Pepton, Malt ekstrak, kasein, yeast ekstrak, dan corn steep liquor merupakan sumber nitrogen kompleks untuk produksi lipase.
Freire et al. dalam Rifaat 2010
menyatakan bahwa pepton mengandung kofaktor asam amino yang sesuai dengan kebutuhan fisiologis untuk produksi lipase. Pepton juga berpengaruh terhada produksi lipase pada Aspergillus sp. dan
Fusarium sp (Rifaat, 2010). Kadar
pepton yang digunakan sebagai sumber nitrogen berpengaruh terhadap aktivitas lipase dan produksi biomassa sel (Rodriguez et al, 2006). Pada praktikum ini, digunakan tiga sumber nitrogen yaitu : NaNO 3, Yeast ekstrak dan pepton yang telah terbukti efektif untuk meningkatkan produksi lipase. Adapun hasil aktivitas lipase terbesar diperoleh pada hari ke-2 sejumlah 4800 U/ml. Dari beberapa penelitian terdahulu, semua sumber nitrogen telah diuji pengaruhnya terhadap produksi lipase. Akan tetapi, untuk urea tidak dapat digunakan sebagai sumber nitrogen karena bersifat toksik bagi kultur (Rifaat, 2010).
Aktivitas Lipase
Enzim lipase yang dihasilkan paling tinggi pada hari ke-2 sebesar 4800 U/ml. Aktivitas tertinggi menandakan bahwa kemampuan untuk menghidrolisis trigliserida paling tinggi, sehingga akan dihasilkan asam lemak bebas paling tinggi. Dari gambar 4 terlihat bahwa pada hari ke-2 nilai pH kultur paling rendah, hal ini sebagai akibat dari pelepasan asam lemak hasil hidrolisis. Setelah hari ke-3 aktivitas enzim menurun secara drastis yang menandakan bahwa tidak ada aktivitas lagi setelah hari ke-3.
10
Aktivitas lipase yang dihasilkan sangat tergantung pada komposisi media yang dipakai. Pada percobaan pemakaian substrat glukosa dengan penambahan minyak zaitun menstimulasi pembentukan lipase (Rifaat et al., 2010). Penrunan pada hari ke-3 menandakan bahwa waktu pemanenan terbaik enzim ini adalah pada hari ke-2, karena pada hari berikutnya telah terjadi kerusakan enzim yang ditandai dengan rendahnya aktivitas enzim tersebut. stabilitas enzim lipase yang dihasilkan sangat rendah karena lifetime-nya yang singkat. Hal ini kemungkinan diakibatkan oleh karena substrat untuk pertumbuhannya (glukosa) telah habis, sehinga sel tidak menghasilkan enzim lagi tapi memakainya untuk memenuhi kebituhan sumber nutrisinya. Glukosa merupakan gula yang sederhana sehingga dimanfaatkan pada waktu awal, dan setelah glukosa habis sel baru memanfaatkan trigliserida sebagai nutrisinya.
KESIMPULAN
Aktivitas lipase tertinggi 4800 U/ml terjadi pada hari ke-2. pH media pada aktivitas tertinggi sebesar 4. Mukosa habis dikonsumsi pada hari ke-2.
DAFTAR PUSTAKA th
Berg, J.M., J.L. Tymoczko, and L. Stryer. 2006. Biochemistry 5 Ed. W.H. Freeman and Company. New York. 1514 p Cruege, W. dan A. Crueger. 1984. Biotechnology. A Textbook of Industrial Microbiology. Science Associates, Inc. Sunderland, MA. 01375 Falony, G., J. C. Armas, J. C. D. Mendoza and J. L. M. Hernández. 2006. Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger by Solid-State Fermentation. Food Technol. Biotechnol. 44 (2) 235–240 Mangunwidjaja, D. dan A. Suryani. 1994. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya. Pera, L. M., C. M. Romero, M. D. Baigori and G. R. Castro. 2006. Catalytic Properties of Lipase Extracts from Aspergillus niger. Food Technol. Biotechnol. 44 (2) 247–252 Putranto, R. A., D. Santoso, T. P. Suharyanto, A. Budiani. 2006. Karakterisas i gen penyandi lipase dari kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Menara Perkebunan. 74(1). 23-32
11
Rani, C. and A. Panneerselvam. 2009. Influence of Environmental and Nutritional Parameters on Lipase Production. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science. 4(5). 39-43 Rifaat, H. M., A. A. El-Mahalawy, H. A. El-Menofy and S. A. Donia. 2010. Production, Optimization and Partial of Lipase from Fusarium oxysporum. Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation. (5)1: 39-53 Rodriguez, J.A., J.C. Mateos, J. Nungaray, V. Gonza’lez, T. Bhagnagar, S. Roussos, J. Cordova and J. Barrati. 2006. Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solid state fermentation. Process Biochemistry 41:2264–2269
12
