UNIVERSIDAD AUTÓNOMA JUAN MISAEL SARACHO FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA CÁTEDRA DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL INSTRUMENTAL QMC 031 PRACTICA # 3 SEPARACIONES SEPARACIONES III – CROMATOGRAFÍA CROMATOGRAFÍA E INTERCAMBIO IÓNICO 1. FUNDAMENTO. La cromatografía es una técnica analítica que permite la separación de los componentes de una mezcla de acuerdo a la diferencia en su distribución entre dos fases inmiscibles: la fase estacionaria (generalmente sólida) y la fase móvil (líquida o gaseosa). La distribución de los componentes entre las fases se realiza de acuerdo al grado de afinidad química entre las moléculas. La afinidad química puede explicarse a través de la premisa de que lo semejante disuelve lo dice qu quee do doss molé molécu cula lass son son afin afines es si son son capa capace cess de esta establ blec ecer er fuer fuerza zass semejante!. "e dice intermole intermolecular culares es (electros (electrost#ti t#ticas$ cas$ dipolo%di dipolo%dipolo polo inducido inducido$$ dipolo dipolo inducido% inducido%dipo dipolo lo inducido inducido$$ químic químicas$ as$ etc.). etc.). La simil similitu itudd se extien extiende de en alguno algunoss casos casos a molécu moléculas las de tama&o tama&o y forma forma seme'ante. omo en la cromatografía es condición esencial que la fase estacionaria sea totalmente inmiscible con la fase móvil$ los analitos interactan con dos moléculas totalmente distintas entre si. "e *abla de cromatografía en fase normal$ si la fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar. La cromatografía es una técnica que permite separar mezclas de compuestos +strec*amente relacionados. +n las separaciones cromatogr#ficas$ la mezcla se disuelve en una !"$ %&'() (FM$ gas o sólido) y se *ace pasar a través de una !"$ $*"+(,-"(" inmiscible ( FE$ sólido o líquido sobre un soporte sólido). Las fases se eligen de forma que los componentes de la mezcla se distribuyan de modo distinto entre ambas. +sto es posible debido a la influencia de dos efectos contrarios:
R$*$-+(&-: por interacción de los componentes de la mezcla con la fase estacionaria FE. E)/+(&- , D$0)""%($-*, : por interacción de los componentes con la fase móvil FM. +n general$ la mezcla se deposita sobre la fase estacionaria y el paso de la fase móvil a través del sistema da lugar a un desplazamiento distinto distinto de sus componentes. La separación depende del balance de las interacciones interacciones entre los componentes componentes de la mezcla y las dos fases. fases.
,ay muc*os tipos de cromatografía dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria$ de la fase móvil$ del tipo de interacciones que se establecen$ etc. (ver T"2)" 1). -amos a centrarnos en la +,%"*,"!4" 5$ "5,+(&- &)(5,)(6/(5, en la que se utiliza una fase estacionaria sólida o adsorbente 7FE8 de car#cter polar (p. e'. sílica%gel$ almina) y una fase móvil líquida o eluyente 7FM8. Las interacciones suelen ser tipo dipolo%dipolo o puentes de *idrógeno.
Los eluyentes m#s utilizados suelen ser disolventes org#nicos o mezclas de disolventes. La interacción eluyente%molécula depende fundamentalmente de la polaridad del eluyente que viene determinada por el grupo funcional que posee. Los eluyentes aparecen ordenados en la llamada serie eluotrópica y algunos de los m#s usados son (de menos a m#s polar):
ter de petróleo / ciclo*exano / tetracloruro de carbono / benceno / cloroformo / cloruro de metileno / éter etílico / acetato de etilo / acetona / piridina / etanol /metanol / agua / #cido acético +n general en la separación la retención y la selectividad del proceso dependen de:
"8 L" -"*/")$" 5$) "5,2$-*$9 en nuestro caso sílica%gel$ un sólido polar. 28 L" -"*/")$" 5$) $)/:$-*$9 un disolvente o mezcla de disolventes. "e puede modular la separación cambiando el eluyente. +8 L" 0,)"(5"5 5$) +,%0/$*,: viene determinada por el nmero$ naturaleza y disposición relativa de sus grupos funcionales: Los compuestos poco polares se desplazan con facilidad incluso con eluyentes (FM) poco polares$ ya que interaccionan débilmente con el adsorbente ( FE). Los compuestos m#s polares necesitan eluyentes ( FM) m#s polares ya que interaccionan fuertemente con el adsorbente ( FE) y se desplazan con dificultad. +n algunos casos la interacción es tal que se desplazan en forma de punta de flec*a$ como por e'emplo los #cidos carboxílicos.
A8. C,%"*,"!4" $- C,)/%-". La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los m#s utilizados son gel de sílice ("i01) y almina (2l103)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. +l resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que$ por efecto de la gravedad$ *ace mover la muestra a través de la columna. "e establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. 4ebido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer# interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil$ ser#n transportados a diferentes velocidades y se conseguir# su separación. 2sí$ de manera similar a otros tipos de cromatografía$ las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original$ que se recoger#n en fracciones diferentes. La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten m#s eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. 5or lo tanto$ un disolvente polar desplazar# las moléculas$ incluyendo las m#s polares$ r#pidamente a través de la columna. "i el disolvente es muy polar la elución ser# muy r#pida y generalmente *abr# poca separación de los componentes de la mezcla. "i por el contrario el disolvente es muy apolar$ no eluir#n los compuestos de la columna. 5or lo tanto$ la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. 2 menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. +l proceso de cromatografía en columna consta de tres pasos: a) 5reparación de la columna: +mpaquetamiento de la fase estacionaria en la columna. "e prepara una suspensión del adsorbente (fase estacionaria) en el eluyente (fase móvil) y se vierte en el interior de la columna. b) "iembra de la muestra: La muestra se deposita (siembra!) en la superficie superior del adsorbente contenido en la columna con la ayuda de una pipeta. "i la muestra es líquida se puede sembrar directamente$ si es sólida se siembra una solución concentrada de la misma en un disolvente adecuado (de ba'a polaridad). c) 4esarrollo6+lución de la columna: 7na vez sembrada la muestra se permite el paso de la fase móvil a través de la fase estacionaria y se van recogiendo fracciones consecutivas del eluyente$ que ser#n examinadas posteriormente para determinar su composición. +n 89; se introdu'o una versión modificada denominada cromatografía en columna rápida. La diferencia con la cromatografía en columna tradicional es que en la técnica r#pida el disolvente se *ace atravesar la fase estacionaria aplicando una presión positiva. +sto *ace que las separaciones me'oren en resolución y se pueda disminuir el tiempo de elución$ por lo cual constituye un método de elección.
Elución por gravedad con P
Bomba Peristática
A-;)(( 5$ ), $)/"*, 5$ )" +,)/%-" "i los compuestos separados en una cromatografía en columna son coloreados$ el progreso de la separación se puede monitorizar visualmente. Las sustancias que tienen mayor afinidad por el adsorbente aparecerán en la parte superior de la columna, mientras que aquellas que son retenidas débilmente por la fase estacionaria, aparecerán como bandas más anchas y en la parte inferior de la columna.
No obstante, a menudo los compuestos que deben ser aislados suelen ser incoloros. En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones de eluatos en tubos rotulados y la composición de cada fracción se analiza por cromatografa en capa fina. !na "ez identificadas las diferentes fracciones que contienen el mismo producto, se re#nen, se elimina el disol"ente y se analiza la identidad de los componentes por métodos espectroscópicos. B8. C,%"*,"!4" 5$ C"0" F(-". 7na < implica:
I8 P$0""+(&- 5$ )" 0)"+" depositando la cantidad adecuada de cada muestra. "i la cantidad es excesiva el soporte se satura y la elución da manc*as alargadas= si es escasa$ no se ver# bien la composición de la muestra. II8 E)/+(&-< +s necesario elegir el eluyente que distribuya los compuestos en el centro de la placa$ ni pegados al frente (eluyente demasiado polar)$ ni en la parte ba'a (eluyente poco polar). Los compuestos polares se eluyen bien con eluyentes polares$ y los poco polares$ con eluyentes poco polares.
III8 V(/")("+(&- 5$ ), +,%0/$*,< si son coloreados$ basta la luz visible y sin son activos a la luz ultravioleta$ se utiliza una l#mpara 7- (si las placas contienen un indicador fluorescente). +n los otros casos se necesita un reactivo ( revelador ) que reaccionar# con los productos sobre la placa dando manc*as coloreadas. 2lgunos e'emplos son:
A0)(+"+(,-$ 5$ )" CCF< La < es muy til para: "8 omprobar la pureza de un compuesto$ ya que es una técnica muy sensible. 28 4eterminar los componentes de una mezcla (si la polaridad de los componentes es muy distinta$ se deber#n *acer < con eluyentes de distinta polaridad). +8 >dentificar un compuesto cuando se dispone del patrón correspondiente. "i se sospec*a que una muestra desconocida = es un compuesto conocido A y se dispone de un patrón del mismo$ se colocan en la placa muestras de =$ A y una mezcla de los dos =>A. "e eluye$ y si se observa una sola manc*a en los tres casos$ los compuestos deben ser idénticos. +sto permite diferenciarlos incluso si su polaridad es muy parecida. 5ara asegurarlo se pueden *acer < con distintos eluyentes y confirmar que el resultado es siempre el mismo.
58 "eguir la evolución de una reacción: *aciendo < de la mezcla de reacción M a intervalos de tiempo. 5.e'.$ supongamos que estamos llevando a cabo la transformación A B. on patrones de A y de B (si se dispone) se puede observar la velocidad a la que se consume A y se forma B.
L(%(*"+(,-$< ?o es f#cil separar compuestos de polaridad muy similar. +l estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azcares$ lípidos$ proteínas$ #cidos nucleicos$ etc.) requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas comple'as como son los preparados de cualquier material biológico. 7na de las técnicas bioquímicas m#s cl#sicas y utilizadas para dic*o fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas$ que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico% químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción$ de reparto$ de cambio iónico$ de filtración molecular$ *idrofóbica y de afinidad)$ o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel$ capa fina$ en columna y de gases). @odas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas$ químicas y biológicas de las distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. +ntre dic*as propiedades podríamos citar: i) 4iferencias en solubilidad en diferentes solventes$ tanto org#nicos como acuosos. ii) 4iferencias en tama&o y forma. iii) 4iferencias en carga. iv) 4iferencias en afinidad por otras biomoléculas. @odas estas propiedades y$ por tanto$ la separación de diferentes compuestos est#n influenciadas por las condiciones del medio de separación$ p,$ temperatura$ fuerza iónica e *idrofobicidad. ,ay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali% y cuantitativa de amino#cidos. +l m#s general y utilizado es el de la reacción con la nin*idrina. La nin*idrina (*idrato de triceto*idrindeno) reacciona con amino#cidos que tengan el grupo amino libre$ dando lugar a la formación de amoniaco y an*ídrido carbónico$ con reducción del reactivo (nin*idrina) a *idrindantina. La *idrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de nin*idrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul%prpura$ con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta.
C8. I-*$+"%2(, I&-(+,.
+l intercambio iónico es un intercambio reversible y estequiométrico de iones entre una fase sólida iónica y una fase líquida externa$ sin un cambio sustancial de la estructura del sólido. La fase sólida consiste usualmente en una matriz polimérica (por lo general una resina) o una red cristalina$ insoluble pero permeable$ sobre la cual se ubican grupos cargados y fi'os y contraiones móviles de de carga opuesta que pueden ser intercambiados por otros iones de la fase líquida externa. +ste método es aplicable generalmente a compuestos iónicos$ o compuestos ionizables (#cidos y bases) y compuestos que pueden interactuar con grupos iónicos (ligandos mono% y polidentados).
C)"(!(+"+(&- 5$ )" $(-"< Los intercambiadores de iones se dividen en dos grandes grupos: catiónicos (o #cidos) y aniónicos (o b#sicos)$ de acuerdo a las cargas negativas o positivas$ respectivamente$ de sus funciones iónicas fi'as y$ consiguientemente$ a su afinidad por las cargas positivas o negativas de los contraiones. ada grupo puede subdividirse$ a su vez$ en dos subgrupos: catiónicas fuertes (A"0 3,) y débiles (A00,$ A0,)$ y aniónicas fuertes (A?A 3) y débiles (A?A 1,$ A?A 1,1).
Los métodos de intercambio iónico se basan en la distribución de especies iónicas entre una solución externa y una fase sólida (resina). Los equilibrios se establecen de acuerdo a las siguientes reacciones:
G"5, 5$ $-*$+/"%($-*,: +l entrecruzamiento de una resina depende de la proporción de 4-B en la copolimerización. "e especifica el grado de entrecruzamiento de una resina indicando el porcenta'e de ese compuesto que contiene$ mediante el signo x! (léase por!) seguida por el nmero que expresa ese porcenta'e$ a continuación del nombre comercial de la resina. Ceneralmente el porcenta'e de 4-B se encuentra entre un D y un 8E$ siendo las resinas x;! las m#s ampliamente usadas. S$)$+*('(5"5: @odos los intercambiadores ex*iben cierto grado de preferencia para una especie iónica en relación a otras. +n una operación que involucra el intercambio entre los iones de una resina catiónica (en su forma protónica) y una solución de un electrolito que contiene iones FGn$ tiene lugar la siguiente reacción:
4onde A % simboliza sitios de intercambio negativos fi'os en la matriz de la resina. +l equilibrio se establece cuando no *ay cambios ulteriores posibles en la relación FGn6,G en la resina. +n el equilibrio$ la concentración de los iones est# dada por la constante de equilibrio o coeficiente de selectividad! (+, F6n) como sigue:
donde r indica la fase de la resina (sólida) y las concentraciones est#n expresadas en peso ion%gramo por gramo de resina. +l coeficiente de selectividad no es una constante$ depende de la proporción de los dos iones que se intercambian$ de la concentración iónica total de la solución y$ para una resina dada$ del grado de entrecruzamiento (al disminuir significativamente el tama&o del poro$ comienza a actuar como un tamiz y sólo intercambian las funciones periféricas). +n la siguiente tabla se dan a modo de e'emplo algunos valores de coeficiente de selectividad: se refieren a equivalentes de ion absorbido a partir de 8 ml de solución por 8 g de resina en la forma ,G (catiónica) o l %(aniónica).
C"0"+(5"5 5$ (-*$+"%2(, (&-(+, 5$ /-" $(-"< La capacidad de una resina es la medida del contenido de sitios activos$ o de la facilidad para tomar contraiones$ en unidad de volumen (nH de meq6ml de resina *meda)$ o en unidad de peso (nH de meq6g de resina seca). La capacidad teórica es el nmero de grupos funcionales por unidad de peso seco. ?o obstante$ depende del estado iónico de la resina. La capacidad en volumen también depende del estado iónico$ sobre todo en las catiónicas débiles$ en las que resulta obvia la diferencia en ionización (y volumen) segn se trate$ por e'emplo$ de la forma A00, o A00?a (en esta ltima ambos$ volumen e ionización$ son muc*o mayores que en la A00,). +n general$ varía con el nmero de moléculas de agua que contenga el ion en su carga de *idratación$ consecuentemente$ una resina se expande o contrae cuando se produce un cambio de iones. +n general$ la capacidad en volumen se refiere al volumen aparente que ocupa el lec*o de la resina en la forma , G (o l%)$ es decir$ al volumen propio de la resina *meda (*inc*ada) m#s el volumen que ocupa el líquido entre las partículas. Las capacidades en peso y en volumen para una resina est#n relacionadas por:
en donde: - b: volumen del lec*o. -I: volumen muerto o intersticial (entre los gr#nulos de la resina) ocupado por la fase líquida. J: fracción de volumen muerto (-I6- b). K-: capacidad en volumen (meq6ml de lec*o). K: capacidad en peso (meq(g de resina seca). M: densidad de la resina *meda (g de resina *meda6ml de resina *meda). r : peso de la resina seca. ": fracción en peso de agua en la resina *meda. MN: densidad aparente de la resina en el lec*o (g de resina seca6ml de lec*o). +l coeficiente de partición est# dado por: +ste coeficiente es an#logo al coeficiente de ?ernst en extracción líquido%líquido. 5ara condiciones dadas$ puede calcularse a partir del coeficiente de selectividad$ si se conocen la capacidad de la resina y la concentración del otro ion participante. "uponiendo que la resina est# cargada inicialmente con iones *idrógeno:
+ste coeficiente es an#logo al coeficiente de ?ernst en extracción líquido%líquido. 5ara condiciones dadas$ puede calcularse a partir del coeficiente de selectividad$ si se conocen la capacidad de la resina y la concentración del otro ion participante. "uponiendo que la resina est# cargada inicialmente con iones *idrógeno:
5ara intercambios entre iones de distinta carga$ el coeficiente de distribución depende en buen grado de la concentración iónica de la solución externa. 5or e'emplo$ en el caso de una resina que *a sido utilizada para ablandamiento de aguas$ cargada por tanto con iones calcio y magnesio$ puede ser regenerada por iones sodio contact#ndola con soluciones concentradas de cloruro de sodio.
S$0""+(,-$ $- +,-*"+*, 5(+$*, 72"*+?8< +n operaciones en batc*$ la técnica consiste en colocar simplemente la resina dentro de la solución de contacto permitiendo que se establezca el equilibrio mediante agitación y tiempo de espera apropiados. Luego se elimina la fase solución por centrifugación. +l coeficiente de partición por sí solo no da información acerca de la proporción de un ion absorbido o no por el intercambiador. 5ara una información m#s específica se necesitan conocer las cantidades de resina (en g) y de solución (en ml) para obtener la cantidad total de ion en la resina y en la fase solución y poder calcular así el coeficiente de distribución 4:
+l grado de intercambio que tiene lugar en una separación batc* est# limitado por la selectividad de la resina en el equilibrio. La absorción completa de un ion por parte de la resina puede producirse cuando O P (- 6 ).8I3. Ba'o condiciones pr#cticas$ un ion puede ser absorbido si O P 8IIII y quedar# en solución cuando O / I$I8.
C,%"*,"!4" 5$ (-*$+"%2(, (&-(+,< La cromatografía de intercambio iónico consiste en separar especies iónicas de igual signo$ en una columna cargada con una resina intercambiadora con funciones fi'as de signo contrario$ aprovec*ando los diferentes coeficientes de selectividad. 5ara ello se carga una columna con una suspensión acuosa de la resina$ la que debe mantenerse permanentemente cubierta de fase líquida (se carga en suspensión totalmente *idratada para evitar explosión de la columna por *inc*amiento de la resina y se mantiene cubierta de líquido para evitar formación de vías de aire). Ceneralmente se procede por la técnica denominada elución$ en la que la introducción de la muestra (solución que contiene los iones a separar) se realiza colocando una fina banda de la misma en la parte superior de la columna. Luego$ los iones son arrastrados en sentido descendente mediante el pasa'e de un eluyente adecuado$ en una serie de procesos de intercambio. "i los coeficientes de los iones de la muestra difieren suficientemente$ cada ion via'ar# por la columna con diferente velocidad y emerger# como una banda distinta. +n operaciones en columna se introduce un nuevo par#metro: coeficiente de partición en volumen$ que se define como sigue:
La relación entre ambos coeficientes de partición (en peso y en volumen) est# dada por:
+l coeficiente de distribución puede calcularse a partir del coeficiente de partición en volumen mediante:
1.% 0BQ+@>-0".%
Aealizar una separación de una mezcla de colorantes aplicando cromatografía de columna. 4eterminar los par#metros de la columna cromatogr#fica y trazar un cromatograma aproximado utilizando curvas calibratorias est#ndar "eparar los pigmentos presentes en un triturado de *o'as de acelga con cromatografía de columna. Aealizar la separación aplicando < de una mezcla de azcares con sustancias org#nicas neutras no polares y revelarlas con una mezcla de #cido sulfrico y etanol. 4esarrollar la separación cromatogr#fica con < de una mezcla de amino#cidos y revelar la placa con rociado con solución de nin*idrina. #lculo del valor de Af para cada uno de los compuestos. Qustificación de las diferencias en Af de los distintos amino#cidos. >dentificación de la naturaleza de compuestos desconocidos$ comparando con el avance de muestras patrón. 4eterminar las capacidades de intercambio de resinas catiónicas y aniónicas. "eparación de mezclas de cationes y de aniones coloreados en base a las diferencias de los coeficientes de selectividad. +nsayo de elución con gradiente de concentración.
3.% F2@+A>2L+".%
Bote de vidrio (#mara romatogr#fica) (1) 5robeta 8I mL 5apel aluminio uentagotas pl#stico G 5untas para < (1) uentagotas de vidrio 5inzas met#licas de disección 5lacas de sílice "ecador (8 por mesa) 2tomizador casero.
D.% A+2@>-0".% D(,)'$-*$ ,exanos % 2cetato de etilo R8:1S +tanol T amoníaco (8:3): R:3S
C,%0/$*, 0"*&
Glucosa Fructosa Maltosa Galactosa Sacarosa
Clutamato. Clicina. Lisina. 5rolina. Leucina. "olución problema de amino#cidos.
"olución problema de azcares
O*,< +tanol. ,idróxido amónico. ?in*idrina.
@. PARTE E=PERIMENTAL.
@.1. C,%"*,"!4" 5$ C,)/%-". "8. S$0""+(&- 5$ /-" %$+)" 5$ +,),"-*$. I. P$0""+(&- 5$ )" C,)/%-"< $reparar una suspensión con %& g slica gel en etanol al '() *apro+. - ml. /omprobar que la lla"e de la columna está cerrada añadir la suspensión de al#mina acti"ada en etanol al '(). 0olpear sua"emente, con un tubo de goma o con el dedo, las paredes e+ternas de la columna para fa"orecer la eliminación de las burbu1as de aire que se puedan haber formado. 2brir la lla"e de la columna y de1ar fluir lentamente el etanol hasta que la altura de éste quede mm por encima de la al#mina. 3urante esta elución inicial la al#mina sedimenta y, al finalizar la elución, debe presentar un aspecto uniforme y una superficie lisa y perpendicular al e1e longitudinal de la columna. El etanol que se obtiene de la columna durante esta parte del proceso se puede reutilizar. NOTA4 a lo largo del proceso cromatográfico la columna nunca debe 5secarse6, es decir, la fase estacionaria debe encontrarse en todo momento cubierta por la fase mó"il, ya que de lo contrario la fase estacionaria se contraera y agrietara.
II. S($%2" 5$ )" %/$*"<
!na "ez compactada la columna se procederá a 5sembrar6, depositar, % ml de la muestra sobre la superficie de la slica gel con la ayuda de una pipeta. 7inalizada la adición de la muestra se abre la lla"e de la columna y se eluye hasta que la muestra sea adsorbida y el ni"el del lquido
quede apro+imadamente % mm por encima de la superficie del adsorbente. 8i la pared interna de la columna se ha manchado con la muestra al depositarla, se la"a de1ando gotear por ella un poco del eluyente *con la ayuda de la pipeta y se eluye de nue"o hasta que el ni"el del lquido "uel"a a quedar % mm por encima de la superficie del adsorbente. 7inalmente se añade % ml de etanol y se eluye de nue"o hasta que el ni"el del lquido "uel"a a quedar % mm por encima de la superficie del adsorbente.
III. E)/+(&- 5$ )" C,)/%-"<
2dicionar, con la ayuda de una pipeta $asteur y lentamente, %- ml de etanol en la parte superior libre de la columna y abrir la lla"e para permitir el flu1o del etanol a tra"és de la al#mina. 2 medida que e"oluciona el cromatograma se obser"a que el azul de metileno eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color azul bien diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior de la misma, mientras que el naran1a de metilo queda retenido en la parte superior. 8i es necesario se añadirá más etanol a la columna durante el proceso de elución. /uando el azul de metileno esté pró+imo a la salida de la columna se procederá a recoger fracciones en matraces Erlenmeyer numerados de forma consecuti"a, hasta que todo el producto se haya recogido y el etanol no presente coloración azul. 3e1ar fluir el etanol a tra"és de la columna hasta que la altura de éste quede cm por encima de la slica y llenar la parte superior libre de la columna de agua destilada *5cambio de eluyente6, con la ayuda de una pipeta $asteur y lentamente. 2brir la lla"e de la columna y de1ar fluir el agua a tra"és de la al#mina. 2 medida que e"oluciona el cromatograma se obser"a que el naran1a de metilo eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color naran1a bien diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior de la misma. /uando el naran1a de metilo esté pró+imo a la salida de la columna se procederá a la recolección de fracciones siguiendo un procedimiento análogo al anterior para el azul de metileno, hasta que el agua no presente coloración.
28. S$0""+(&- 5$ 0(%$-*, '$$*")$. I. P$0""+(&- 5$ )" C,)/%-"<
8imilar a la del inciso *a, pero utilizando etanol al '-).
II. S($%2" 5$ )" %/$*"<
!na "ez compactada la columna se procederá a 5sembrar6, depositar, ml de un e+tracto de acelga o espinaca *e+trado con etanol, i9propanol o he+ano. 7inalizada la adición de la muestra se abre la lla"e de la columna y se eluye con etanol '-) hasta que la muestra sea adsorbida y el ni"el del lquido quede apro+imadamente % mm por encima de la superficie del adsorbente.
8i la pared interna de la columna se ha manchado con la muestra al depositarla, se la"a de1ando gotear por ella un poco del eluyente *con la ayuda de la pipeta y se eluye de nue"o hasta que el ni"el del lquido "uel"a a quedar % mm por encima de la superficie del adsorbente. 7inalmente se añade % ml de etanol y se eluye de nue"o hasta que el ni"el del lquido "uel"a a quedar % mm por encima de la superficie del adsorbente.
III. E)/+(&- 5$ )" C,)/%-"<
2dicionar, con la ayuda de una pipeta lentamente, & ml de etanol '-) en la parte superior libre de la columna y abrir la lla"e para permitir el flu1o del etanol a tra"és de la slica gel. /ontinuar añadiendo porciones de 9: mL del eluyente y anotar todos los cambios en la apariencia de la columna. /onforme las bandas empiezan a ba1ar y a separarse en la columna, recolectar las fracciones de los pigmentos separados en tubos de ensaye numerados. /ambiar de tubo cuando esté lleno hasta dos terceras partes o antes, si se nota un cambio de coloración en el eluyente. ;ientras el mo"imiento de los pigmentos ocurra a una "elocidad apreciable, continuar añadiendo porciones del mismo sol"ente, no importa cuál sea el "olumen utilizado ni cuantos tubos se llenen con el mismo eluyente. 8i ya no hay mo"imiento de los pigmentos, empezar a usar como eluyente el sol"ente puro o la mezcla de la siguiente polaridad decreciente y continuar con el mismo sol"ente hasta que nue"amente ya no haya cambios. /ontinuar eluyendo los pigmentos con sol"entes de polaridad decreciente. El orden de sol"entes que debe seguirse, para esta práctica es el siguiente4 Etanol ---- isopropanol --- metil, etil éter --- ciclohexanona --- hexano
2notar los resultados en una tabla4 los colores de las fracciones recolectadas, el sol"ente con el que se eluyó cada una de ellas y el "olumen apro+imado de cada fracción. 2l terminar la cromatografa, obser"ar los tubos y en base a los colores determinar cuáles de ellos corresponden al mismo pigmento. 2notar en la tabla asignándole el mismo n#mero de compuesto a las fracciones iguales.
@.. C,%"*,"!4" 5$ C"0" F(-". I. P$0""+(&-< 2ntes de comenzar compruebe que todo el material y la zona de traba'o estén perfectamente )(%0(, : $+, . @ome con las pinzas una placa para cromatografía ya cortada y deposítela en una zona limpia y seca de la mesa. on un l#piz dibu'e una línea *orizontal a aprox. 8 cm del borde inferior de la placa. "obre esta línea marque suavemente tantas = como muestras a analizar con especial cuidado en no acercarse a los bordes. Ba'o cada = anote con l#piz el código que indique a que muestra corresponde. IMPORTANTE< las placas no deben tocarse con los dedos en la zona plana. >ntroduzca en la6s cubeta6s de cromatografía el eluyente (*asta una altura de aproximadamente I$U cm). 5ara la separación cromatogr#fica de amino#cidos usar propanol T amoníaco (:3) o o 5ara la sepración cromatogr#fica de azcares usar una de las siguientes mezclas: n%butanol T ,2c T agua (D=8:U) i%propanol T ,2c T agua (3=8:8) @ape la cubeta con tapa de vidrio$ papel de aluminio o un vidrio de relo' para evitar la evaporación. +l nivel de líquido debe quedar por deba'o de la línea de la placa para que no pueda tocar la6s muestra6s. 4isuelva una peque&a cantidad de la6s muestra6s a analizar en un disolvente vol#til intentando que la disolución no esté ni muy diluida ni muy concentrada.
II8 P$0""+(&- 5$ 0"*,-$9 %/$*" : ,)/+(,-$ $'$)"5,"< "8. A%(-,;+(5, 9 3isoluciones patrón de aminoácidos4 %mg4:, "<" 9 3isolución problema *puede contener uno o "arios aminoácidos
28. A+"$ a) 4isolver I.8 ml de anilina (ó I$93 gramos) $ y 8. gramos de #cido ftVlico en 8II ml de butanoW. alentar a 8IIH por 8I minutos y de'ar enfriar. b) Fezclar ;I ml de solución >$ y 1I ml de "olución >> "0L7>0? >: ?a>ID al 1X : 4isolver 1 g de peryodato de sodio en 8II ml de agua "0L7>0? >>: OFnID al 8X en ?a103 al 1X: 4isolver 8 g de permanganato de potasio en 8II ml de carbonato de sodio al 1X el cual previamente se preparó disolviendo 1 gramos de ?a103$ en 8II ml de agua.
III8 S$%2"5, 5$ )" %/$*"<
"umer'a una punta de un capilar para < en la disolución patrón o muestra y una peque&a cantidad de líquido ascender# por capilaridad. 2poye suavemente la punta en la = correspondiente sobre la placa y de'e que la disolución descienda *asta formar un peque&o círculo. La manc*a debe ser lo m#s peque&a posible para una separación óptima (aprox. 1 mm) y nunca debe solaparse con las contiguas. 4e'e secar al aire y compruebe si *ay suficiente muestra mirando la placa a la luz 7-. "e deben ver círculos morados oscuros en los puntos donde se *a depositado la muestra. "i no *ay suficiente cantidad puede a&adir de nuevo$ pero de'ando secar antes de eluir. 5ara comparar con patrones se *ace directamente la mezcla de la muestra y el patrón (Fixto) sobre la placa. +l líquido que contiene la punta suele ser suficiente para depositar un poco en la = de la muestra y poner un poco también en la = del toque mixto.
IV8 E)/+(&-< on ayuda de las pinzas introduzca cuidadosamente la placa en la cubeta (de'e que la parte superior se apoye ligeramente en la pared). @ape la cubeta y de'e que ascienda el eluyente por capilaridad. 2segrese de que el frente del disolvente sube igual en toda la placa$ si sube torcido saque r#pidamente la placa y consulte al profesor6a. uando el frente del eluyente llegue a aprox. I$U cm del borde superior$ saque la placa$ marque con l#piz la línea del frente (altura a la que *a llegado el eluyente) y de'e evaporar el disolvente al aire en la vitrina.
V8 V(/")("+(&- 5$ ), +,%0/$*,< a). !eparación de me"clas de a"#cares
2l concluir la separación cromatogr#fica$ de'ar secar la placa sobre el mesón a temperatura ambiente. Aociar cuidadosamente con la disolución de revelado 4e'ar secar nuevamente en estufa a ;IH durante 8U min. -isualizadas las manc*as$ trazar un borde alrededor de cada una con un l#piz. >dentificar los azcares de cada patrón y de la muestra y calcular sus valores de Af.
b). !eparación de una me"cla de aminoácidos.
@erminada la cromatografía se saca la placa$ se marca la distancia recorrida por el eluyente$ se seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un pulverizador que contiene la solución reveladora de ?in*idrina I$1X p6v (en la campana de gases). La placa se secar# *aciéndole llegar aire caliente con el secador.
@.3. I-*$+"%2(, I&-(+,. I. D$*$%(-"+(&- 5$ )" +"0"+(5"5 5$ (-*$+"%2(, 5$ )" $(-"<
"8. R$(-" C"*(&-(+"<
olocar un tubo de vidrio en posición vertical y cerrar$ con pinza de Fo*r$ el tubo de goma colocado en su extremo inferior. 2gregar agua destilada *asta Y de su altura total. olocar en una probeta la resina suspendida en agua destilada. La misma debe estar pretratada (en contacto batc*) y en forma protónica. 4e'ar sedimentar y medir el volumen de la resina. -olverla al vaso de precipitado y transvasarla a la columna$ de'ando drenar agua destilada a un vaso$ *asta que el nivel en la columna quede unos U cm por encima de la resina. (nunca de$ar %ue el nivel del li%uido %uede por deba$o de la resina). "ustituir el vaso de precipitado por un +rlenmeyer de UII ml y comenzar el agregado del ?al U X$ en la columna$ en porciones de 8I%1I$ regulando el caudal del efluente a unas 1I gotas por minuto$ recogiéndolo en el +rlenmeyer. 2gregar nuevas porciones de ?al cuando el líquido desciende a menos de U cm por encima del nivel de la resina. omprobar el p, del efluente con papel indicador universal. uando el p, del efluente sea neutro al papel$ suspender el agregado de la solución de ?al. Aetirar el +rlenmeyer y sustituirlo por un vaso de precipitado$ entonces *acer pasar agua destilada a través de la columna para lavar la resina. @itular el líquido del +rlenmeyer con solución valorada de ?a0, I$8?. @rasvasar la resina a la probeta y medir su nuevo volumen una vez sedimentada. Luego volver al vaso de precipitado y regenererla con ,l D F.
28. R$(-" A-(&-(+"<
5roceder ídem que en (a)$ solo que empleando ?a0, DF para la preparación y regeneración de la resina y solución valorada de ,l I$8? para la titulación respectiva.
II. P$0""+(&- 5$ )" C,)/%-" 5$ I-*$+"%2(,< "8. C,)/%-" 5$)"5" 0"" $0""+(&- 5$ ")$ +,),$"5".
@omar dos buretas de 8I ml y colocar en su interior u trozo de algodón (no apretado)$ recorriéndolo al fondo de la bureta con una varilla de vidrio. ,umedecer con agua destilada y llenar la primera con una suspensión de resina de intercambio catiónica y la segunda con resina de intercambio aniónica= ambas *asta un volumen de lec*o empacado de 8I ml. olocar un tapón de algodón m#s delgado en la parte superior y saturar lentamente ambas a sus formas sódica y de cloruro con una solución de ?al de mediana concentración. (velocidad de flu'o de 8 ml6min)$ durante unos 8U minutos. Lavar las dos columnas con abundante agua destilada. olocar en la parte superior de la resina catiónica 8 ml de una muestra de una mezcla de cationes de coloraciones intensas y en la resina aniónica 8 ml de una mezcla de aniones coloreados provistos por el docente. 4e'ar penetrar la muestra en la parte superior de la columna$ agregando a continuación primero unos mililitros de agua destilada y posteriormente una solución de concentración creciente de cloruro de potasio en la columna de intercambio aniónica y de sulfato de sodio en la columna aniónica.
28. C,)/%-" /$" 0"" $/(%($-*, 5$ )" '$),+(5"5 5$ "*/"+(&- : $0""+(&- 5$ ")$ +,%0)$".
@omar dos ampollas de separación graduadas de UI ml y colocar en su interior u trozo de lana de vidrio$ recorriéndola al fondo de la ampolla con una varilla de vidrio.
,umedecer con agua destilada y llenar la primera con una suspensión de resina de intercambio catiónica y la segunda con resina de intercambio aniónica= ambas *asta un volumen de lec*o empacado de DI % DU ml. olocar un tapón de algodón m#s delgado en la parte superior y saturar lentamente ambas a sus formas protonada e *idroxílica respectivamente a&adiendo para tal efecto soluciones de ,l D? en la primera y de ?a0, D? en la segunda. (velocidad de flu'o de U ml6min)$ durante unos 1I minutos. >nterrumpir el flu'o 'usto cuando el borde superior del líquido esté al mismo nivel de la parte superior de la columna. @apar las ampollas en espera de la siembra de las muestras que se quieren separar.
III. E)/+(&- 5$ )" C,)/%-" 5$ I-*$+"%2(,< "8. S$0""+(&- 5$ ")$ +,),$"5". 5roceder a la elución de las columnas delgadas catiónica y aniónica) con una velocidad de flu'o lenta (8I a 8U gotas por minuto) *aciendo un seguimiento de la separación de las bandas coloreadas en cada columna. Aecolectar en frascos de vidrio peque&os con tapa esmerilada volmenes iguales de eluato de cada resina y cuidando de separar las porciones que *ayan arrastrado los cationes y aniones que van emergiendo de la columna. 5reparar en tubos de Z*an patrones est#ndar de dilución de cada una de las sales coloreadas para determinar por comparación colorimétrica concentraciones aproximadas de los eluatos recogidos. 7na vez que *ayan emergido todas las bandas de color$ lavar la resina con abundante agua destilada y repetir la experiencia si no se *ubiera realizado una separación adecuada.
28. V$),+(5"5 5$ "*/"+(&- 5$ /-" +,)/%-" 5$ (-*$+"%2(, +"*(&-(+,.
Lavar la columna catiónica con abundante agua destilada. >niciar la saturación de la misma con solución de *idróxido de sodio I$UF a una velocidad de 8 a 1 ml6minuto$ recogiendo el eluato en frascos de vidrio con tapa esmerilada en porciones de aproximadamente 8I ml c6u. 2gregar a cada porción que se vaya extrayendo 1 a 3 gotas de fenolftaleína. "eparar aquellas porciones en las que se observa coloración rosada& @itular U ml de cada una de las porciones seleccionadas con solución valorada de #cido clor*ídrico. @razar la curva de saturación de la columna en una gr#fica de gasto de titulante vs. -olumen eluido.
+8. S$0""+(&- 5$ ")$ +,%0)$" $- /-" +,)/%-" 5$ (-*$+"%2(, "-(&-(+,.
4isolver 1 g de sulfato de cobre penta*idratado$ 1 g de cloruro de cobalto y 1 g de cloruro férrico en 3I ml de #cido clor*ídrico 8:8
4renar el líquido *asta que el nivel del mismo esté 'usto sobre el nivel de la resina 5ipetear I$UI ml de muestra y sembrarla muy cuidadosamente sobre la resina$ evitando que se produzca agitación en la superficie de la misma. 7na vez que la muestra ingresó a la columna y cuando el nivel de fase líquida es el mismo de la resina$ se comienza a agregar ,l D F$ inicialmente en peque&o volumen$ *asta alcanzar una altura apenas sobre el nivel de la resina$ de modo que nuevos agregados no alteren su superficie. Luego se pueden agregar volmenes mayores regulando a su vez$ el caudal en 8U a 1I gotas6min. Aecoger el eluato inicial en un vaso de precipitación o matraz +rlenmayer de 1II ml. uando la banda azul de cobalto se aproxima al extremo inferior de la columna se quita el vaso de precipitado y se reemplaza por tubos de ensayo sucesivos de 8I ml$ recogiendo el eluído *asta que *aya desaparecido la banda azul.
ambiar la concentración de eluyente y usar ,l 8 F$ para sacar el cobre (banda amarilla) de la columna$ recolectando el eluato nuevamente en un matraz +F. uando esta banda llegue al extremo inferior de la columna se recoge nuevamente en tubos sucesivos de 8I ml. "e cambia nuevamente la concentración del eluyente a ,l I$UF para separar la ltima banda de *ierro. 5roceder en la recolección al igual que en los dos casos anteriores. olocar los tubos reolectados en tres series en una gradilla. 2gregar a los tubos conteniendo cobalto y *ierro U ml de solución de tiocianato de potasio. 2 los tubos conteniendo cobre$ adicionar solución de amoníaco E F y completar a aproximadamente 8U ml en los tubos respectivos. 4eterminar las concentraciones aproximadas de cada tubo comparando su coloración con soluciones patrón que *ubieran recibido el mismo tratamiento. @razar un gr#fico aproximado de la elución de dic*a columna.
E.% 7+"@>0?2A>0.% 1. 5ara llevar a cabo una cromatografía de capa fina (<) es necesario un adsorbente y un eluyente: "8 [Kue función tiene el eluyente\$ [cómo acta\ 28 [Kué función tiene al adsorbente\$ [cómo acta\ . [ómo podemos observar cu#l es el resultado de una <\ 3. "8 [Kué puede ocurrir si se pone demasiada muestra en la <\ 28 [] si se pone demasiado poca\ . 0rdene los siguientes eluyentes segn su polaridad: "8 agua$ cloruro de metileno$ *exanos 28 etanol$ acetato de etilo$ cloruro de metileno @. 0rdene los siguientes compuestos segn su polaridad "8 acetato de etilo$ ciclo*exanona$ #cido benzoico. 28 éter etílico$ benzoato de metilo$ anilina (fenilamina). 28. C,%"*,"!4" 5$ +,)/%-".
8. +l contenido de agua en los te'idos de plantas es muy elevado. @omando esto en cuenta$ explique porqué la extracción de pigmentos se lleva a cabo en metanol y luego se pasan al *exano. ["ería conveniente extraer directamente con *exano\ 1. [u#l sería el efecto en los resultados de la cromatografía en columna si ocurriera alguno de los siguientes errores: a) 2l a&adir la muestra a la columna se usa una cantidad excesiva de solvente. b) ?o se mantiene el nivel del solvente arriba del adsorbente y la columna se agrieta. c) ?o se elimina completamente el metanol del extracto de pigmentos antes de *acer la cromatografía. +8. I-*$+"%2(, (&-(+,. 8.% +xplicar el orden de elución de los cationes$ aniones y de las muestras de metales. 1.% 2 qué se debe el intercambio de color cuando se aumenta la concentración de #cido para eluir los componentes\ 3.% +n cromatografía de intercambio aniónico normal$ se v# aumentando la concentración de #cido para eluir los componentes. [5or qué razón en este caso se realiza lo contrario\
