GUÍA EJERCICIOS BIOREACTORES Fundamentos de Ingeniería Bioquímica IWQ-250 Semestre I-2013 Profesores: Sergio Almonacid M. y Ricardo Simpson R. 1. a) Demuestre que si para el crecimiento bacteriano es válido asumir el modelo de duplicación celular con tiempo de duplicación constante, entonces, matemáticamente se puede representar por:
dx dt
x
Donde: : Concentración celular (g/L) x : : Tiempo (h) t : : : Velocidad específica de crecimiento (h -1) b) ¿Qué relación hay entre el tiempo de duplicación (generación) t D y la velocidad específica de crecimiento, ? R: t D = Ln2/
2. Demuestre que para un Bio-reactor simple (1 etapa) operado en estado estacionario se cumple lo siguiente (asuma x 0 0 = 0): a)
= =
D; (D: velocidad de dilución)
R: Balance de células: F V
( xo x ) x
dx dt
F x x 0 V
En estado estacionario ( dx/dt = 0 ) y como de la ecuación se obtiene: F/V = , y por definición F/V = D , entonces: D
SAM/RS
1
3.- Un Bio-reactor continuo de una etapa para la producción de células es operado en estado estacionario. a) Demuestre analíticamente que para un Biorreactor de volumen V 1 la concentración celular, en estado estacionario, es mayor que para un Bio-reactor de volumen V 2 (donde V 1 > V 2). b) Con la idea de maximizar la producción de células, ¿comó operaría dos Biorreactores continuos de volumen V, en serie o en paralelo?, justifique su respuesta con un ejemplo cuantitativo.
R: a) De la expresión: x y x / s ( S 0
DK S max .
D
) x y x / s ( S 0
Considerando que D = F/V, entonces:
FK S V max . F
)
Donde es posible apreciar que a mayor V, mayor es la concentración celular, x. Por lo tanto si V 1 > V 2, entonces X 1 > X 2. b) Es mejor en serie que en paralelo. No olvide desarrollar un ejemplo numérico. Si asumimos que el flujo de alimentación es F y se opera en serie la productividad la productividad será Fx 2. Al operar en paralelo será Fx 1. Se puede demostrar que x 2 > x 1.
4. Estudios realizados en el laboratorio mostraron que en cultivo continuo, A zotobacter wi nelandi presenta una velocidad específica de crecimiento máxima de 0,45 h -1 y un K s de 28 mg/L. Si se opera un Bio-reactor de 50 L, con una velocidad de dilución de 0,32 h -1, Y x/s = 0,36 gC/gS y una concentración de sustrato en la alimentación de 5 g/l; determinar: a) b)
Concentración celular en estado estacionario. R: x = 1,775 g/L Concentración de sustrato limitante en el efluente. R: S = 68,92 mg/L
5.- En una fermentación por lotes alimentados realizada en un fermentador, se obtuvieron los siguientes resultados:
SAM/RS
Tiempo (h)
XV (g)
0
210
1
277
2
364
2
3
479
4
631
5
831
6
1.095
7
1.442
8
1.898
9
2.500
Las características de la bacteria cultivada son para el nutriente limitante utilizado.
M =
0.4 h-1, y K s = 0.01 g/l
a) Determine el tipo de alimentación usado sabiendo que SF es constante. b) Calcule las condiciones iniciales de concentración de sustrato y célula si el volumen inicial era de 140 L.
R: a) Alimentación exponencial (note que al graficar XV versus el tiempo se comprueba que es una función exponencial). b) xo = 1,5 g/L ; S o = 0,022 g/L
RESPUESTAS DE LOS EJERCICIOS 6 A 12 (al final) 6. Una nueva cepa de levadura está siendo considerada para la producción de biomasa. La prueba se realizó en un Bio-reactor de una etapa. La concentración de sustrato en la entrada del Bio-reactor es de 800 [mg/L], operándose con exceso de oxígeno, pH de 5,5 y una temperatura de 35 [°C]. Usando los datos de la siguiente tabla, estime: D [1/h] 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
S [mg/L] 16,7 33,5 59,4 101 169 298 702
X [mg/L] 366 407 408 404 371 299 59
a) Valores de µ max y Ks. b) Encuentre una expresión para la productividad celular DX . c) ¿Cuál es la D que maximiza la productividad celular? Compare valor teórico y gráfico.
SAM/RS
3
7. Los siguientes datos fueron obtenidos en la oxidación de pesticidas presentes en un agua residual mediante una mezcla de microorganismos en una operación continua tipo quimiostato. Se considera el pesticida como el reactivo limitante. D [1/h] 0,08 0,11 0,24 0,39 0,52 0,70 0,82
[ S] (Pesticida) [mg/L] 15 25 50 100 140 180 240
Si usted tiene un residuo líquido a tratar de 0,5 [m 3/s] que contiene 500 [mg/L] de pesticida y requiere abatir la concentración de éste en un 95%: a) ¿Cuál debe ser la tasa de dilución y el volumen de la laguna de aireación? b) ¿Cuál es la masa microbiana [Ton] producida por día de operación? Considere que Y X/S de 0,6 [g X/g S]
8. La tasa de crecimiento específico para un microorganismo cultivado en un quimiostato, obedece a la siguiente expresión:
mS
KS S
IK S K I
¿De qué tipo de inhibición se trata? Para los siguientes valores: S0 = 10 [g/L] K S = 1 [g/L] Y X/S = 0,1 [gcel/ gsust] x 0 = 0 [g/L] K I = 0,01 [g/L] μ m = 0,5 [1/h]
a) Determine x y S como función de D cuando I = 0 [g/L] b) Cuando se agrega inhibidor al quimiostato (I = 0,05 [g/L]), determine la concentración de S de salida del sistema y la concentración de células como función de D. c) Determine la productividad celular en función de D. d) Analice el efecto del inhibidor en dX/dt. e) ¿Cuál será el volumen del reactor, si éste debe procesar un flujo de 570 [L/h] a la máxima productividad celular?
SAM/RS
4
9. Los siguientes datos fueron obtenidos para evaluar el efecto de la temperatura en la producción fermentativa de ácido láctico, mediante el uso de Lactobacillus delbrueckii . De estos datos estime los parámetros de Arrhenius para el sistema descrito: T [°C] 40,4 36,8 33,1 30,0 25,1
μ
[1/h] 0,0140 0,0112 0,0074 0,0051 0,0036
10. La bacteria Pseudomona sp. tiene una tasa máxima específica de crecimiento de 0,4 [1/h], cuando es cultivada en acetato. La constante de saturación usando este sustrato es 1,3 [g/L], y el coeficiente de rendimiento de células en acetato es de 0,46 [g cell/ g acetato]. Si se opera este sistema como un quimiostato, con un S0 de 38 [g/L], realice el siguiente análisis: a) ¿Cuál es la tasa de dilución crítica? b) ¿Cuál es la concentración de células cuando la tasa de dilución es la mitad de la crítica? c) ¿Cuál es la concentración de sustrato cuando la D es un 80% de la crítica? d) ¿Cuál es la productividad celular a la D en c)? e) Encuentre D ópt para la productividad celular, ¿qué porcentaje de D crítico es éste?
11. En un quimiostato en que la cinética de crecimiento celular obedece la ecuación de Monod, el sustrato residual es independiente de la concentración de sustrato inicial o de ingreso al quimiostato (S 0). Usted observa que en su quimiostato, un incremento en S 0 resulta en un incremento en la concentración de salida o residual. Un amigo le sugiere que considere la ecuación de Contois en lugar de Monod:
mS
K XS X S
a) Derive una expresión para S en términos de D, μ m, KXS y X para un quimiostato en estado estacionario. b) Derive un expresión para S en función de S 0, D, KXS, YXS y μm. c) ¿Si S0 aumenta al doble, en cuánto aumenta S?
SAM/RS
5
12. Se tiene un fermentador operando en estado transiente, donde la tasa específica de crecimiento celular se describe mediante la ecuación de Monod. Se tiene como objetivo conseguir 600 [Kg] de células secas. Se pide para las siguientes condiciones:
Sf = 90 [g/L] constante K S = 0,055 [g/L] Y X/S = 0,44 [g cel/ gsust] X 0 = 6 [g/L] μ m = 0,46 [1/h] μ = 0,33 [1/h] constante V 0 = 10.000 [L]
a) Expresión para el flujo de alimentación F en el tiempo, en función de las variables anteriores. b) Tiempo de alimentación [h] c) Concentración de nutrientes limitantes en la alimentación [g/L] d) Volumen final en el fermentador [L] e) Valor de F a t = 0 [h] f) El valor del flujo a la mitad del tiempo del proceso [L/h]
EJERCICIOS PROPUESTOS 1. Un biorreactor continuo se opera con un volumen de trabajo de 120 L y un flujo de alimentación de 20 L/h. La población bacteriana presenta un tiempo de duplicación mínimo de 3,15067 h y un Ks de 1 g/L. El rendimiento expresado en g de células por g de sustrato se ha estimado en 0,28. Ensayos preliminares hacen recomendable trabajar a una velocidad de dilución igual al 82% del valor crítico*. * Velocidad de dilución crítica, D*=
MSo/(So
+ Ks)
So : Concentración de sustrato en la alimentación (g/L) -1 M : Velocidad específica máxima (h ) Recuerde: = Ln2/tD, donde t D es el tiempo de duplicación. a) b) c) d) e)
¿Cuál es la velocidad específica máxima, M? ¿Cuál es la concentración de sustrato en la alimentación? ¿Cuál es la concentración de sustrato en la descarga? ¿Cuál es la concentración celular en estado estacionario? ¿Cómo cambian las respuestas b) y c) si el flujo de alimentación se disminuye a 15 L/h?
SAM/RS
6
2. Formule los balances de células y sustrato en estado no estacionario para el esquema que se presenta en la siguiente figura.
3. Un bio-reactor del tipo Feed B atch (lotes alimentados) se opera de tal forma que la concentración de sustrato se mantenga constante durante la operación ( S* = 2 g/L). Datos: -1 S0 =20 (g/L); X 0= 2 (g/L); V 0= 2000 (L); =0,4 (h ); Y X/S=0,4 (g/g)
a) ¿Cuál es la concentración de células después de 4 horas de fermentación? b) ¿Cuál es el volumen de fermentación después de 4 horas de operación? c) Si se realizara una fermentación batch (por lotes) con la misma concentración inicial, ¿cuál sería la concentración después de 4 horas de fermentación? d) Compare sus respuestas a las preguntas formuladas en las letras a) y c) y explique las diferencias.
4. a) Formule los balances de células y sustrato en estado estacionario para el esquema que se presenta en la siguiente figura. b) Si S0 =20 (g/L), M =4 (h-1); K S=0,5 (g/L); D=0,2 (h-1); Y X/S=0,5 (g/g), entonces calcule las condiciones de estado estacionario para el primer bio-reactor, es decir: X 1, S 1, y 1, y deje expresadas las ecuaciones que permitan calcular X 2, S2 , y 2
SAM/RS
7
F S0
II
I
V, X2, S2
V, X1, S1
F X2
F
S2
X1 S1
RESPUESTAS DE LOS EJERCICIOS 6 A 12 6. a) Para el quimiostato, la tasa específica de crecimiento celular puede ser expresada por la ecuación de Monod:
S K S S m
(1)
Sin embargo, en estado estacionario, el flujo de células que salen del quimiostato (también conocido como tasa de dilución, puesto que se asume mezclado perfecto en el reactor) es igual a la tasa de crecimiento específica en éste, es decir, D = μ , por lo que la ecuación de Monod puede ser escrita como: D
S K S S m
(2)
A partir de los valores entregados en la tabla, se puede determinar μmáx y KS mediante regresión no lineal o por regresión lineal al graficar los inversos de D y [S].
Regresión no lineal:
Regresión lineal:
1 0,8 h mg K S 102,3 L m
12,00
K 1 1 S D m S m 1
10,00 8,00
SAM/RS
D / 1
8 6,00 4,00
1/D [h] 10,00 5,00 3,33 2,50 2,00 1,67 1,43
1/[S] [L/mg] 0,060 0,030 0,017 0,010 0,006 0,003 0,001
De la ecuación de la recta se extrae el intercepto y de aquí la velocidad máxima. Luego con la pendiente y μ máx se obtiene K S: 1 m
KS m
1 1,25 m 0,8 h
5,00 2,00 0,030 0,006
125,3
mg K S 100,3 0,8 L K S
b) Se define productividad celular como: DX
células dX DX volumen tiempo dt
Tomando las ecuaciones que describen el comportamiento del quimiostato: X Y X / S S0 S (reemplazando μ = D en la ecuación que define d S )
(3)
dt
S
KSD m
D
(reordenando la ecuación (2))
(4)
multiplicando la ecuación (3) por D y luego reemplazando la ecuación (4) en ésta, se obtiene una expresión para la productividad celular DX: X Y X /S S0 S
DX DY X / S S0 S
DX DY X /S S0
KS D m
D
(5)
c) Para obtener la tasa de dilución teórica que maximiza la productividad celular ( Dóptimo), se deriva la ecuación (5) en función de D, se iguala a cero y se despeja Dóptimo:
SAM/RS
9
d DX dD
K D K S d DY X /S S0 S 0 Dóptimo m m m D dD S0 KS
K S 1 1,07 Dóptimo,1 m m S0 KS h (se descarta) K S 1 Dóptimo,2 m m S K 0,53 h 0 S
Si se observa la gráfica que representa el comportamiento del quimiostato: D [1/h] 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
[S] [mg/L] 16,7 33,5 59,4 101 169 298 702
[X] [mg/L] 366 407 408 404 371 299 59
D[X] [mg/L h] 36,6 81,4 122,4 161,6 185,5 179,4 41,3
900 800
700 n ó i c a r t n e c n o C
600
[S]
500
D[X]
400
[X]
300
Dcrit
200
S0
100
Dópt
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
D
Ahora, Dóptimo, gráfico se extrae desde la gráfica siendo su valor igual a ~ 0,56 [1/h]. Finalmente, se puede decir que los valores encontrados son casi iguales, siendo la principal causa de diferencia el error respectivo de valores obtenidos experimentalmente y la gráfica de éstos.
7. a) Análogo al ejercicio 6, se grafica los inversos y se obtiene los parámetros para la relación del quimiostato en estado estacionario: 14,00
K 1 1 S D m S m 1
1/D [h] 12,50 9,09 4,17 2,56 1,92 1,43 1,22
SAM/RS
1/[S] [L/mg] 0,067 0,040 0,020 0,010 0,007 0,006 0,004
y = 186,5x + 0,606 R² = 0,987
12,00 10,00
D / 1
8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0 ,0 00
0 ,0 10
0 ,0 20
0 ,0 30
0 ,0 40
0 ,0 50
0 ,0 60
0 ,0 70
1/[S]
10
m KSD 307,8D S m D 1,65 D KS K mg 186,5 S K S 307,8 m 1,65 L 1
1 0,606 m 1,65 h
(1) Se quiere abatir la concentración en un 95% S0 S 0,95 S 25 mg S0
L
Se reemplaza dicho valor en la ecuación (1) y se despeja la tasa de dilución: S 25
1 D 0,12 1,65 D h 307,8D
Finalmente se despeja el volumen a partir de la definición de tasa de dilución: D
m3 F F s 1 V 0,5 3600 h V D h 0,12 s
V 15.000 m3
b) Se determina la masa microbiana utilizando el coeficiente de rendimiento: mg células mgsustrato mg 285 células 500 25 L L mg sustrato
X Y X /S S0 S 0,6
m3 mg células s L 1 Toncélulas 0,5 3600 24 1000 3 9 día m 10 mg células L s
Masamicrobiana 285
Ton Masamicrobiana 12,3 día
8. Por la forma de la expresión que describe la tasa específica de crecimiento celular, se deduce que es una inhibición del tipo competitiva. a) Para determinar S en función de D, se realiza el balance de células para el quimiostato: Acumula Entra Sale Genera
SAM/RS
11
d XV dt
d X
FX 0 FX XV
, pero
V cte
F X 0 X X D X0 X X dt V d X Dado que X 0 = 0 [g/L], DX X X D dt d X Asumiendo estado estacionario 0 X D D (1) dt X 0
Si [I] = 0 [g/L], entonces la tasa específica de crecimiento celular puede ser representada por la ecuación de Monod: mS
Pero
D,
D
KS S
mS
KS S
Reordenando, se tiene:
(2)
DK S
S
m
D
(3)
Reemplazando los parámetros del enunciado en la ecuación (3), se obtiene: S
D 0,5 D
(4)
Ahora, para determinar X en función de D, se realiza el balance de materia para el sustrato: Acumula Entra Sale Consume d SV X , pero V cte FS0 FS V dt Y X /S
d S dt
F X X D S0 S S0 S V Y X /S Y X /S
(5)
Introduciendo la ecuación (1) en (5): d S dt
D S0 S
DX Y X /S
Asumiendo nuevamente estado estacionario y considerando que: dX dS 0 dt dt
d S dt
0 D S0 S
DX X D S0 S Y X /S D0 YX /S
X Y X /S S0 S (6)
SAM/RS
12
Reemplazando los parámetros del enunciado y la ecuación (4) en la ecuación (6), se obtiene:
0,5 D D
X 0,110
(7)
b) Como se está trabajando en estado estacionario, los balances de materia anteriores son válidos. Sin embargo, varía la definición de la tasa específica de crecimiento celular puesto que esta vez existe inhibidor, por lo que variará la ecuación (2) de la siguiente manera:
mS
D
IK S K I
KS S
mS
KS 1
(8)
I S K I
Reordenando la ecuación (8) para despejar S:
KS 1 S
m
I D K I
(9)
D
,y reemplazando los parámetros del enunciado en la ecuación (9) se tiene: S
1 1
S
0,05
D
0,01
0,5 D
6D 0,5 D
(10)
Finalmente, sustituyendo la ecuación (10) y los valores de S 0 e YX/S en la ecuación (6) se obtiene la expresión para X:
X 0,1 10
0,5 D 6D
(11)
c) Se define la productividad celular como: DX
(12)
Por lo que multiplicando la ecuación (11) por la tasa de dilución, se consigue una expresión para ésta:
DX 0,1D 10
0,5 D 6D
d) Se define la variación de la concentración de células en el tiempo como: SAM/RS
13
dX X dt
(13)
Dado que para el quimiostato operando en estado estacionario se cumple que D , la ecuación (13) se transforma en: dX DX dt
es decir, la variación de la concentración de células en el tiempo es equivalente a la productividad celular. Si se hace una comparación para dX/dt con y sin inhibidor: 6D dX 0,1D 10 0,5 D dt
dX D 0,1D 10 0,5 D dt
I 0
I 0
Se aprecia que cuando existe inhibidor, será menor la variación de células en el tiempo puesto que el coeficiente que acompaña a la tasa de dilución (encerrado en una circunferencia, 6 > 1) es mayor. e) Si se observa una gráfica representativa (nota: valores de los ejes no están relacionados con el ejercicio) de productividad celular en función de la tasa de dilución: 250
DX máx 200
150 X D
100
50
0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
D
0,5
Dópt Dcrít 0,6
0,7
0,8
se puede concluir que para obtener la productividad máxima se debe operar a la tasa de dilución óptima, por lo que se derivará la función de productividad e igualará a cero para obtener su máximo:
0,6D D 0,5 D 0,5 D 0,6D 0,6D2 d DX 1 2 dD 0,5 D d DX 0 1,6D2 1,6D 0,25 0 dD
DX 0,1D 10
SAM/RS
6D
(14)
14
De la ecuación (14) se obtienen dos posibles valores para la tasa de dilución óptima: D1 0,1941/ h D2 0,8061/ h
Para establecer cuál de estos valores es el adecuado, se determinará la tasa de dilución crítica (D crít) que es el valor de D cuando la productividad y la concentración de células es cero. También, D crít corresponde a la tasa de dilución donde la concentración de sustrato es la de entrada o inicial (S 0): Dcrít D S 0
mS0
IK KS S0 S K I
0,5 10 0,05 1 1 10 0,01
1 Dcrít 0,31 h
Dado que Dópt Dcrít (véase gráfico representativo) Dópt 0,194 1 h
Finalmente, se despeja el volumen del reactor desde la tasa de dilución: D
1 F F L V 570 h V D h 0,194
V 2938 L
9. La ecuación de Arrhenius viene descrita por:
k 0e
E a RT
(1)
Por lo que, para determinar sus parámetros, lo más sencillo es linealizar los datos entregados mediante la siguiente expresión, obtenida luego de aplicar logaritmo natural a la ecuación (1): Ln Ln k 0
Ea 1 R T
(2)
Se tiene entonces la siguiente gráfica:
SAM/RS
15
T [K] 313,6 310,0 306,3 303,2 298,3
1/T [1/K] 0,00319 0,00323 0,00327 0,00330 0,00335
Ln(μ) --4,27 -4,49 -4,91 -5,28 -5,63
-4,00 0 ,0 03 15 -4,20
0 ,00 32 0
0 ,0 032 5
0 ,0 033 0
0 ,0 03 35
0,0 03 40
-4,40 -4,60 -4,80 ) μ ( n L
-5,00
y = -8715,x + 23,55 R² = 0,988
-5,20 -5,40 -5,60 -5,80 -6,00
1/T
Ea Ea J R 8,314 8715 Ea 72457 mol Finalmente, 1 Ln k 23,5 k0 e 23,5 0 h
10. a) Como ya se ha demostrado, para un quimiostato operando en estado estacionario, la tasa de dilución crítica viene dada por: D
mS
KS S
Dcrítico
mS0
KS S0
0,4 38 1,3 38
1 Dcrítico 0,39 h
b) Para determinar la concentración de células, primero se determina la concentración de sustrato para la tasa de dilución especificada y luego este valor se reemplaza en la definición de concentración de células a partir del coeficiente de rendimiento. 1 0,19 2 2 h DK S 0,19 1,3 g S 1,2 m D 0,4 0,19 L X Y X /S S0 S 0,46 38 1,2 D
Dcrítico
0,39
g X 17 células L
c) Se calcula la concentración de sustrato análogamente a la alternativa anterior: 1
D 0,8Dcrítico 0,8 0,39 0,31 h
SAM/RS
16
DK S
S
m
D
0,311,3
g 4,4 0,4 0,31 L
d) Para obtener la productividad celular, se establece la concentración de células y posteriormente se multiplica este valor por la tasa de dilución: g X Y X /S S0 S 0, 46 38 4, 4 15, 4 células L DX 0,31 15,4 g DX 4,8 células Lh
e) Como ya se vio, la tasa de dilución óptima se puede definir como: K S
Dóptimo m m
S0 K S
0,4 0,4
1,3 38 1,3
1 Dóptimo 0,33 h
, y el porcentaje es: Dóptimo Dcrítico
0,33
0,39
100 84,6%
11. a) Análogo al procedimiento descrito en el ejercicio 3, para determinar S se realiza un balance de materia para la concentración de células: Acumula Entra Sale Genera d XV dt
d X
FX 0 FX XV
, pero
V cte
F X 0 X X D X0 X X dt V d X Asumiendo que X0 = 0, DX X X D dt d X , y dado que se opera en estado estacionario 0 X D dt X 0
D
(1) Por lo que, se puede despejar S mediante el reordenamiento de la ecuación de Contois combinada con la ecuación (1):
D
mS
K XS X S
S DK XS X (2) m
SAM/RS
D
17
b) Se desarrolla el balance de materia para el sustrato, para obtener una expresión para X y así obtener S sin que dependa de X: Acumula Entra Sale Consume d SV X , pero V cte V FS0 FS dt Y X /S
d S dt
X X F D S0 S S0 S V Y X /S Y X /S
Introduciendo la ecuación (1) en (3): d S dt
D S0 S
(3)
DX Y X /S
Asumiendo estado estacionario y considerando que: dX dS 0 dt dt
d S dt
0 D S0 S
DX X D S0 S Y X /S D0 YX /S
X Y X /S S0 S (4)
Reemplazando la ecuación (4) en la ecuación (2): S
DK XSYX /S S0 S m
Sea R DK XSYX / S ,
S
D
RS0 m D
RS m
D
RS0 R S 1 m D m D R D m S S 0 1 R m D
(5)
c) A partir de la ecuación (5), si se define un nuevo parámetro R’ como: R D m R ' 1 RS m D
La concentración de sustrato queda descrita por: S S0R '
SAM/RS
18
Donde se aprecia claramente que si S 0 se duplica, S también lo hace.
12. a) F
b) c) d) e) f)
X 0V0 e
t
Y X / S Sf S
t = 7,0 [h] S = 0,14 [g/L] V = 23.658 [L] F 0 = 501 [L/h] F = 1.584 [L/h]
SAM/RS
19
