Universidad Nacional Autónoma de Honduras en el Valle Valle de Sula UNAH-VS
Departamento de Química
Re orte de Laboratorio de Bio uímica L ITema: Estudio del bombeo de protones por levaduras e!ecto de los in"ibidores de la cadena de transporte de electrones # de los desacoplantes$
%nstructor: &ic$ Susana Ec"everri Nombre del estudiante: 'ossel#ne (errato N) de cuenta: *++,*+++, Sección: Viernes .:++ pm
/ec"a de entre0a: *.-1+-*+1.
Sumario 2b3etivos 0enerales
Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras. Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH. Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de protones$
4esumen En el primer experimento diluimos 5 ml de levadura en 40 ml de aua destilada ! determinamos el p"# ! se repiti$ la medici$n dos veces con intervalos de % minutos para obtener la línea basal& Lueo le adicionamos 5 ml de lucosa a '0 aitamos ! medimos el p"& )espu*s determinamos el p" de la soluci$n cada 5 minutos 4 veces ! lueo cada '0 minutos + veces m,s& ara el seundo experimento tambi*n diluimos 5 ml de levadura en 40 ml de aua destilada ! decantamos 0&+ ml de dinitro.enol& )eterminamos el p" de la soluci$n ! repetimos la medici$n dos veces m,s con intervalos de % minutos para obtener la línea basal& /e esper$ un tiempo de 5 minutos ! repetimos los pasos % ! 4 del experimento control& para el tercer experimento de la 12I)1# diluimos 5 ml de la levadura en 40 ml de aua destilada ! decantamos 0&5 ml de la soluci$n a3ida de sodio ! aitamos con cuidado# determinamos el p" de la soluci$n ! repetimos la medici$n dos veces m,s con intervalos de % minutos para obtener la línea basal& Esperamos 5 minutos# ! repetimos los pasos % ! 4 del experimento# lueo se reistramos los datos en la tabla
(onclusiones 0enerales
adena de transporte de electrones& Ruta metab$lica en despu*s del iclo de rebs& /e lleva a cabo en la membrana interna de la mitocondria& 1cepta los 61)" ! 71)"+ resultantes del iclo de rebs& Llevan a cabo reacciones de oxidaci$n ! reducci$n& 8eneran un radiente de protones para la síntesis de 19$
5arco teórico
Las levaduras son organismos unicelulares importantes por su capacidad para realizar fermentación una de las levaduras más conocidas es la Saccharomyces cerevisiae, esta levadura crece en forma anaerobia. Se reproducen aseualmente por gemación. !ienen un n"cleo en donde se encuentra toda la información gen#tica de la c#lula de las mitocondrias donde se lleva a cabo la síntesis de $!%, un &' y $p. (e )olgi para la síntesis de proteías. 'n su membrana plasmática, las levaduras tienen $!%asa de H* +ue acopla hidrólisis de $!% con el bombeo de protones. na bomba de protones son comple-os enzimáticos integrales de membrana +ue es capaz de movilizar protón esa trav#s de la membrana de una c#lula, de la mitocondria o de cual+uier otro compartimento sub celular. omo resultado de la $!%asa de H* en la levadura, se genera un gradiente electro+uímico de protones para el impulso de nutrientes hacia el interior de la c#lula. $demás de esta en su membrana interna tienen otra bomba de protones en cargada de la síntesis de $!%, el /u-o de protones induce la síntesis de $!%. 'l uso de inhibidores de la cadena ha permitido trazar el paso de los electrones a trav#s de la cadena y determinar el punto de entrada de diversos sustratos. La velocidad a la cual el oígeno es consumido por una suspensión de mitocondrias es una medida del funcionamiento de la cadena de transporte de electrones. La velocidad puede ser medida mediante un electrodo de oígeno. no de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. La oligomicina, un antibiótico producido por Streptomyces, inhibe a la $!%asa al unirse a la subunidad 0o e interferir en el transporte de H* a trav#s de 0o, inhibe por lo tanto la síntesis de $!%.
Desacopladores e inhibidores.
'l uso de inhibidores de la cadena ha permitido trazar el paso de los electrones a trav#s de la cadena y determinar el punto de entrada de diversos sustratos. La velocidad a la cual el oígeno es consumido por una suspensión de mitocondrias es una medida del funcionamiento de la cadena de transporte de electrones. La velocidad puede ser medida mediante un electrodo de oígeno. )ran parte del conocimiento de la función mitocondrial ha resultado de estudios con compuestos tóicos. 1nhibidores especí2cos se han usado para distinguir el sistema de transporte de electrones del sistema de fosforilación oidativa, y ha ayudado a de2nir la secuencia de los transportadores redo en la cadena. Si la cadena se blo+uea en un punto, todos los transportadores anteriores +uedan más reducidos, y los posteriores más oidados. Hay seis tipos de venenos +ue afectan la función mitocondrial3 4. 1nhibidores de la cadena +ue blo+uean la cadena respiratoria. La rotenona, toina de una planta, utilizada por indios amazónicos como veneno, tambi#n ha sido usada como insecticida.
$ct"a a inhibiendo el comple-o 1. 1nhibe la re oidación del 5$(H, no afecta la del 0$(H6. 1nhibe la oidación del malato, +ue es dependiente del 5$(*, no así la del succinato. 'l succinato entra en el segundo punto de entrada a la cadena, posterior al del 5$(*. 'l amital 7barbit"rico8 inhibe al comple-o 1, afecta las oidaciones dependientes
del 5$(*. La antimicina $ 7$ntibiótico8.$ct"a a inhibiendo el comple-o 111. 1nhibe la re oidación del 5$(H y del 0$(H6.'l cianuro blo+uea el paso de electrones del citocromo a9 al oígeno. 'stos inhibidores detienen el paso de electrones de modo +ue no hay bombeo de protones. Sin gradiente de protones, no hay síntesis de $!%. 6. 1nhibidores de la fosforilación oidativa, venenos +ue inhiben la $!%:sintasa. La oligomicina, un antibiótico producido por Streptomyces, inhibe a la $!%asa al unirse a la subunidad 0o e interferir en el transporte de H* a trav#s de 0o, inhibe por lo tanto la síntesis de $!%. (icicloheilcarbodiimida 7((8, un reactivo soluble en lípidos, tambi#n inhibe el transporte de protones por 0o al reaccionar con un residuo de glutámico en una de las subunidades de 0o de mamíferos. 'n estas condiciones el gradiente de protones +ue se produce es mayor +ue lo normal, sin embargo la energía potencial de #ste no puede ser utilizada para producir. 9. ;enenos +ue hacen permeable la membrana mitocondrial interna a los protones. 'stos agentes eliminan la relación obligada entre la cadena respiratoria y la fosforilación oidativa +ue se observa en mitocondria intacto. 'stos venenos, como el 6,< dinitrofenol 7(5%8, el carbonilcianuro:p:tri/uorometoi:hidrazona 70%8 y el carbonilcianuro:m:clorofenilhidrazona 7%8 desacoplan la fosforilación oidativa de la cadena respiratoria, se conocen como agentes desacopladores.
Son compuestos liposolubles y ácidos d#biles. Las formas disociadas presentan carga negativa altamente deslocalizada, de modo +ue el
campo el#ctrico de los aniones es muy d#bil, ello permite +ue difundan libremente a trav#s de un medio no polar como las membranas fosfolipídicas. 'ste comportamiento no es usual, la gran mayoría de iones con carga son ecluidos de un ambiente no polar. La forma protonada, sin carga el#ctrica de estos compuestos, pasa a trav#s de la membrana interna mitocondrial intacta, descargando así el gradiente de pH. 'n la matriz, a pH más ba-o, el ácido d#bil se disocia, la forma disociada pasa la membrana interna, destruyendo el potencial de membrana. 'ste proceso se puede repetir, de modo +ue una pe+ue=a cantidad del agente desacoplante puede catalizar el paso de una cantidad enorme de protones y hacer un corto circuito en la cadena respiratoria. 'n resumen, permitiendo el paso de protones a trav#s de la membrana, se disipa el gradiente de protones, no hay bombeo de protones a trav#s de la $!%: sintasa con producción de $!%. Los agentes desacoplantes son todos sint#ticos, sin embargo en el mitocondria del te-ido adiposo pardo una proteína desacopladora 7termogenina8 participa en el delicado control de la termog#nesis. <. 1nhibidores de transporte 7atractalósido8 +ue previenen ya sea la salida del $!% o la entrada de material combustible a trav#s de la membrana mitocondrial interna. >. 1onósforos 7valinomicina, nigericina8 +ue permiten el paso a trav#s de la membrana a compuestos +ue normalmente están impedidos.
?. 1nhibidores del ciclo de @rebs 7arsenito8 +ue blo+uean una o más enzimas del ciclo de @rebs. La producción de $!% aeróbica es más e2ciente +ue la producción anaeróbica. 'n 4A?4, Louis %asteur observó +ue en levadura epuesta a condiciones aeróbicas, el consumo de glucosa y la producción de etanol decae precipitadamente 7'fecto %asteur8. )licólisis anaeróbica3 C6H12O6 + 2ATP
2ADP
+
2Pi
→ 2 lactato
+
2H+ +
+
44H2
Betabolismo aeróbico de la glucosa3 C6H12O6 +
+ 38ADP 38ATP
+
38Pi 6 O2 → 6 CO2
'l metabolismo aeróbico es más e2ciente +ue la glicólisis anaeróbica en lo +ue se re2ere a producción de $!%. Sin embargo, como la concentración de enzimas de la glicólisis es alta, de modo +ue si no están inhibidas, el $!% puede producirse más rápido +ue a trav#s de la fosforilación oidativa. %or otra parte, el cálculo tradicional de 9? $!% o de 9A $!%, seg"n funcione la lanzadera del glicerofosfato o del malato respectivamente, es obsoleto. Bediciones recientes estiman 9C $!% por glucosa totalmente metabolizada.
6rocedimiento e7perimental ! e"peri#ento 1. Se diluyo > ml de levadura en
determinó el pH, se repitió la medición dos veces con intervalos de 9 minutos para obtener la línea basal. 2. Luego se adiciono > ml de glucosa a 4CD se agito y se medió el pH. 3. (espu#s se determinó el pH de la solución cada > minutos < veces y luego cada 4C minutos 6 veces más. !! e"peri#ento $Dinitro%enol&
1. Se diluyo > ml de levadura en
decantó C.6 ml de dinitrofenol. 2. (eterminamos el pH de la solución y repetimos la medición dos veces más con intervalos de 9 minutos para obtener la línea basal. 3. Se 'speró > minutos 4. &epetimos los pasos 9 y < del eperimento control.
!!! e"peri#entos $A'!DA& 1. Se diluyo > ml de la levadura en
2.
3. 4. (.
decantó C.> ml de la solución azida de sodio y se agito con cuidado. Se determinó el pH de la solución y repetimos la medición dos veces más con intervalos de 9 minutos para obtener la línea basal. Se esperó > minutos &epetimos los pasos 9 y < del eperimento &egistramos los datos en la tabla
)es*ltados
( 1 1( 2 3 4
l*co sa
pH Dinitro%e nol
pH A,ida de sodio
(.1 4.4.64 4.(6 4.(2 4.44
4.-4 4.4.1 4. 4.64.68
(.(4 (.(2 (.46 (.46 (.33 (.32
/"peri#ento !
(iluir la levadura, repetición cada 9 minutos 4 6 9
pH
!emperatura
(.28 (.12 (.11
24.4 24.4 24.
%romedio
(.1
&epetición cada > minutos levadura * >ml glucosa 4CD 4 6 9 <
pH
temperatura
%romedio
(.1 4.4.64 4.(6
24.1 24.2 24. 23.8
4.(
&epetición cada 4C minutos 4 6
pH
!emperatura
4.(2 4.44
23.( 23.4
/"peri#ento 2
Levadura * C.6 ml dinitrofenol 'p 4 6 9
pH
temperatura
(.12 (.13 (.1
2(.( 2(.6 26.(
%romedio pH
(.12
Levadura * > ml glucosa > D, > minutos 4 6 9 <
pH
temperatura
4.-4 4.4.1 4.
2(.( 2(.2 2(.3 2(.3
%romedio pH
4.8(
&epetición 4C minutos 4 6
pH
temperatura
4.64.68
2(.2 2(.
/"peri#ento !!!
Levadura azida 4 6 9
pH
temperatura
(.8( (.83 (.6
24.2(. 24.
%romedio pH
(.81
C.> ml de $zida de sodio ,> minutos 4 6 9 <
pH
temperatura
(.(4 (.( (.46 (.46
2(.( 24. 24.8 24.
%romedio pH
(.4-
4C minutos 4 6
pH
temperatura
(.33 (.32
24.6 24.
1. Hacer *na r0ca de cada *no de los e"peri#entos *tili,ar los alores de las lect*ras de pH contra tie#po
)lucosa 46 4C A ? < 6 C
C
>
4C
4>
6C
6>
9C
9>
<>
(initrofenol 46 4C A ? < 6 C
C
>
4C
4>
6C
6>
9C
9>
<>
$zida de sodio 46 4C A ? < 6 C
C
>
4C
4>
6C
6>
9C
9>
<>
2. Anali,ar el sinicado de los ca#bios de pH en el e"peri#ento control con dinitro%enol co#o desacoplante con a,ida de sodio.
Lo +ue puedo observar con los eperimento control del dinitrofenol y el azida de sodio, +ue el dinitrofenol tiene un pH más ba-o +ue el $zida de sodio, y por lo tanto cada vez +ue se aumentaba el tiempo el pH iba haciendo más ba-o
C*estionario 1. 5C*0les son las %*entes de carbono *e *sa la lead*ra7
Los aminoácidos, los carbohidratos, además de cierta acción por parte del nitrógeno y de algunas vitaminas. (e la segunda fuente se pueden mencionar a la glucosa, fructosa, galactosa y manosaE la maltosa y la sacarosa. &especto al nitrógeno se puede resaltar la acción del amonio y la urea, por solo mencionar algunos.
2. 5C*0les son las as #etab9licas *e catali,an a los carbohidratos7
La glucolisis y la 0osforilación oidativa.
3. 5/n *: consisten la ;l*colisis la
'n +ue la primera es la ruta o vía metabólica en la cual la glucosa se va a ir degradando progresivamente mediante la acción de varias enzimas y cierta inversión de mol#culas de $!%. Fsta consiste de 4C reacciones enzimáticas +ue convierten a la glucosa en dos mol#culas de piruvato, la cual es capaz de seguir otras vías metabólicas y así continuar entregando energía al organismo. La 0osforilación oidativa consiste en la utilización de la energía +ue es liberada por la oidación de nutrientes para la posterior síntesis de $!% o adenosin:trifosfato, la mol#cula +ue provee de energía al metabolismo. 4. 5C*0les son los prod*ctos nales del catabolis#o de los carbohidratos en las lead*ras7
(ióido de carbono, agua y $!%.
(. 5C*0les son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios ! !! !!!7 Describa s* e%ecto sobre el cons*#o de O2 la sntesis de ATP.
Los inhibidores +ue va a actuar sobre el comple-o 1 son la &otenona y la %iericidina $ 7por solo mencionar algunos8, del comple-o 11 se puede resaltar a la $ntimicna y por "ltimo, el cianuro, el monóido de carbono y el ácido sulfhídrico inhiben el comple-o 111 de la cadena respiratoria. Glo+uean la síntesis de $!%, al tiempo +ue permite +ue contin"e el transporte electrónico a lo largo de la cadena respiratoria hasta el 6. Su principal función es el inhibir el transporte de electrones en la cadena de la respiración.
6. 5C*0l es el #ecanis#o por #edio del c*al los protono%oros desacoplan la
La acción de estos consiste en disociar la oidación en la cadena respiratoria. Glo+uean la síntesis de $!%, al tiempo +ue permite +ue contin"e el transporte electrónico a lo largo de la cadena respiratoria hasta el 6.
(onclusiones
'n esta práctica se buscó analizar el pH y los inhibidores enzimáticos son factores +ue modi2can la velocidad de la reacción. Si el empleo del pH no es el adecuado la enzima se desnaturaliza. 'n estas enzimas puede obtener resultados tanto positivos como negativos, dependiendo de los factores a los +ue se determine.
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