Espectrometría La esp spec ectr troosc scop opia ia su surg rgió ió co conn el estu es tudi dioo de la in inte tera racc cció iónn en entr tree la radiación y la materia como función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la luz visibl vis iblee disp dispers ersada ada seg según ún su lon longit gitud ud de onda, por ejemplo por un prisma. Máss ta Má tard rdee el con once cep pto se amp mpli lióó enormem emeent ntee para compren end der cualq cua lqui uier er me medid didaa en fu funci nción ón de la Dispersión de luz en un prisma triangular longitud de onda o de la frecuencia. Por tan tanto, to, la espe espectr ctrosc oscopi opiaa pued puedee ref referi erirse rse a int intera eracci ccione oness con par partíc tícula ulass de radiación o a una respuesta a un campo alternante o frecuencia variante (ν). Una extensión adicional del alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al establecerse la relación E=hν para los fotones. Un gráfico de la respuesta como funci fun ción ón de la lo long ngit itud ud de on onda da (o má máss co común múnmen mente te la fr frec ecuen uencia cia)) se co cono noce ce como espectro espectro.. La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad de especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un espectrómetro o espectrógrafo. La es espe pect ctro rome mettrí ríaa a me menu nudo do se us usaa en fí físi sica ca y quí uími mica ca ana nalí líti tica ca pa para ra la identif iden tifica icació ciónn de sus sustan tancia ciass med median iante te el espe espectr ctroo emi emitido tido o abs absorb orbido ido por las mismas. La espectrometría también se usa mucho en astronomía y detección remota. La mayoría de los telescopios grandes tienen espectrómetros, que son usados para medir la composición química y propiedades físicas de los objetos astronómicos, o para medir sus velocidades a partir del efecto Doppler de sus líneas espectrales.
Métodos espectrométricos Según la naturaleza de la excitación medida El tipo de espectrometría depende de la cantidad física medida. Normalmente, la cantidad que se mide es una intensidad de energía absorbida o producida. Se pueden disting dist inguir uir est estos os tip tipos os de espe espectr ctrome ometrí tríaa seg según ún la nat natura uraleza leza de la exc excita itación ción::
* Electromagnética. Int Intera eracci cciones ones de la mat materi eriaa con rad radiac iación ión ele electr ctroma omagné gnética tica como la luz. * De electrones. Interacciones con haces de electrones. La espectroscopia Auger implica inducir el efecto Auger con un haz de electrones. En este caso la medida implica la energía cinética del electrón como variable. * De masa. Interacción de especies cargadas con campos magnéticos y/o eléctricos, dando lugar a un espectro de masas. El término "espectroscopia de masas" está anticuado, ya que la técnica es principalmente una forma de medida, aunque produzca realmente un espectro para la observación. Este espectro tiene la masa (m) como variable, pero la medida es esencialmente de la energía cinética de la partícula. * Acústica. Frecuencia de sonido. * Dieléctrica. Frecuencia de un campo eléctrico externo. * Mecánica. Frecuencia de un estrés mecánico externo, por ejemplo una torsión aplicada a un trozo de material.
Según el proceso de medida La ma mayo yorí ríaa de lo loss mé méto todo doss es espe pect ctro rosc scóp ópic icos os se di dife fere renc ncia iann en at atóm ómic icos os o moleculares según si se aplican a átomos o moléculas. Junto con esta diferencia, se pueden distinguir los siguientes tipos de espectrometría según la naturaleza de su interacción: * De absorción. Usa el rango de los espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia absorbe. Incluye la espectrometría de absorción atómica y varias técnicas mole mo lecu cula lare res, s, co como mo la espect espectromet rometría ría infrar infrarroja roja y la res resona onanci nciaa mag magnéti nética ca nuclear (RMN). * De emi emisió sión n. Us Usaa el ra rang ngoo de es espec pectr tros os el elect ectro roma magn gnéti ético coss en lo loss cu cual ales es una sustanc sust ancia ia irra irradia dia (em (emite) ite).. La sust sustanc ancia ia pri primero mero deb debee abs absorb orber er la ene energí rgía. a. Est Estaa energía puede ser de una variedad de fuentes, que determina el nombre de la emisió emi siónn su subs bsig iguie uient nte, e, co como mo la lum lumine inesc scenc encia ia.. La Lass té técni cnica cass de lum lumine inesce scenci nciaa moleculares incluyen la espectrofluorimetría espectrofluorimetría.. * De dispe dispersión rsión. Mide la cantidad de luz que una sustancia dispersa en ciertas longitudes de onda, ángulos de incidencia y ángulos de polarización. El proceso de
dispersión es mucho más rápido que el proceso de absorción/emisión. Una de las aplicaciones más útiles es la espectroscopia Raman. Raman.
Tipos de espectrometría ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN La espectrometría de absorción es una técnica en la cual la energía de un haz de luz se mide antes y después de la interacción con una muestra. Cuando se realiza con láser de diodo ajustable, se la conoce como espectroscopia de absorción con láser de diodo ajustable. También se combina a menudo con una técnica de modulación, como la espectrometría de modulación de longitud de onda, y de vez en cuando con la espectrometría de modulación de frecuencia a fin de reducir el ruido en el sistema.
ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA La espectrometría de fluorescencia usa fotones de energía más elevada para excitar una muestra, que emitirá entonces fotones de inferior energía. Esta técnica se ha hecho he cho po popu pula larr en ap apli lica cacio ciones nes bio bioqu quími ímica cass y méd médic icas as,, y pu puede ede se serr usa usada da co conn microscopía microsc opía confocal, confocal, trans transferenci ferenciaa de energí energíaa entre partículas partículas fluore fluorescentes, scentes, y visualización de la vida media de fluorescencia.
ESPECTROMETRÍA DE RAYOS X Cuando Cuan do lo loss ra rayo yoss X co conn su sufi ficie cient ntee fr frec ecuen uenci ciaa (en (energ ergía ía)) in inter terac accio ciona nann co conn una sustancia, los electrones de las capas interiores del átomo se excitan a orbitales vacíos externos, o bien son eliminados completamente, ionizándose el átomo. El "agujero" de la capa interior se llena entonces con electrones de los orbitales exte ex terno rnos. s. La en ener ergí gíaa di dispo sponi nibl blee en est estee pr proc oceso eso de ex exci cita taci ción ón se emi emite te co como mo radiac rad iación ión (fl (fluor uoresce escencia ncia)) o qui quitar taráá ot otros ros elec electro trones nes meno menoss enla enlazad zados os del áto átomo mo (efectoo Auger) (efect Auger).. La absorción o frecuenc frecuencias ias de emisió emisiónn (energ (energías) ías) son carac característ terísticas icas de cada átomo específico. Además, para un átomo específico se producen pequeñas variaciones de frecuencia (energía) que son características del enlace químico. Con un aparato apropiado pueden medirse estas frecuencias de rayos X características o energ en ergía íass de el elec ectr tron ones es Aug Auger. er. La ab abso sorci rción ón de ra rayo yoss X y la espectr espectroscopia oscopia de emisión se us usan an en qu quím ímic icaa y ci cien enci cias as de lo loss ma mate teri rial ales es pa para ra de dete term rmin inar ar la composición elemental y el enlace químico. La cristalografía de rayos X es un proceso de dispersión. Los materiales cristalinos dispersan rayos X en ángulos bien definidos. Si la longitud de onda de los rayos X
incidentes es conocida, se pueden calcular las distancias entre planos de átomos dentro del cristal. Las intensidades de los rayos X dispersados dan información sobre las posiciones atómicas y permiten calcular la organización de los átomos dentro de la estructura cristalina.
ESPECTROMETRÍA DE LLAMA Las muestras de solución líquidas son aspiradas en un quemador o una combinación de nebulizador/quemador, desolvatadas, atomizadas, y a veces excitadas a un estado electrónico de energía más alta. El uso de una llama durante el análisis requiere combustible y oxidante, típicamente en forma de gases. Los gases combustibles comunes que se usan son el acetileno (etino) o el hidrógeno. Los gases de oxidante suelen ser el oxígeno, el aire, o el óxido nitroso. Estos métodos son a menudo capaces de analizar elementos metálicos en partes por millón, billones, o posiblemente rangos más bajos de concentración. Son necesarios detectores de luz para detectar la luz con información que viene de la llama. * Espectrometría de emisión atómica . Este método usa la excitación de la llama; los átomos son excitados por el calor de la llama para emitir luz. Este método suele usar un quemador de consumo total con una salida de incineración redonda. Se utiliza una llama de temperatura más alta que la usada en la espectrometría de absorción atómica para producir la excitación de átomos de analito. Ya que los átomos de analito están excitados por el calor de la llama, no es necesaria ninguna lámpara elemental especial. Puede usarse un policromador de alta resolución para producir una intensidad de emisión contra el espectro de longitud de onda por encima de un rango de longitudes de onda que muestran líneas de excitación de elementos múltiples. O bien puede usarse un monocromador en una longitud de onda determinada para concentrarse en el análisis de un solo elemento en una cierta línea de emisión. La espectrometría de emisión de plasma es una versión más moderna de este método. * Espectrometría de absorción atómica (a menudo llamada AA). Este método usa un nebulizador pre-quemador (o cámara de nebulización) para crear una niebla de la muestra, y un quemador en forma de ranura que da una llama de longitud de ruta más larga. La temperatura de la llama es lo bastante baja como para no excitar los átomos de la muestra de su estado basal. El nebulizador y la llama se usan para desolvatar y atomizar la muestra, pero la excitación de los átomos de analito se realiza mediante lámparas que brillan a través de la llama en varias longitudes de onda para cada tipo de analito. En la absorción atómica, la cantidad de luz absorbida después de pasar por la llama determina la cantidad de analito en la muestra. Suele usarse un horno de grafito para calentar, desolvatar y atomizar la muestra con el fin de obtener una mayor sensibilidad. El método del horno de grafito
también puede analizar algún sólido o muestras mezcladas. A causa de su buena sensibilidad y selectividad, es un método que todavía se usa para el análisis de ciertos microelementos en muestras acuosas (y otros líquidos). * Espectrometría de fluorescencia atómica . Este método usa un quemador con una salida de incineración redonda. La llama se usa para solvatar y atomizar la muestra, y una lámpara emite luz a una longitud de onda específica en la llama para excitar los átomos de analito. Los átomos de ciertos elementos pueden entonces fluorescer, emitiendo luz en diferentes direcciones. La intensidad de esta luz fluorescente sirve para cuantificar la cantidad del elemento analizado en la muestra. También puede usarse un horno de grafito para laespectrometría de fluorescencia atómica. Este método no es tan común como el de absorción atómica o el de emisión de plasma.
ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN DE PLASMA Es similar a la emisión atómica por llama, y la ha sustituido en gran parte. * Espectrometría de plasma de corriente contínua (DCP). Un plasma de corriente contínua se crea por una descarga eléctrica entre dos electrodos. Es necesario un gas de apoyo al plasma, y el más común es el argón. Las muestras pueden ser depositadas en uno de los electrodos. * Espectrometría de
emisión
óptica
por
descarga
luminiscente (GD-OES)
* Espectrometría de emisión plasma-atómica acoplada inductivamente (ICP-AES) * Espectrometría de ruptura inducida por láser (LIBS), también llamada espectrometría de plasma inducida por láser (LABIOS) * Espectrometría de plasma inducida por microondas (MIP)
ESPECTROMETRÍA DE CHISPA O ARCO Se usa para el análisis de elementos metálicos en muestras sólidas. Para materiales no conductores, se usa polvo de grafito para hacer conductora la muestra. En los métodos de espectroscopia de arco tradicionales se usa una muestra sólida que es destruida durante el análisis. Un arco eléctrico o chispa se pasan por la muestra, calentándola a alta temperatura para excitar los átomos. Los átomos de analito excitado emiten luz en varias longitudes de onda que pueden ser detectadas mediante métodos espectroscópicos comunes. Ya que las condiciones que producen la emisión por arco no son controladas cuantitativamente, el análisis de los elementos es cualitativo. Hoy día, las fuentes de chispa con descargas controladas bajo una atmósfera de argón permiten que este método pueda ser considerado
eminentemente cuantitativo, y su uso está muy extendido en los laboratorios de control de producción de fundiciones y acerías.
ESPECTROMETRÍA VISIBLE Muchos átomos emiten o absorben la luz visible. A fin de obtener un espectro lineal fino, los átomos deben estar en fase gaseosa. Esto significa que la sustancia tiene que ser vaporizada. El espectro se estudia en absorción o emisión. La espectroscopia de absorción visible a menudo se combina con la de absorción ultravioleta (espectroscopia UV/Vis). Aunque esta forma pueda ser poco común al ser el ojo humano un indicador similar, todavía se muestra útil para distinguir colores.
ESPECTROMETRÍA ULTRAVIOLETA Todos los átomos absorben en la región ultravioleta (UV) ya que estos fotones son bastante energéticos para excitar a los electrones externos. Si la frecuencia es lo bastante alta, se produce la fotoionización. La espectrometría UV también se usa para la cuantificación de proteínas y concentración de ADN, así como para la proporción de proteínas y ADN en una solución. En las proteínas se encuentran generalmente varios aminoácidos, como el triptófano, que absorben la luz en el rango de 280nm. El ADN absorbe la luz en el rango de 260nm. Por esta razón, la proporción de absorbancia 260/280nm es un buen indicador general de la pureza relativa de una solución en términos de estas dos macromoléculas. También pueden hacerse estimaciones razonables de la concentración de ADN o proteínas aplicando la ley de Beer.
ESPECTROMETRÍA INFRARROJA La espectrometría infrarroja ofrece la posibilidad de medir tipos diferentes de vibraciones en los enlaces atómicos a frecuencias diferentes. En química orgánica, el análisis de los espectros de absorción infrarroja indica qué tipo de enlaces están presentes en la muestra.
ESPECTROMETRÍA RAMAN La espectrometría Raman usa la dispersión inelástica de la luz para analizar modos vibracionales y rotatorios de las moléculas. Las "huellas digitales" que resultan son una ayuda para el análisis.
ESPECTROMETRÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) La espectrometría de resonancia magnética nuclear analiza las propiedades
magnéticas de ciertos núcleos atómicos para determinar diferentes ambientes locales electrónicos del hidrógeno, carbono, u otros átomos en un compuesto orgánico u otro compuesto. Se usa para determinar la estructura del compuesto.
ESPECTROMETRÍA DE FOTOEMISIÓN La fotoemisión puede referirse a: * Emisión de electrones a partir de la materia después de la absorción de fotones energéticos (efecto fotoeléctrico). * Emisión de fotones a partir de los semiconductores y metales cuando los electrones que fluyen en el material pierden energía mediante deceleración o recombinación.
ESPECTROMETRÍA MÖSSBAUER La espectrometría de transmisión o conversión electrónica (CEMS) de Mössbauer prueba las propiedades de los núcleos de isótopos específicos en ambientes atómicos diferentes, analizando la absorción resonante de rayos gamma de energía característica, lo que se conoce como efecto de Mössbauer.
OTROS TIPOS DE ESPECTROMETRÍA * Fotoacústica. Mide las ondas sonoras producidas por la absorción de radiación. * Fototermal. Mide el calor desarrollado por la absorción de radiación. * De dicroismo circular. * De actividad óptica Raman. Usa los efectos de la actividad óptica y la dispersión para revelar información detallada sobre los centros quirales de las moléculas. * De terahertzios. Usa longitudes de onda por encima de la espectrometría infrarroja y por debajo de las microondas o medidas de onda milimétricas. * De dispersión inelástica de neutrones, como la espectroscopia Raman pero con neutrones en vez de fotones. * De túnel de electrones inelásticos. Usa los cambios de corriente debidos a la interacción de vibraciones electrónicas inelásticas a energías específicas que también pueden medir transiciones ópticamente prohibidas. * Auger. Se usa para estudiar superficies de materiales a microescala. A menudo se usa en relación con la microscopía de electrones.
* De cavidad en anillo. * De transformación de Fourier. La transformación Fourier es un método eficiente para tratar datos de espectros obtenidos usando interferómetros. Casi toda la espectrometría infrarroja (FTIR) y la resonancia magnética nuclear (RMN) se realizan con la transformación de Fourier. * De tiempo resuelto. Se usa en situaciones donde las propiedades cambian con el tiempo. * Mecánica. Implica interacciones con vibraciones macroscópicas, como los fotones. Un ejemplo es la espectrometría acústica, que implica ondas sonoras. * De fuerza. Usa una técnica analítica basada en AFM. * Dieléctrica. * Infrarroja termal. Mide la radiación termal emitida por materiales y superficies, y se usa para determinar el tipo de enlaces presentes en una muestra, así como su ambiente reticular. Estas técnicas son muy usadas por los químicos orgánicos, mineralogistas y geólogos.
Espectrómetros Un espectrómetro (también llamado espectroscopio o espectrógrafo) es un instrumento óptico que se usa para medir las propiedades de la luz sobre una porción específica del espectro electromagnético. Su utilidad es realizar análisis espectroscópicos para identificar materiales. La variable medida es generalmente la intensidad de la luz, pero también podría ser, por ejemplo, el estado de polarización. La variable independiente es, por lo general, la Espectrómetro longitud de onda de la luz, que suele expresarse como una fracción de metro, aunque a veces se expresa como una unidad directamente proporcional a la energía del fotón, tales como el número de onda o los voltios de los electrones (que tiene una relación recíproca a la longitud de onda). Un espectrómetro se usa en espectroscopia para producir líneas espectrales y medir sus longitudes de onda e intensidades. Son instrumentos que funcionan en una amplia variedad de longitudes de onda, desde rayos gamma y rayos X hasta el
infrarrojo lejano. Si la región de interés está restringida a un rango cercano al espectro visible, el estudio se llama espectrofotometría. En general, cada espectrómetro funcionará sobre una pequeña porción de este rango total debido a las diferentes técnicas usadas para medir las distintas porciones del espectro. Por debajo de las frecuencias ópticas (es decir, en el rango de las microondas y radiofrecuencias), el analizador de espectro es un dispositivo electrónico estrechamente relacionado.
Espectroscopios Los espectroscopios se usan a menudo en astronomía y en algunas ramas de la química. Los primeros aparatos de este tipo eran simplemente un prisma con graduaciones que marcaban las longitudes de onda de la luz. Los espectroscopios modernos, como los monocromadores, generalmente usan una rejilla de difracción, una hendidura móvil y una especie de fotodetector, además de estar automatizados y controlados por un ordenador. El espectroscopio fue inventado por Gustav Robert Georg Kirchhoff y por Robert Wilhelm Bunsen.
Comparación de di ferentes espectrómetros basados en la difracción: reflexión óptica, refracción óptica y fibra óptica.
Cuando un material se calienta hasta la incandescencia emite una luz que es característica de la composición atómica del material. Las frecuencias de luz particulares dan lugar a bandas bruscamente definidas en la escala, que son similares a huellas digitales. Por ejemplo, el elemento sodio tiene una doble banda amarilla muy característica, conocida como líneas D del sodio a 588.9950 y 589.5924 nanómetros, cuyo color será familiar a quien haya visto una lámpara de vapor de sodio de baja presión. En el diseño del espectroscopio original, a principios del siglo XIX, la luz entraba en una hendidura y una lente colimadora transformaba la luz en un haz delgado de rayos paralelos. La luz pasaba entonces por un prisma (en espectroscopios portátiles, por lo general un prisma Amici) que refractaba el haz de luz en un espectro, debido a que las diferentes longitudes de onda eran refractadas en cantidades diferentes por la dispersión. Esta imagen se veía entonces a través de un tubo con una escala que se transponía sobre la imagen espectral, permitiendo su medida directa. Con el desarrollo de la película fotográfica, se creó el espectrógrafo, que era más exacto. Estaba basado en el mismo principio que el espectroscopio, pero tenía una
cámara en lugar del tubo de inspección. En años recientes, la cámara ha sido sustituida por circuitos electrónicos construidos alrededor del tubo fotomultiplicador, permitiendo el análisis espectrográfico en tiempo real con mucha más exactitud. En los sistemas espectrográficos también se usan series de fotosensores en lugar de la película. Tal análisis espectral, o espectroscopia, se ha convertido en un importante instrumento científico para analizar la composición de material desconocido, y para estudiar fenómenos y teorías astronómicas. El espectrómetro mide longitudes de onda.
Espectrógrafos Un espectrógrafo es un instrumento que transforma una forma de onda de dominio temporal entrante en un espectro de frecuencia, o generalmente en una secuencia de tales espectros. Hay varias clases de máquinas a las que se llama espectrógrafos, según la naturaleza precisa de las ondas. Los primeros espectrógrafos usaban papel fotográfico como detector. La clasificación espectral de estrellas y Esquema de un espectrómetro de rejilla el descubrimiento de la secuencia principal, la ley de Hubble y la secuencia de Hubble, se hicieron con espectrógrafos que usaban papel fotográfico. El pigmento vegetal fitocromo fue descubierto con un espectrógrafo que usaba plantas vivas como detectores. Los espectrógrafos más recientes usan detectores electrónicos, como cámaras CCDs que pueden usarse tanto para luz visible como para luz ultravioleta. La elección exacta del detector depende de las longitudes de onda de la luz que va a ser registrada. El próximo Telescopio Espacial de James Webb contendrá un espectrógrafo cercano al infrarrojo (NIRSpec) y un espectrómetro en mitad del infrarrojo (MIRI). Un espectrógrafo de escala usa dos rejillas de difracción, giradas 90 grados una respecto a la otra y colocadas cerca. Por lo tanto, se usa un punto de entrada y no una hendidura, mientras que un segundo chip CCD registra el espectro. Con este pequeño chip se consigue un espectro muy fino, y tiene como ventaja que la óptica colimadora no tiene que ser optimizada para coma o astigmatismo, ya que la aberración esférica puede ser establecida a cero. A veces al espectrógrafo se le llama policromador, como analogía de monocromador.
Espectro electromagnético El espectro electromagnético (o simplemente espectro) es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas posibles. El espectro de un objeto es la distribución característica de la radiación electromagnética de ese objeto. El espectro electromagnético se extiende desde las bajas frecuencias usadas para la Diagrama del espectro electromagnético (ampliar) radio moderna (extremo de la onda larga) hasta los rayos gamma (extremo de la onda corta), que cubren longitudes de onda de entre miles de kilómetros y la fracción del tamaño de un átomo. Se piensa que el límite de la longitud de onda corta está en las cercanías de la longitud Planck, mientras que el límite de la longitud de onda larga es el tamaño del universo mismo, aunque en principio el espectro sea infinito y continuo.
Rango del espectro El espectro cubre la energía de ondas electromagnéticas que tienen longitudes de onda diferentes. Las frecuencias de 30 Hz y más bajas pueden ser producidas por ciertas nebulosas estelares y son importantes para su estudio. Se han descubierto frecuencias tan altas como 2.9 * 1027 Hz a partir de fuentes astrofísicas. La energía electromagnética en una longitud de onda particular λ (en el vacío) tiene una frecuencia asociada f y una energía fotónica E. Así, el espectro electromagnético puede expresarse en términos de cualquiera de estas tres variables, que están relacionadas mediante ecuaciones. De este modo, las ondas electromagnéticas de alta frecuencia tienen una longitud de onda corta y energía alta; las ondas de frecuencia baja tienen una longitud de onda larga y energía baja. Siempre que las ondas de luz (y otras ondas electromagnéticas) se encuentran en un medio (materia), su longitud de onda se reduce. Las longitudes de onda de la radiación electromagnética, sin importar el medio por el que viajen, son, por lo general, citadas en términos de longitud de onda en el vacío, aunque no siempre se declara explícitamente.
Generalmente, la radiación electromagnética se clasifica por la longitud de onda: ondas de radio, microondas, infrarroja y región visible, que percibimos como luz, rayos ultravioleta, rayos X y rayos gamma. El comportamiento de la radiación electromagnética depende de su longitud de onda. Las frecuencias más altas tienen longitudes de onda más cortas, y las frecuencias inferiores tienen longitudes de onda más largas. Cuando la radiación electromagnética interacciona con átomos y moléculas, su comportamiento también depende de la cantidad de energía por cuanto que transporta. La radiación electromagnética puede dividirse en octavas (como las ondas sonoras). La espectroscopia puede descubrir una región mucho más amplia del espectro que el rango visible de 400 nm a 700 nm. Un espectroscopio de laboratorio común puede descubrir longitudes de onda desde 2 nm a 2500 nm. Con este tipo de aparatos puede obtenerse información detallada sobre las propiedades físicas de objetos, gases o incluso estrellas. La espectrometría se usa sobre todo en astrofísica. Por ejemplo, muchos átomos de hidrógeno emiten ondas de radio que tienen una longitud de onda de 21.12 cm.
Tipos de radiación Aunque el esquema de clasificación suele ser preciso, en realidad existe algo de trasposición entre tipos vecinos de energía electromagnética. Por ejemplo, las ondas de radio a 60 Hz pueden ser recibidas y estudiadas por astrónomos, o pueden ser conducidas a lo largo de cables como energía eléctrica. También, algunos rayos gamma de baja energía realmente tienen una longitud de onda más larga que algunos rayos X de gran energía. Esto es posible porque "rayo gamma" es el nombre que se le da a los fotones generados en la descomposición nuclear u otros procesos nucleares y subnucleares, mientras que los rayos X son generados por transiciones electrónicas que implican electrones interiores muy energéticos. Por lo tanto, la diferencia entre rayo gamma y rayo X está relacionada con la fuente de radiación más que con la longitud de onda de la radiación. Generalmente, las transiciones nucleares son mucho más energéticas que las transiciones electrónicas, así que los rayos gamma suelen ser más energéticos que los rayos X. Sin embargo, hay transiciones nucleares de baja energía (p.ej. la transición nuclear de 14.4 keV del Fe-57) que producen rayos gamma que son menos energéticos que algunos de los rayos X de mayor energía.
Radiofrecuencia Las ondas de radio suelen ser utilizadas mediante antenas del tamaño apropiado
(según el principio de resonancia), con longitudes de onda en los límites de cientos de metros a aproximadamente un milímetro. Se usan para la transmisión de datos, a través de la modulación. La televisión, los teléfonos móviles, las resonancias magnéticas, o las redes inalámbricas y de radio-aficionados, son algunos usos populares de las ondas de radio. Las ondas de radio pueden transportar información variando la combinación de amplitud, frecuencia y fase de la onda dentro de una banda de frecuencia. El uso del espectro de radio está regulado por muchos gobiernos mediante la asignación de frecuencias. Cuando la radiación electromagnética impacta sobre un conductor, se empareja con él y viaja a lo largo del mismo, induciendo una corriente eléctrica en la superficie de ese conductor mediante la excitación de los electrones del material de conducción. Este efecto (el efecto piel) se usado en las antenas. La radiación electromagnética también puede hacer que ciertas moléculas absorban energía y se calienten, una característica que se utiliza en en los microondas. Microondas La frecuencia super alta (SHF) y la frecuencia extremadamente alta (EHF) de las microondas son las siguientes en la escala de frecuencia. Las microondas son ondas los suficientemente cortas como para emplear guías de ondas metálicas tubulares de diámetro razonable. La energía de microondas se produce con tubos klistrón y tubos magnetrón, y con diodos de estado sólido como los dispositivos Gunn e IMPATT. Las microondas son absorbidas por la moléculas que tienen un momento dipolar en líquidos. En un horno microondas, este efecto se usa para calentar la comida. La radiación de microondas de baja intensidad se utiliza en Wi-Fi. El horno microondas promedio, cuando está activo, está en un rango cercano y bastante poderoso como para causar interferencia con campos electromagnéticos mal protegidos, como los que se encuentran en dispositivos médicos móviles y aparatos electrónicos baratos. Rayos T La radiación de terahertzios (o Rayos T) es una región del espectro situada entre el infrarrojo lejano y las microondas. Hasta hace poco, este rango estaba muy poco estudiado, ya que apenas había fuentes para la energía microondas en el extremo alto de la banda (ondas submilimétrica o también llamadas ondas terahertzios). Sin embargo, están apareciendo aplicaciones para mostrar imágenes y comunicaciones. Los científicos también buscan aplicar la tecnología de rayos T en las fuerzas armadas, donde podrían usarse para dirigirlas a las tropas enemigas, ya que las ondas de alta frecuencia incapacitan los equipos electrónicos. Radiación infrarroja
La parte infrarroja del espectro electromagnético cubre el rango desde aproximadamente los 300 GHz (1 mm) hasta los 400 THz (750 nm). Puede ser dividida en tres partes: * Infrarrojo lejano, desde 300 GHz (1 mm) hasta 30 THz (10 μm). La parte inferior de este rango también puede llamarse microondas. Esta radiación es absorbida por los llamados modos rotatorios en las moléculas en fase gaseosa, mediante movimientos moleculares en los líquidos, y mediante fotones en los sólidos. El agua en la atmósfera de la Tierra absorbe tan fuertemente esta radiación que confiere a la atmósfera efectividad opaca. Sin embargo, hay ciertos rangos de longitudes de onda ("ventanas") dentro del rango opaca¡o que permiten la transmisión parcial, y pueden ser usados en astronomía. El rango de longitud de onda de aproximadamente 200 μm hasta unos pocos mm suele llamarse "radiación submilimétrica" en astronomía, reservando el infrarrojo lejano para longitudes de onda por debajo de los 200 μm. * Infrarrojo medio, desde 30 a 120 THz (10 a 2.5 μm). Los objetos calientes (radiadores de cuerpo negro) pueden irradiar fuertemente en este rango. Se absorbe por vibraciones moleculares, es decir, cuando los diferentes átomos en una molécula vibran alrededor de sus posiciones de equilibrio. Este rango es llamado, a veces, región de huella digital, ya que el espectro de absorción del infrarrojo medio de cada compuesto es muy específico. * Infrarrojo cercano, desde 120 a 400 THz (2500 a 750 nm). Los procesos físicos que son relevantes para este rango son similares a los de la luz visible. Radiación visible (luz) La frecuencia por encima del infrarrojo es la de la luz visible. Este es el rango en el que el Sol y las estrellas similares a él emiten la mayor parte de su radiación. No es probablemente una coincidencia que el ojo humano sea sensible a las longitudes de onda que el sol emite con más fuerza. La luz visible (y la luz cercana al infrarrojo) son absorbidas y emitidas por electrones en las moléculas y átomos que se mueven desde un nivel de energía a otro. La luz que vemos con nuestros ojos es realmente una parte muy pequeña del espectro electromagnético. Un arco iris muestra la parte óptica (visible) del espectro electromagnético; el infrarrojo (si pudiera verse) estaría localizado justo a continuación del lado rojo del arco iris, mientras que el ultravioleta estaría tras el violeta. La radiación electromagnética con una longitud de onda entre aproximadamente 400 nm y 700 nm es detectado por el ojo humano y percibida como luz visible. A otras longitudes de onda, sobre todo al infrarrojo cercano (más largo de 700 nm) y al ultravioleta (más corto que 400 nm) también se les llama luz a veces, sobre todo cuando la visibilidad para los humanos no es relevante.
Si la radiación que tiene una frecuencia en la región visible del espectro electromagnético se refleja en un objeto, como por ejemplo un plato hondo de fruta, y luego impacta en nuestros ojos, obtenemos una percepción visual de la escena. El sistema visual de nuestro cerebro procesa la multitud de frecuencias reflejadas en diferentes sombras y matices, y a través de este fenéomeno psicofísico que todavía no se entiende completamente, es como percibiríamos los objetos. En la mayor parte de las longitudes de onda, sin embargo, la información transportada por la radiación electromagnética no es directamente descubierta por los sentidos humanos. Las fuentes naturales producen radiación electromagnética a través del espectro, y nuestra tecnología también puede manipular un amplio rango de longitudes de onda. La fibra óptica transmite luz que, aunque no es adecuada para la visión directa, puede transportar datos que luego son traducidos en sonido o imagen. La codificación usada en tales datos es similar a lo que se usa con las ondas de radio. Luz ultravioleta La siguiente frecuencia en el espectro es el ultravioleta (o rayos UV), que es la radiación cuya longitud de onda es más corta que el extremo violeta del espectro visible. Al ser muy energética, la radiación ultravioleta puede romper enlaces químicos, haciendo a las moléculas excepcionalmente reactivas o ionizándolas, lo que cambia su comportamiento. Las quemaduras solares, por ejemplo, están causadas por los efectos perjudiciales de la radiación UV en las células de la piel, y pueden causar incluso cáncer de piel si la radiación daña las moléculas de ADN complejas en las células (la radiación UV es un mutágeno). El Sol emite una gran cantidad de radiación UV, lo que podría convertir rápidamente la Tierra en un desierto estéril si no fuera porque, en su mayor parte, es absorbida por la capa de ozono de la atmósfera antes de alcanzar la superficie. Rayos X Después del ultravioleta vienen los rayos X. Los rayos X duros tienen longitudes de onda más cortas que los rayos X suaves. Se usan generalmente para ver a través de algunos objetos, así como para la física de alta energía y la astronomía. Las estrellas de neutrones y los discos de acreción alrededor de los agujeros negros emiten rayos X, lo que nos permite estudiarlos. Los rayos X pasan por la mayor parte de sustancias, y esto los hace útiles en medicina e industria. También son emitidos por las estrellas, y especialmente por algunos tipos de nebulosas. Un aparato de radiografía funciona disparando un haz de
electrones sobre un "objetivo". Si los electrones se disparan con suficiente energía, se producen rayos X. Rayos gamma Después de los rayos X duros vienen los rayos gamma. Son los fotones más energéticos, y no se conoce el límite más bajo de su longitud de onda. Son útiles a los astrónomos en el estudio de objetos o regiones de alta energía, y son útiles para los físicos gracias a su capacidad penetrante y su producción de radioisótopos. La longitud de onda de los rayos gamma puede medirse con gran exactitud por medio de dispersión Compton. No hay ningún límite exactamente definido entre las bandas del espectro electromagnético. Algunos tipos de radiación tienen una mezcla de las propiedades de radiaciones que se encuentran en las dos regiones del espectro. Por ejemplo, la luz roja se parece a la radiación infrarroja en que puede resonar algunos enlaces químicos.
Espectrometría de absorción La espectrometría de absorción se refiere a una variedad de técnicas que emplean la interacción de la radiación electromagnética con la materia. En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. Las palabras transmisión y remisión se refieren a la dirección de viaje de los haces de luz medidos antes y después de la absorción. Las descripciones experimentales por lo general asumen que hay una única dirección de incidencia de la luz sobre la muestra, y que un plano perpendicular a esta dirección pasa por la muestra. En la transmisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el lado opuesto de la muestra. En la remisión, la luz es dispersada desde la muestra hacia un detector en el mismo lado de la muestra. La radiación remitida puede estar formada por dos clases de radiación: reflexión especular (cuando el ángulo de reflexión es igual al ángulo del frecuencia) y reflexión difusa (en todos los demás ángulos). Otro descriptor asociado con la espectrometría de absorción es la variedad de longitudes de onda de radiación que se usa en el haz de luz incidente. Por ejemplo, se habla deespectrometría infrarroja o de microondas, que son a su vez ejemplos de espectrometría de absorción. Por otra parte, también se encuentran referencias a otros rangos de longitud de onda, como la espectrometría de rayos X, que por lo general denotan una espectrometría de emisión. Este artículo trata principalmente de la espectrometría ultravioleta-visible.
La espectrometría UV-visible se refiere a técnicas donde se mide cuánta luz de una longitud de onda particular (color) es absorbida por una muestra. Ya que el color a menudo puede correlacionarse con la presencia y/o la estructura de una sustancia química particular, y ya que la absorbancia es una medida fácil y barata de hacer, la espectrometría de absorbancia se usa ampliamente en cálculos cualitativos, cuantitativos y estructurales. Por ejemplo, el ADN absorbe luz en el rango ultravioleta (por eso la luz del sol es peligrosa), y por tanto la cantidad de ADN en una muestra puede ser determinarse midiendo la absorbancia de la luz ultravioleta. La relación entre el color visible y el color de absorbancia es complicada; una muestra que parece roja no absorbe en el rojo, sino que absorbe en otras longitudes de onda (colores) de modo que la luz que pasa por la muestra se enriquece en rojo. La palabra "color" se usa para indicar que la espectrometría de absorbancia no sólo trata con la luz en rango visible (fotones con una longitud de onda de aproximadamente 400 a 700 nanómetros), sino también con longitudes de onda que están fuera del rango de la visión humana (infrarrojo, ultravioleta, rayos X). Sin embargo, los principios son bastante similares tanto para la luz visible como para la no visible. Técnicamente, la espectrometría de absorción se basa en la absorción de fotones por una o más sustancias presentes en una muestra (que puede ser un sólido, líquido, o gas), y la promoción subsiguiente del electrón (o electrones) desde un nivel de energía a otro en esa sustancia. La muestra puede ser una sustancia pura, homogénea o una mezcla compleja. La longitud de onda en la cual el fotón incidente se absorbe es determinada por la diferencia en los niveles de energía disponibles de las diferentes sustancias presentes en la muestra. Esta es la selectividad de la espectrometría de absorbancia, la capacidad de generar fuentes de fotones (luz) que son absorbidas sólo por algunos componentes en una muestra. Típicamente, los rayos X se usan para revelar la composición química, mientras que las longitudes de onda cercanas al ultravioleta y el infrarrojo se usa para distinguir las configuraciones de diversos isómeros detalladamente. En la espectroscopia de absorción, los fotones absorbidos no son emitidos de nuevo (como en la fluorescencia) sino que la energía que se transfiere al compuesto químico en la absorbancia de un fotón se pierde por medios no radiantes, como la transferencia de energía por calor a otras moléculas. Aunque la intensidad relativa de las líneas de absorción no varía con la concentración, a cualquier longitud de onda dada la absorbancia medida (− log (I / I0)) es proporcional a la concentración molar de las especies que absorben y el grosor de la muestra por la que la luz pasa. Esto se conoce como ley de BeerLambert. El gráfico de la cantidad de radiación absorbida respecto a la longitud de onda para un compuesto particular se conoce como espectro de absorción. El
espectro de absorción normalizado es característico para cada compuesto particular, no cambia con la concentración y es como la "huella digital" química del compuesto. En las longitudes de onda correspondientes a los niveles de energía resonantes de la muestra, se absorben algunos de los fotones incidentes, lo que provoca una caída en la intensidad de transmisión medida y una pendiente en el espectro. El espectro de absorción puede medirse usando un espectrómetro. Conociendo la forma del espectro, la longitud de ruta óptica y la cantidad de radiación absorbida, se puede determinar la estructura y la concentración del compuesto. Los espectros de absorción de luz visible pueden tomarse en cualquier material que sea visiblemente claro. El poliestireno, el cuarzo, y las células de borosilicato (Pyrex), son los materiales más usados. La luz ultravioleta es absorbida por la mayor parte de cristales y plásticos, por lo que se usan células de cuarzo. El Si-O presente en el cristal y el cuarzo, y el C-C en el plástico absorben la luz infrarroja. Los espectros de absorción infrarrojos se realizan generalmente con una delgada película de la muestra sostenida entre platos de cloruro de sodio. Otros métodos implican suspender el compuesto en una sustancia que no absorba en la región de estudio. Las emulsiones de aceite mineral (Nujol) y los cristales de bromuro de potasio suelen ser los más comunes. El NaCl y KBr, al ser iónicos, no absorben el infrarrojo de forma significativa, y el Nujol tiene un espectro infrarrojo relativamente sencillo.
Espectrometría como instrumento analítico A menudo es de interés conocer no sólo la composición química de una muestra dada, sino también las concentraciones relativas de varios compuestos de una mezcla. Para hacer esto debe construirse una escala, o curva de calibración, usando varias concentraciones conocidas para cada compuesto de interés. El gráfico que resulta de la concentración respecto a la absorbancia se hace a mano o usando un software de ajuste de curvas apropiado, que usa una fórmula matemática para determinar la concentración en la muestra. La repetición de este proceso para cada compuesto en una muestra da un modelo de varios espectros de absorción que en conjunto reproducen la absorción observada. De esta manera es posible, por ejemplo, medir la composición química de los cometas sin tener muestras de ellos en la Tierra. Un ejemplo simple: un cianuro estándar a 200 partes por millón da una absorbancia con un valor arbitrario de 1540. Una muestra desconocida da un valor de 834. Ya que esta es una relación lineal y pasa por el origen, el valor desconocido se calcula fácilmente como 108 partes por millón. Con este método de proporción no es necesario conocer los valores de los coeficientes gobernantes, o cromóforos, o la longitud de célula experimental.
En la práctica, el uso de una curva de calibración, más que un solo punto de comparación, reduce la incertidumbre en la medida final por exclusión de la interferencia aleatoria (ruido) en la preparación de los estándares.
Espectrometría de fluorescencia La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es laespectrometría de absorción. Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.
TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales. En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado. La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración. En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de onda.
INSTRUMENTOS En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos: * Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. * Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector. Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación o el filtro. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm. En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o filtro. Como se mencionó antes, la fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de 90° en relación a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. El monocromador no es perfecto y
transmitirá la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal sólo transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relación señal-ruido, y reduce el límite de detección a un factor de aproximadamente 10000, si se compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la fluorescencia también puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias. El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas. El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación va escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción.
ANÁLISIS DE LOS DATOS A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la concentración del fluoróforo. A diferencia de la espectrometría visible o ultravioleta 'estándar', los espectros independientes del dispositivo no son fáciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la máquina. Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relación al instrumento o a la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador después del filtro o monocromador de excitación, para dirigir una porción de luz a un detector de referencia.
Además, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisión de los monocromadores y los filtros, ya que también puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisión del monocromador varía dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razón por la que debe colocarse un detector de referencia después del filtro o monocromador de excitación. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector también depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre los diferentes detectores, según la longitud de onda y el tiempo. La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estándar" del espectro es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión, por ejemplo. Como se mencionó anteriormente, también surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta también. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersión de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos más importantes de dispersión en este contexto son la dispersión de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz cambia a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. A partir de este estado virtual, las moléculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de número de onda constante en relación con la excitación; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un número de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitación. Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorción, que ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorción de las moléculas, incluyendo el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de excitación de la luz no es constante a lo largo de la solución. Como resultado, sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisión de luz fluorescente.
APLICACIONES La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de compuestos orgánicos. También se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos. La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los fotones.
Fluorescencia del triptófano Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano (un aminoácido). Cuando se realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas, el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un único triptófano en su núcleo "hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de emisión del rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un medio ambiente acuoso en contraposición a una proteína hidrofóbica interior. En contraste, la adición de un tensioactivo a una proteína que contiene triptófano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causará un cambio al espectro azul de emisión si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela de surfactante. Las proteínas que carecen de triptófano puede ser enlazadas a un fluoróforo. A 295 nm, el espectro de emisión del triptófano es dominante sobre la fluorescencia más débil de la tirosina y fenilalanina.
Espectrometría de rayos X La espectrometría de rayos X es un conjunto de técnicas espectroscópicas para la determinación de la estructura electrónica de materiales mediante el uso de excitación por rayos X.
ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN POR RAYOS X Karl Manne Georg Siegbahn de Uppsala, Suecia (Premio Nobel 1924), fue uno de los pioneros en el desarrollo de rayos X espectrometría de emisión (también llamado Xespectroscopía de fluorescencia de rayos). Midió las longitudes de onda de los rayos X en muchos elementos de alta precisión, utilizando electrones de alta energía como fuente de excitación.
Los rayos X intensos y de longitud de onda sintonizable son típicamente generados con sincrotrones. En un material, los rayos X pueden sufrir una pérdida de energía en comparación con el haz de luz que entra. Esta pérdida de energía del haz reemergente refleja una excitación interna del sistema atómico, de forma análoga a la conocida espectrometría Ramanque se utiliza ampliamente en la región óptica. En la región de los rayos X hay suficiente energía para producir cambios en el estado electrónico (transiciones entre orbitales, lo que contrasta con la región óptica, donde la pérdida de energía es a menudo debida a los cambios en el estado de rotación o los grados de libertad vibracionales). Por ejemplo, en la región ultraligera de los rayos X (por debajo de aproximadamente 1 k eV), las excitaciones de los campos cristalinos dan lugar a la pérdida de energía. Podemos pensar en el proceso fotón-dentro-fotón-fuera como un evento de dispersión. Cuando la energía del rayo X corresponde a la energía de enlace de un nivel electrónico básico, este proceso de dispersión potencia su resonancia en muchos órdenes de magnitud. Este tipo de espectrometría de emisión de rayos X se conoce a menudo como dispersión inelástica resonante de rayos X (RIXS). Debido a la amplia separación de energías orbitales de los niveles básicos, es posible seleccionar un determinado átomo de interés. Así, se puede obtener información valiosa sobre la estructura electrónica local de sistemas complejos, y los cálculos teóricos son relativamente sencillos de realizar.
Instrumentos Existen varios diseños eficientes para analizar un espectro de emisión de rayos X en la región de los rayos X ultra ligeros. La cifra de valor para estos instrumentos es el rendimiento espectral, es decir, el producto de la intensidad detectada y el poder de resolución espectral. Por lo general, es posible cambiar los parámetros dentro de un cierto rango, mientras se mantiene su producto constante.
Espectrómetros de rejilla Normalmente, los rayos X que emergen de una muestra deben pasar una hendidura que define la fuente, y luego los elementos ópticos (espejos y/o rejillas) los dispersan por difracción según su longitud de onda y, por último, se coloca un detector en sus puntos focales. Monturas de rejilla esférica
Henry Augustus Rowland (1848-1901) desarrolló un instrumento que permitía el uso de un solo elemento óptico que combina la difracción y la concentración: una rejilla esférica. La reflectividad de los rayos X es baja, independientemente del material utilizado y, por tanto, la incidencia sobre la rejilla es necesaria. Imaginemos un círculo con la mitad del radio R tangente al centro de la superficie de la rejilla. Este pequeño círculo se llama círculo de Rowland. Si la hendidura de entrada están en cualquier parte de este círculo, un haz de luz que pase por la hendidura y golpee la rejilla se dividirá en un haz reflejado especularmente, y en haces de todos los órdenes de difracción, que van a concentrarse en determinados puntos en el mismo círculo. Monturas de hendidura plana Los espectrómetros de hendidura plana son similares a los espectrómetros ópticos. En primer lugar necesita una óptica que convierta los rayos divergentes emitidos por la fuente de rayos X en un haz paralelo. Esto puede lograrse mediante la utilización de un espejo parabólico. Los rayos paralelos que salen de este espejo golpean una rejilla plana (con una distancia de ranura constante) en el mismo ángulo, y son difractados en función de su longitud de onda. Un segundo espejo parabólico, a continuación, recoge los rayos difractados en un cierto ángulo y crea una imagen en un detector. Un espectro dentro de un determinado rango de longitud de onda puede ser registrado simultáneamente usando un detector sensible de posición bidimensional tal como una placa fotomultiplicadora de microcanal o un chip CCD sensible a los rayos X (también se pueden utilizar placas de película fotográfica). Interferómetros En lugar de utilizar el concepto de interferencia de haz múltiple que producen las rejillas, se puede dejar simplemente que dos rayos interfieran. Registrando la intensidad de dos de esos rayos co-lineales en algún punto fijo y cambiando su fase relativa, se obtiene una intensidad delespectro en función de la diferencia de longitud de ruta. Se puede demostrar que esto es equivalente a una transformada de Fourier del espectro en función de la frecuencia. La mayor frecuencia registrable de dicho espectro depende del tamaño mínimo de paso elegido en la exploración y de la resolución de frecuencia (es decir, cómo de bien una cierta onda puede definirse en términos de su frecuencia). Esta última característica permite un diseño mucho más compacto para lograr alta resolución que para un espectrómetro de rejilla, porque las longitudes de onda de los rayos X son pequeñas en comparación con las diferencias de longitud de ruta alcanzables.
Espectrometría de absorción atómica En química analítica, la espectrometría de absorción atómica es una técnica para determinar la concentración de un elemento metálico determinado en una muestra. Puede utilizarse para analizar la concentración de más de 62 metales diferentes en una solución. Aunque la espectrometría de absorción atómica data del siglo XIX, la forma moderna fue desarrollada en gran medida durante la década de los 50 por un equipo de químicos de Australia, dirigidos por Alan Walsh.
PRINCIPIOS EN LOS QUE SE BASA La técnica hace uso de la espectrometría de absorción para evaluar la concentración de un analito en una muestra. Se basa en gran medida en la ley de Beer-Lambert. En resumen, los electrones de los átomos en el atomizador pueden ser promovidos a orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una cantidad de energía (es decir, luz de una determinada longitud de onda). Esta cantidad de energía (o longitud de onda) se refiere específicamente a una transición de electrones en un elemento particular, y en general, cada longitud de onda corresponde a un solo elemento. Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la cantidad restante en el otro lado (el detector) se puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-Lambert, calcular cuántas de estas transiciones tienen lugar, y así obtener una señal que es proporcional a la concentración del elemento que se mide.
INSTRUMENTOS Para analizar los constituyentes atómicos de una muestra es necesario atomizarla. La muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es transmitida y medida por un detector. Con el fin de reducir el efecto de emisión del atomizador (por ejemplo, la radiación de cuerpo negro) o del ambiente, normalmente se usa un espectrómetro entre el atomizador y el detector. Tipos de atomizadores Para atomizar la muestra normalmente se usa una llama, pero también pueden usarse otros atomizadores como el horno de grafito o los plasmas, principalmente los plasmas de acoplamiento inductivo.
Cuando se usa una llama, se dispone de tal modo que pase a lo largo lateralmente (10 cm) y no en profundidad. La altura de la llama sobre la cabeza del quemador se puede controlar mediante un ajuste del flujo de mezcla de combustible. Un haz de luz pasa a través de esta llama en el lado más largo del eje (el eje lateral) e impacta en un detector. Análisis de los líquidos
Una muestra de líquido normalmente se convierte en gas atómico en tres pasos: 1. Desolvación. El líquido disolvente se evapora, y la muestra permanece seca. 2. Vaporización. La muestra sólida se evapora a gas. 3. Atomización. Los compuestos que componen la muestra se dividen en átomos libres. Fuentes de luz La fuente de luz elegida tiene una anchura espectral más estrecha que la de las transiciones atómicas. * Lámparas de cátodo hueco. En su modo de funcionamiento convencional, la luz es producida por una lámpara de cátodo hueco. En el interior de la lámpara hay un cátodo cilíndrico de metal que contiene el metal de excitación, y un ánodo. Cuando un alto voltaje se aplica a través del ánodo y el cátodo, los átomos de metal en el cátodo se excitan y producen luz con una determinada longitud de onda. El tipo de tubo catódico hueco depende del metal que se analiza. Para analizar la concentración de cobre en un mineral, se utiliza un tubo catódico de cobre, y así para cualquier otro metal que se analice. * Lásers de diodo. La espectrometría de absorción atómica también puede ser llevada a cabo mediante láser, principalmente un láser de diodo, ya que sus propiedades son apropiadas para la espectrometría de absorción láser. La técnica se denomina espectrometría de absorción atómica por láser de diodo (DLAAS o DLAS), o bien, espectrometría de absorción por modulación de longitud de onda.
MÉTODOS DE CORRECCIÓN DE FONDO El estrecho ancho de banda de las lámparas catódicas huecas hace que sea raro el solapamiento espectral. Es decir, es poco probable que una línea de absorción de un elemento se solape con otra. La emisión molecular es mucho más amplia, por lo que es más probable que algunas bandas de absorción molecular se superpongan con una
línea atómica. Esto puede resultar en una absorción artificialmente alta y un cálculo exagerado de la concentración en la solución. Se utilizan tres métodos para corregir esto: * Corrección de Zeeman. Se usa un campo magnético para dividir la línea atómica en dos bandas laterales. Estas bandas laterales están lo suficientemente cerca de la longitud de onda original como para solaparse con las bandas moleculares, pero están lo suficientemente lejos como para no coincidir con las bandas atómicas. Se puede comparar la absorción en presencia y ausencia de un campo magnético, siendo la diferencia la absorción atómica de interés.
* Corrección de Smith-Hieftje (inventada por Stanley B. Smith y Gary M. Hieftje) - La lámpara catódica hueca genera pulsos de alta corriente, provocando una mayor población de átomos y auto-absorción durante los pulsos. Esta auto-absorción provoca una ampliación de la línea y una reducción de la intensidad de la línea a la longitud de onda original. * Lámpara de corrección de deuterio. En este caso, se usa una fuente de amplia emisión (una lámpara de deuterio), para medir la emisión de fondo. El uso de una lámpara separada hace de este método el menos exacto, pero su relativa simplicidad (y el hecho de que es el más antiguo de los tres) lo convierte en el más utilizado.
Espectrometría de emisión La espectrometría de emisión es una técnica espectroscópica que analiza las longitudes de onda de los fotones emitidos por los átomos o moléculas durante su transición desde un estado excitado a un estado de inferior energía. Cada elemento emite un conjunto característico de longitudes de onda discretas en función de su estructura electrónica. Mediante la observación de estas longitudes de onda puede determinarse la composición elemental de la muestra. La espectrometría de emisión se desarrolló a finales del siglo 19, y los esfuerzos teóricos para explicar los espectros de emisión atómica condujeron a la mecánica cuántica. Hay muchas maneras en que los átomos pueden ser llevados a un estado excitado. El método más simple es calentar la muestra a una temperatura alta, produciéndose las excitaciones debido a las colisiones entre átomos de la muestra. Este método se utiliza en la espectrometría de emisión de llama, y fue también el método utilizado
por Anders Jonas Ångström cuando descubrió el fenómeno de las líneas de emisión discretas en 1850. A pesar de que las líneas de emisión están causadas por una transición entre estados energéticos cuantizados, y pueden ser muy agudas a primera vista, tienen una anchura finita; es decir, se componen de más de una longitud de onda de luz. Esta ampliación de la línea espectral tiene muchas causas diferentes. Las líneas de emisión en los gases calientes fueron descubiertas por Ångström, y la técnica fue desarrollada por David Alter, Gustav Kirchhoff y Robert Bunsen. La espectrometría de emisión suele llamarse a menudo espectrometría de emisión óptica, debido a la naturaleza de la luz que se emite.
TÉCNICA EXPERIMENTAL EN LA ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN POR LLAMA La solución que contiene la sustancia que va a ser analizada se conduce al quemador y se dispersa en la llama como un spray fino. El solvente se evapora en primer lugar, dejando partículas sólidas finamente divididas que se desplazan a la región más caliente de la llama, donde se producen átomos e iones gaseosos. Los electrones son entonces excitados, tal como se describió más arriba. Es común usar un monocromador para permitir una detección fácil. En un nivel simple, la espectrometría de emisión por llama se puede observar utilizando sólo un mechero Bunsen y muestras de metales. Por ejemplo, el metal sodio colocado en la llama se iluminará de amarillo, el metal calcio de rojo y el cobre creará una llama verde. Hay cuatro etapas principales durante la espectrometría de emisión por llama: 1. Evaporación: La muestra que contiene partículas metálicas se deshidrata por el calor de la llama, y el disolvente se evapora. 2. Atomización: En esta etapa, los iones metálicos que se encontraban en el disolvente se reducen a átomos de metal. Por ejemplo, Mg2 + (aq) + 2e Mg (g). Los electrones en los átomos de metal absorben la energía del calor de la llama y pasan a niveles más altos de energía. →
3. Excitación: Los electrones en estado basal de los átomos de metal son ahora capaces de absorber la energía del calor de la llama. El cuanto (cantidad) de energía absorbido depende de las fuerzas electrostáticas de atracción entre los electrones con carga negativa y el núcleo de carga positiva. Esto, a su vez, depende del número
de protones en el núcleo. Como los electrones absorben energía, se desplazan a niveles más altos de la energía y pasan a estado excitado. 4. Emisión de radiación: Los electrones en estado excitado son muy inestables y se mueven hacia un estado basal con bastante rapidez. Cuando lo hacen, emiten la energía que absorbieron. Para algunos metales, esta radiación corresponde a longitudes de onda de luz en la región visible del espectro electromagnético, y se observan como un color característico del metal. Como los electrones de diferentes niveles de energía son capaces de absorber luz, el color de la llama será una mezcla de todas las diferentes longitudes de onda emitidas por los distintos electrones en el átomo de metal que se investiga.
Espectrometría ultravioleta-visible La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano. En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones electrónicas. Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de absorción mide transiciones desde el estado basal al estado excitado.
APLICACIONES La espectrometría UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinación cuantitativa de soluciones de iones metálicos de transición y compuestos orgánicos muy conjugados.
Soluciones de iones metálicos de transición Las soluciones de iones metálicos de transición pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los electrones en los átomos de metal se pueden excitar desde un estado electrónico a otro. El color de las soluciones de iones metálicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de una solución diluida de sulfato de cobre
es muy azul; agregando amoníaco se intensifica el color y cambia la longitud de onda de absorción máxima. Compuestos orgánicos Los compuestos orgánicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugación, también absorben luz en las regiones del espectro electromagnético visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgánicos solubles. Los disolventes orgánicos pueden tener una significativa absorción de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometría UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la absorción del espectro de un compuesto orgánico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su máximo de absorción y su coeficiente de extinción molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes. Aunque los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, éstos son a menudo demasiado intensos para ser usados en mediciones cuantitativas. La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de la solución. Por tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse para determinar la concentración de una solución. Es necesario saber con qué rapidez cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las tablas de coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud, determinándolo a partir de una curva de calibración. El espectrofotómetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR). La presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentración. Para resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estándar, lo que es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para un concentración particular se conoce como factor de respuesta.
LEY DE BEER-LAMBERT La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de Beer-Lambert: •
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donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisión, L la longitud de ruta a través de la muestra, y c la concentración de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presión particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm. La absorbancia y extinción ε a veces son definidas en términos de logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10.
La ley de Beer-Lambert es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero no sirve como relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. En moléculas complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos (Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relación polinómica de segundo orden entre la absorción y la concentración.
ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión: A = - log (%T) Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difracción se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en píxeles. Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios industriales.
En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia. Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de los gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert. También se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos. Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles.
ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un gráfico de absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido directamente con los espectrofotómetros más sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los instrumentos más simples. La longitud de onda se representa con el símbolo λ. Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un gráfico estándar del coeficiente de extinción (ε) frente a la longitud de onda (λ). Este gráfico estándar sería efectivamente "la concentración corregida" y, por tanto, independiente de la concentración. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el máximo de absorbancia en el espectro se llama λ max, y se pronuncia "lambda-max". Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empíricas que pueden utilizarse para predecir λ max, la longitud de onda de la absorción UV-Vis, para compuestos orgánicos conjugados como dienos y cetonas. Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para ningún compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de absorción
