11/4/2013
Ekstrakcije
Metode razdvajanja Metode razdvajanja komponenata komponenata iz smeše u cilju preči prečišćav šćavanja, anja, a radi lakše identifikacije ili određivanja sadržaja.
Može biti izuze izuzetno tno kompl komplikov ikovano ano zbog zbog velike velike slično sličnosti sti komponenat komp onenata a i slože složenosti nosti sastava sastava uzorka.
Kod prirodni uzoraka postupak dodatno komplikuje osetljivost komponenat komp onenata a na utica uticajj svetl svetlosti, osti, temperature, p! ekstraktanata, različiti oksidansa i dr.
1
11/4/2013
"z perspektive analitičara, priprema uzorka treba da bude# jednostavna,
iz minimalne količine uzorka,
uz minimalnu količinu rastvarača,
brza,
preci pre cizn zna ai
isplativa.
čno- no -te čna na ekstrakcija - Te č - LLE no -- te č
$asniva se na particiji ili distribuciji analizirane supstance iz jedne tečne faze u drugu tečnu fazu.
%ečne faze međusobno se ne mešaju npr. voda i idrofobni organski rastvarač, rastvarač, alkool i etar
&koliko se analit nalazi u matriksu koji može da utiče na njegovu analizu potrebno ga je ekstraovati rastvaračem u kome se on dobro rastvara, a matriks se pritom slabo ili uošte ne rastvara u tom rastvaraču.
2
11/4/2013
'rimenjuje se za#
pre(koncentrovanje uzorka ili
izolovanje analita iz ispitivanog uzorka pre primene odgovarajuće metode farmaceutske analize.
npr. ekstrakcija analita iz biološkog materijala pre !')* analize
'rednosti# ☺ jednostavna
i jeftina metoda za uklanjanje interferencija
+edostaci# mala selektivnost, ograničeni broj rastvarača koji se međusobno ne mešaju, upotreba veliki zapremina rastvarača
aspodela supstance u određenom binarnom sistemu ima konstantnu vrednost i izražava se kao podeoni ili distribucioni koeficijent -Kp.
Kp +/ $01"2" od količine supstance i zapremine rastvarača, ali zavisi od temperature.
3aktori koji utiču na Kp mogu biti# a emijski# priroda rastvarača, jonska jačina, p! i b fizički# temperatura, prisustvo interferirajući supstanci.
/kstrakcija se može izvesti odma sa celokupnom zapreminom rastvarača -jednokratna ili više puta sa manjim zapreminama -višekratna, što zavisi od efikasnosti postupka.
3
11/4/2013
/fikasnost ))/ zavisi od#
Količine uzorka.
'odeonog koeficijenta.
2tepena međusobnog mešanja rastvarača uzorka i ekstraktanta -manji bolja efikasnost.
$apremine upotrebljenog ekstraktanta -povećava se efikasnost neki ekstrakcija.
4roja ekstrakcija -veći broj, bolja efikasnost.
5užine i načina mućkanja 6 (78 min. -ne jako i ne predugo da se ne stvore emulzije.
+!9-2:9; se dodaje da spreči nastajanje emulzija kod npr. ekstrakcija jonski jedinjenja organskim rastvaračima iz vodeni uzoraka -rastvarači se mešaju acetonitril i ;(propanol pa nastaje emulzija.
$a kvantitativnu analizu potrebno je da efikasnost ekstrakcije bude najmanje <=>.
4
11/4/2013
3aktori koji utiču na ))/#
3izički#
temperatura,
veličine uzorka i
prisustvo drugi supstanci u uzorku.
!emijski# vrsta
upotrebljenog rastvarača,
vrsta
uzorka i
mogući
emijski reakcija između aktivni supstanci i rastvarača -aceton kao keton stvara sa 7?aminima @ifove bazeA aldeidi i ketoni sa alkoolima poluacetale i acetale
'olarnost rastvarača, po principu Bslično se u sličnom rastvaraC.
p! rastvora.
Donska jačina.
Izbor rastvarača
+ajvažniji faktor čiji izbor zavisi od fizičko(emijski osobina ispitivane supstance.
4inarni sistem čine rastvarači koji se međusobno ne mešaju, tj. rastvarači različite polarnosti.
npr. ukoliko je voda rastvarač kao ekstraktant bira se nepolarni organski rastvarač -loroform, cikloeksan, dietiletar, itd.
+ovinu predstavlja primena superkritični tečnosti E striktnim povećanjem pritiska ugljen(dioksid se prevodi u tečno stanje. 'rednost je što lako i brzo isparava sa sniženjem pritiska, a ekstraovana supstanca zaostaje uparena. :vakav ekstraktant ne ostavlja onečišćenja.
5
11/4/2013
"zbor rastvarača zavisi i od tenike koja će se koristiti za dalju analizu.
$a &1F1"2 analizu ne sme apsorbovati u toj oblasti.
$a !')* analizu mora biti !')* čistoće.
&koliko je potrebno uparavanje rastvarača potrebno je upotrebiti lako isparljiv i sl.
3aktori koje treba razmotriti prilikom izbora rastvarača #
2elektivnost.
5istribucioni koeficijent -poželjan veći E manje rastvarača.
astvorljivost u drugom rastavraču -nepoželjna.
Mešanje dva rastvarača -nepoželjno mešanje ekstraktanta i rastvora uzorka.
azlika gustine između tečni faza -mora da postoji.
'ovršinski napon -manji, jer je manja mogućnost za nastajanje emulzija.
!emijska reaktivnost -poželjan inertan rastvarač.
egeneracija nakon ekstrakcije -laka.
*ena koštanja -niska.
1iskoznost -niska, važno za rukovanje.
'ritisak isparavanja -mali.
+ezapaljiv, netoksičan.
6
11/4/2013
&ticaj gustine na razdvajanje#
7
11/4/2013
astvorljivost ekstraktanata u vodi#
))/ zasnovana na raspodeli između dva rastvarača primenjuje se za ekstrakciju analita iz uljani nosača.
npr. ekstrakcija kortikosteroida iz masti i kremova
+ajčešče se za ekstrakciju koristi sistem metanolFeksan, etanolFeksan ili acetonitrilFeksan.
&ljana faza se rastvora u eksanu, a analit kao polarniji prelazi u metanolni sloj.
&potreba internog standarda je obavezna. Kao "2 koristi se supstanca strukturno slična sa analitom.
8
11/4/2013
Jonska
jačina
5odatkom neorganske soli u rastvor neelektrolita smanjuje se njegova rastvorljivost. 'odešavanje jonske jačine -primenjuju se ;M E 9M rastvori neorganski soli u cilju smanjenja rastvorljivosti naziva se efekat BisoljavanjaC. 'osledica ovog efekta je potiskovanje neelektrolita iz vode u ekstraktant E organski rastvarač. &ticaj katjona i anjona na efekat BisoljavanjaC prikazan je liotropnim nizom# katjoni# Mg;G H *a;G H 2r;G H 4a;G H )iG H +aG H KG H bG H *sG anjoni# citrati H tartarati H2:9;( H acetati H *l( H +:I( H *l:I( H D( H 2*+(
/fekat značajan i u slučaju primene ekstraktanta koji se delimično rastvara u vodi -etar, aceton. 'odešavanjem jonske jačine dodatkom npr. Mg*l;, *a*l; ili K*l dolazi do smanjenja rastvorljivosti organskog rastvarača u vodi. & ovom slučaju efekat isoljavanja je dvojak, potiskuje i ispitivanu supstancu i organski rastvarač iz vode.
Uticaj
pH vrednosti
0ktivne farmaceutske supstance su najčešće slabe kiseline ili slabe baze, kao i njiove odgovarajuće soli.
& zavisnosti od stepena disocijacije u vodenoj fazi biće prisutan i molekulski oblik -ima veći afinitet prema nepolarnom rastvaraču i jonski oblik -ima veći afinitet prema vodenoj fazi. & takvoj situaciji nemoguće je izvesti kvantitativnu ekstrakciju.
'romenom
p! vodene faze jonski oblik prevodi se u molekulski i postiže se kvantitativnost ekstrakcije.
9
11/4/2013
Kontrola i održavanje p! postiže se dodatkom odgovarajući pufera.
p! vodenog rastvora analiziranog jedinjenja kiseli osobina podešava se da bude ; p! jedinice ispod pKa vrednosti tog jedinjenja.
p! vodenog rastvora analiziranog jedinjenja bazni osobina podešava se da bude ; p! jedinice iznad pKa vrednosti tog jedinjenja.
Kontrolom i održavanjem p! moguće je razdvojiti smešu kiselina E baza, ali se tada p! mora smanjivati, odnosno povećavati za I p! jedinice u odnosu na pKa vrednost analizirani jedinjenja.
Č vrsto- na ekstrakcija vrsto -te vrsto -te čna na Jvrsto(tečna ekstrakcija -eng. solid phase extraction E 2'/ je nova i široko primenjivana tenika pripreme uzorka koji se dalje analizira nekom instrumentalnom metodom.
'rincip 0nalit se obavezno rastvara u rastvaraču koji ima malu eluacionu moć -gledano u odnosu na čvrsti nosač.
0nalit se zbog velikog afiniteta zadržava na čvrstom nosaču.
/luiranje se vrši malom zapreminom rastvarača velike eluacione moći.
10
11/4/2013
'rednosti u odnosu na ))/# ☺
+e javlja se problem loše separacije faza ili mešanja faza.
Mogu se koristiti emijski različiti sorbensi, a time se podešava i selektivnost. ☺
'revaziđen problem niski Recovery vrednosti kod ))/. %o znači da su 2'/ ekstrakcije kvantitativnije. ☺
☺
2manjena je potrošnja skupi organski rastvarača.
☺
)akše se i brže izvodi, a može se i automatizovati.
+edostaci "ako su ecover vrednosti daleko bolje nego kod ))/, preporučljivo je koristiti "2 koji mora biti strukturno sličan sa analitom.
2orbensi čija je osnova silika gel nisu stabilni u jako alkalnoj sredini.
'rimenjuje se za#
Koncentrovanje uzorka Jesto je slučaj da analit bude prisutan u veoma niskoj koncentraciji. 'rimenom 2'/ moguće je izvršiti koncentrovanje uzorka do nivoa privatljivog za kvantitativnu analizu.
/kstrakciju i prečišćavanje uzorka 'risustvo interferirajući komponenti matriksa -biološki materijal može onemogućiti kvantitativnu analizu ispitivanog jedinjenja. 'rimenom 2'/ uklanjaju se komponente matriksa E uzorak se prečišćava, a iz uzorka se ekstrauje ispitivana supstanca.
11
11/4/2013
2'/ se zasniva na raspodeli analita između čvrste faze -sorbensa i tečne faze -eluenta. 'ostupak zavisi od#
strukture i osobina analita koji treba ekstraovati,
prirode organskog rastvarača u kome je analit rastvorljiv,
p! vrednosti uzorka,
jonske
jačine i
uticaja matriksa na analit.
2'/ protokol može se postaviti tako da se analit# $adrži na čvrstoj fazi 'rimenjuje se kada je# 7 analit u uzorku prisutan u niskoj koncentraciji, ; treba ekstraovati više analita različite polarnosti.
+e zadrži na čvrstoj fazi 'rimenjuje se jedino kada je analit u uzorku prisutan u visokoj koncentraciji.
12
11/4/2013
2'/ postupak obuvata četiri faze#
Kondicioniranje
"zvodi se propuštanjem rastvarača ili smeše rastvarača kroz kolonu napunjenu sorbensom E čvrstom fazom -kertridž.
Kondicionira se rastvaračem koji će biti korišćen za eluiranje.
:mogućava aktiviranje čvrste faze.
0dsorpcija
astvor analita, biološki materijal, i sl, propušta se kroz kertridž.
astvor analita priprema se u rastvaraču koji ga ne može eluirati sa kolone -male je eluacione moći posmatrano u odnosu na sorbens.
2ve komponente -analit, nećistoće, komponente matriksa i sl adsorbuju se na čvrstu fazu.
13
11/4/2013
"spiranje
1rši se rastvaračem koji će odstraniti komponente matriksa i nečistoće, dok analit ostaje vezan za čvrstu fazu.
"zbor rastvarača je od presudnog značaja.
1rši se na osnovu fizičko(emijski karakteristika analita i sorbensa.
/luiranje analita
1rši se pogodnim rastvaračem.
astvarač ima veliku eluacionu moć posmatrano u odnosu na sorbens.
14
11/4/2013
Meanizam zadržavanja analita na čvrstoj fazi everzni faza
+ormalni faza
"zmene jona
'olarnost analita
nepolarni ili slabo polarni
polarni
polarni - jonizovani
'olarnost sorbensa
nepolaran
polaran
polaran
1rsta veza koja se uspostavlja na međufazi
van der Valsove (hidrofobne, particione)
vodonične, izmena jona – dipol-dipol interakcije, elektrostatičke π-π interakcije interakcije
polaran
nepolaran ili slabo polaran (toluen, C!Cl!, heksan)
polaran (dejonizovana voda, pufer)
/luent
nepolarniji od matriksa (voda-metanol, voda-acetonitril)
polarniji od matriksa (etil-acetat, aceton, acetonitril)
pufer od"ovaraju#e" sastava, jonske jačine i p
edosled eluiranja
najpolarnija se eluira prva
najnepolarnija se eluira prva
slabo jonizovana se eluira prva
Matririks iz koga se (voda, pufer, biološki vrši ekstrakcija materijal)
)ipofilni adsorbensi
)ipofilni adsorbensi se koriste za ekstrakciju meanizmom reverzni faza.
1an der 1alsovim silama vrše retenciju lipofilni nejonizovani analita.
15
11/4/2013
$a ekstrakciju analita kiselog karaktera najpre je potrebno rastvor iz kog se analit ekstrauje zakiseliti ( prevesti u molekulski nejonizovani oblik.
$a ispiranje se koristi kiseli pufer, voda ili smeša metanola i razblažene kiseline.
/liuranje se vrši metanolom, acetonitrilom, tetraidrofuranom ili alkalnim puferom.
$a ekstrakciju neutralni jedinjenja nije potrebno kontrolisati p!.
$a ispiranje se koristi alkalni pufer ili razblažena kiselina -uklanjaju se nečistoće koje jonizuju ili smeša metanola i vode.
/liuranje se vrši metanolom, etanolom ili loroformom.
0mini se takođe mogu ekstraovati primenom ovi sorbensa.
"nterakcija amina sa sorbensom je preko slobodni silanolni grupa ( polarne interakcije.
$a ekstrakciju analita baznog karaktera najpre je potrebno rastvor iz kog se analit ekstrauje zaalkalisati -p! 78 je odgovarajući za većinu baza ( prevesti u molekulski nejonizovani oblik.
$a ispiranje se koristi alkalni pufer, voda ili smeša metanol(alkalni pufer.
/liuranje se vrši kiselim puferom, metanolom ili etanolom.
16
11/4/2013
'olarni adsorbensi 'olarni adsorbensi se koriste za ekstrakciju meanizmom normalni faza.
etencija se zasniva na građenju vodonični veza, ostvarivanju dipol( dipol interakcija ili π(π interakcija preko polarni grupa sorbensa i analita.
2ilika gel
Koriste se za ekstrakciju polarni jedinjenja.
0minopropil
$a
eluiranje polarni jedinjenja baznog karaktera koristi se smeša metanol ( kiseli pufer. $a
eluiranje polarni jedinjenja kiselog karaktera koristi se smeša metanol ( alkalni pufer.
5iol
Dono(izmenjivački adsorbensi
& osnovi sadrže silika(gel modifikovan radikalima koji na terminalnom kraju imaju naelektrisane jone.
& zavisnosti od naelektrisanja dele se na katjonske i anjonske.
etencija se zasniva na ostvarivanju elektrostatički privlačenja između funkcionalni grupa jedinjenja i adsorbensa.
3unkcionalne grupe analita i adsorbensa moraju biti u jonskom obliku, a to se postiže podešavanjem p! vrednosti matriksa u zavisnosti od pKa jedinjena i adsorbensa.
$a eluiranje se koristi rastvarač koji ima takvu p! vrednost da neutrališe aktivirane grupe adsorbensa ili analita E prestaje elektrostatičko privlačenje i analit se eluira.
5rugi način za eluiranje je primena rastvarača koji ima toliku jonsku jačinu da dislocira vezano jedinjenje E dolazi do razmene analita i jona prisutni u rastvaraču.
17
11/4/2013
Katjonski
2ilika modifikovana sulfonskom kiselinom.
Daki katjonski izmenjivač. "ma natrijumov jon koji se menja sa pozitivno naelektrisanom grupom analita.
Moguća primena u širokom opsegu p!.
2ilika modifikovana karbonskom kiselinom.
2lab katjonskim izmenjivač.
'rimena moguća u užem opsegu p!, jedna p! jedinica iznad ili ispod pKa vrednosti analita.
0njonski
2ilika modifikovana kvaternernim aminima.
Dak anjonski izmenjivač koji se koristi u širokom opsegu p! vrednosti.
2ilika modifikovana aminopropil radikalima kao slab anjonski izmenjivač primenjuje se za ekstrakciju polarni jedinjenja.
18
11/4/2013
"nterakcije između analita i jaki jonoizmenjivača
Protokol ekstrakcije mehanizmom reverznih faza
Kondicioniranje najpre metanolom ili acetonitrilom, a zatim vodom ili puferom. 2orbens +/ 2M/ da se osuši.
0dsorpcija
"spiranje veoma polarnim rastvaračem
/luiranje
R -(CH3)2 C18H37 -C18H37 -(CH3)2 C8H17 -C2H5
'rva se eluira najpolarnija komponenta iz smeše primenom odgovarajućeg rastvaraća koji je manje polaran od rastvarača koji je korišćen za pripremu uzorka.
'ostepenim povećanjem nepolarnosti eluenta eluiraju se i ostale komponente -red eluiranje je red rastuće nepolarnosti.
19
11/4/2013
'rimer# :ralna suspenzija lorpromazina 2adrži# lorpromazin, metilparaben, neutralnu idrofilnu boju, +a( laktatni pufer, lipofillni korigens ukusa.
& 6ml uzoraka doda se 8,6ml amonijačnog pufera p! <,6.
Kondicioniranje sorbensa# amonijačnim puferom.
!lorpromazin se nalazi u formi slobodne baze i adsorbuje se na :52 2'/ adsorbens.
2ve komponente rastvorljive u vodi pri baznom p! se ispiraju sa adsorbensa.
&zorak lorpromazina se eluira smešom 8,6 M fosfatni pufer p! ;,8 # metanol -<6 # 6 i dopuni volumen potreban za &1 spektrofotometriju.
Protokol ekstrakcije mehanizmom normalnih faza
Kondicioniranje nepolarnim rastvaračem E najčeščće rastvarač u kome je pripremljen uzorak.
0dsorpcija
"spiranje nepolarnim rastvaračem
/luiranje
R -(CH2)3 NH2 -(CH3)2 (CH2)3 CN -(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH
'rva se eluira najnepolarnija komponenta iz smeše primenom odgovarajućeg rastvaraća polarnijeg od rastvarača koji je korišćen za pripremu uzorka.
'ostepenim povećanjem polarnosti eluenta eluiraju se i ostale komponente -red eluiranje je red rastuće polarnosti.
20
11/4/2013
Protokol ekstrakcije mehanizmom jonske izmene
/kstrakcija na anjonskim izmenjivačima
Kondicioniranje puferom čiji je p! blizak uzorku -8,87 E 8,7 M i koji sadrži lako izmenjive jone -* ;!6*::(, *!I*::(, 3(. Doni kao što su *l(, 4r(, +:I(, !2:9( ili citratni anjon nisu lako izmenjivi joni i treba i izbegavati.
0dsorpcija# p! rastvora uzorka mora biti 7(; p! jedinice iznad pKa analita.
"spiranje dejonizovana voda ili organski rastvarač
/luiranje rastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno da istisne adsorbovani analit. 1rlo često se mora dodati i organski rastvarač.
'rimer# /kstrakcija meticilina
elativno jaka kiselina pa se može ekstrakovati na primenom i jaki i slabi anjonski jonoizmenjivača.
&zorak# astvor u puferu -p! I.L(9.L
/luiranje# pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji kompetitivno istiskuju meticilin -7 M +a*l ili citrat.
21
11/4/2013
/kstrakcija na katjonskim izmenjivačima
Kondicioniranje puferom čiji je p! blizak uzorku -8,87 E 8,7 M i koji sadrži lako izmenjive jone -K G, +aG, +!9G. Doni kao što su *a;G ili Mg;G nisu lako izmenjivi joni i treba i izbegavati.
0dsorpcija# p! rastvora uzorka p! 7(; p! jedinice ispod pKa analita.
"spiranje istim puferom, dejonizovanom vodom ili organskim rastvaračem.
/luiranje rastvorom pufera koji sadrži jon koji može kompetitivno da istisne adsorbovani analit. 1rlo često se mora dodati i organski rastvarač.
'rimer# /kstrakcija adrenalina
&zorak# rastvor u puferu p! L,I.
/luiranje# pufer koji sadrži visoku koncentraciju jona koji kompetitivno istiskuju adrenalin -7 M +!9*l.
22
