Drojdiile.pdf

1. Drojdiile ca agenţi biotehnologici Introducere Micr Microo oorg rgan anis isme mele le incl incluz uzân ândd bact bacter eriil iile, e, droj drojdi diil ile, e, fung fungii ii fila filame ment ntoş oşii şi alge algele le unicelulare au fost folosite în culturi submerse pentru obţinerea diferitelor produse printre care care şi biom biomas asaa prot protei eică că.. De la înce începu putu turil rilee prod produc ucţi ţiei ei pe scar scarăă larg largăă de peni penici cili lină nă,, streptomicină şi de alte antibiotice şi până la conversia steroizilor de către o varietate de microorganisme, s-au dezvoltat şi o serie de ecipamente pentru culturile submerse dintre care, mai utilizate sunt două tipuri! bioreactorul cu agitare mecanică , cu diferite variante de agitatoare şi sisteme de spargere a spumei, fermentatorul airlift care care poate fi considerat un ibrid între fermentatorul clasic cu agitare mecanică şi tipul cu draft al fermentatorului airlift. "actorii limitativi ai dezvoltării celulare în astfel de ecipamente de fermentaţie sunt transferul de căldură şi transferul de masă, ultimul influenţând folosirea nutrienţilor, în special a o#igenului de către celule precum şi cantitatea produşilor de metabolism. $n jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogată literatură de specialitate, care descrie efectu efectull acesto acestorr factor factorii asupra asupra dezvol dezvoltăr tării ii cultu culturil rilor or sub subme merse rse microb microbien iene, e, cu pun punere ereaa în evidenţă a factorului limitativ pentru producţia de masă celulară şi de metaboliţi primari sau secundari. %&' $n Figura 1 sunt prezentate principalele aplicaţii industriale tradiţionale şi moderne ale drojdiilor bazate pe e#ploatarea dezvoltării drojdiilor şi pe procesele metabolice specifice acestora la nivel industrial %('.

&&

Figura 1. )iotenologii tradiţionale şi moderne bazate pe drojdii.

*ccentul este pus pe relaţia dintre fiziologia celulelor de drojdie şi biotenologie pe de o parte şi *D+ recombinant şi tenologiile de fermentaţie pe de altă parte. rivitor la drojdiile non Saccharomyces, creşterea importanţei lor industriale este în particular datorată producţiei masive de substanţe şi preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evidenţiată importanţa drojdiilor ca modele e#perimentale în studiile fundamentale ale ştiinţelor biomedicale %'.

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece în cea mai mare măsură sunt utilizate pentru producerea de alimente, vin, bere, substanţe bioterapeutice şi produse farmaceutice. $n prezent au fost recunoscute apro#imativ şapte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile sunt adesea utilizate în biotenologia tradiţională şi modernă, descoperirea de noi specii este legată şi de noile tenologii. entru entru descri descriere ereaa domeni domeniulu uluii drojdii drojdiilor lor au fost fost utiliz utilizate ate mai mai multe multe defin definiţii iţii.. $n conformitate cu uilliermond /&0&(1 şi 2odder /&0341 %&&' drojdiile sunt fungi unicelulari cu reproducere prin înmugurire ori fisiune. $n acest sens, s-a recunoscut că drojdiile sunt fungi unicelulari adevăraţi, dar în realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice şi produc pseudoife şi ife, pe lângă dezvoltarea unicelulară. 5imilar, majoritatea fungilor ifali sunt dimorfici şi, în mod uzual, aceştia au fost denumiţi 6east 7 li8e. 9denti 9dentifica ficarea rea,, numire numireaa şi plasar plasarea ea drojdi drojdiilo ilorr în propiu propiull lor cadru cadru evo evolut lutiv iv sun suntt impor importan tante te pen pentru tru multe multe domeni domeniii ale ştiinţ ştiinţei ei care care includ includ agricu agricultu ltura, ra, medic medicina ina,, ştiinţ ştiinţele ele biologice, biotenologia, biotenologia, industria alimentară. alimentară. 9nvestiga 9nvestigaţii ţii comparat comparative ive care includ includ morfologia morfologia,, fiziologia fiziologia,, genetica, genetica, biocimia biocimia,, ecologia şi genetica moleculară, au îmbogăţit ta#onomia drojdiilor. rima perioadă perioadă în sistematic sistematicaa drojdiilor drojdiilor care se situează situează până la nivelul nivelul anilor anilor &0:4 &0:4,, este caracterizată prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriţională comparată şi genetică convenţională. convenţională. 9niţia 9niţiall pen pentru tru utiliz utilizări ări ta#on ta#onomi omice ce se folose foloseau au teste teste care care se refere refereau au la nu numă mărul rul atomilor de carbon asimilaţi şi la folosirea compuşilor azotului. ;ic8erman /&0<&1 a e#tins aceste cercetări şi astăzi apro#imativ un număr de 60 de teste sunt utilizate curent şi ele includ fermentaţia şi asimilarea compuşilor carbonului, asimilarea compuşilor azotului, cerinţele în vitamine, rezistenţa la cycloheximide, necesităţi de temperatură

&(

Figura 1. )iotenologii tradiţionale şi moderne bazate pe drojdii.

*ccentul este pus pe relaţia dintre fiziologia celulelor de drojdie şi biotenologie pe de o parte şi *D+ recombinant şi tenologiile de fermentaţie pe de altă parte. rivitor la drojdiile non Saccharomyces, creşterea importanţei lor industriale este în particular datorată producţiei masive de substanţe şi preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evidenţiată importanţa drojdiilor ca modele e#perimentale în studiile fundamentale ale ştiinţelor biomedicale %'.

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece în cea mai mare măsură sunt utilizate pentru producerea de alimente, vin, bere, substanţe bioterapeutice şi produse farmaceutice. $n prezent au fost recunoscute apro#imativ şapte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile sunt adesea utilizate în biotenologia tradiţională şi modernă, descoperirea de noi specii este legată şi de noile tenologii. entru entru descri descriere ereaa domeni domeniulu uluii drojdii drojdiilor lor au fost fost utiliz utilizate ate mai mai multe multe defin definiţii iţii.. $n conformitate cu uilliermond /&0&(1 şi 2odder /&0341 %&&' drojdiile sunt fungi unicelulari cu reproducere prin înmugurire ori fisiune. $n acest sens, s-a recunoscut că drojdiile sunt fungi unicelulari adevăraţi, dar în realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice şi produc pseudoife şi ife, pe lângă dezvoltarea unicelulară. 5imilar, majoritatea fungilor ifali sunt dimorfici şi, în mod uzual, aceştia au fost denumiţi 6east 7 li8e. 9denti 9dentifica ficarea rea,, numire numireaa şi plasar plasarea ea drojdi drojdiilo ilorr în propiu propiull lor cadru cadru evo evolut lutiv iv sun suntt impor importan tante te pen pentru tru multe multe domeni domeniii ale ştiinţ ştiinţei ei care care includ includ agricu agricultu ltura, ra, medic medicina ina,, ştiinţ ştiinţele ele biologice, biotenologia, biotenologia, industria alimentară. alimentară. 9nvestiga 9nvestigaţii ţii comparat comparative ive care includ includ morfologia morfologia,, fiziologia fiziologia,, genetica, genetica, biocimia biocimia,, ecologia şi genetica moleculară, au îmbogăţit ta#onomia drojdiilor. rima perioadă perioadă în sistematic sistematicaa drojdiilor drojdiilor care se situează situează până la nivelul nivelul anilor anilor &0:4 &0:4,, este caracterizată prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriţională comparată şi genetică convenţională. convenţională. 9niţia 9niţiall pen pentru tru utiliz utilizări ări ta#on ta#onomi omice ce se folose foloseau au teste teste care care se refere refereau au la nu numă mărul rul atomilor de carbon asimilaţi şi la folosirea compuşilor azotului. ;ic8erman /&0<&1 a e#tins aceste cercetări şi astăzi apro#imativ un număr de 60 de teste sunt utilizate curent şi ele includ fermentaţia şi asimilarea compuşilor carbonului, asimilarea compuşilor azotului, cerinţele în vitamine, rezistenţa la cycloheximide, necesităţi de temperatură

&(

Drojdiile ca agenţi biotehnologici

5tudiile genetice relevă prezenţa diferitelor stadii se#uale. =iclul se#ual la ascomicete poate fi aplontic, diplontic ori diploaplontic. 5peciile de drojdii pot fi omotalice, eterotalice, sau o combinaţie a acestora. %&4' * doua perioadă în sistematica drojdiilor este considerată de la &0:4 până în prezent, şi este este carac caracter teriza izată tă printr printr-o -o aprofu aprofund ndare are a studiu studiului lui carac caracter terelo elorr morfo morfolog logice ice datori datorită tă introd introduce ucerii rii micros microscop copiei iei electr electroni onice, ce, a aplic aplicări ăriii criter criteriilo iilorr bioci biocimic micee şi a introd introduce ucerii rii studiilor de genetică moleculară. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferenţe într întree droj drojdi diil ilee asco ascomi mice cete te şi bazi bazidi diom omic icet ete. e. Droj Drojdi diil ilee asco ascomi mice cete te au pere pereţi ţiii celu celula lari ri transparenţi la electroni şi conţin în majoritate β - glucani, pătura e#ternă fiind formată f ormată din α manani. Drojdiile bazidiomicete au pereţii celulari cu o structură lamelară netransparentă la electr electroni oni şi forma formaţi ţi în majori majoritat tatee din β - glucani. "ormarea mugurelui este de asemenea dife diferi rită tă la cele cele do două uă grup grupur urii de droj drojdi dii. i. Droj Drojdi diil ilee asco ascomi mice cete te prez prezin intă tă o înmu înmugu gurir riree oloblastică, care constă în participarea întregului perete celular, la formarea noului perete, a mugurelui pe când la drojdiile bazidiomicete care au o înmugurire enteroblastică, participă numai stratul interior al peretelui celular. >ltrastructura septului arată diferenţe importante între cele două clase de drojdii. 5eptul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai mulţi micropori. 5eptul simplu are un singur por central, pe lângă unii pereţi despărţitori de la unele bazidiomicete, care au o structură de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membrană perforată numită parentezom. entru diferenţieri ta#onomice au fost utilizate caracteristici biocimice, compoziţia în glucide a pereţilor celulari şi capsulelor, spectrul de rezistenţă magnetică a pereţilor celulari, numărul unităţilor izoprenice din coenzima ?, citocromii, compoziţia în acizi graşi şi paternul izoenzimelor. %&(' 9ntrod 9ntroduce ucerea rea studii studiilor lor *D+ *D+,, furniz furnizea ează ză în princi principa pal, l, un parame parametru tru obiect obiectiv iv în estimarea distanţelor evolutive din punct de vedere ta#onomic. Diferitele metode utilizate oferă soluţii la diferite niveluri ta#onomice. @aloarea ta#onomică a compoziţiei în baze a *D+ /molA B=1 este în special caracteristică ta#onomică de specie. Culpinile fenotipice care diferă au un procent mai mare de ( 7 A în compoziţia bazelor, sunt considerate specii diferi diferite. te. 2imite 2imitele le în compoz compoziţi iţiaa de baze baze a *D+ *D+,, diferă diferă pen pentru tru drojdi drojdiile ile ascom ascomice icete te şi bazidiomicete. =ele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanină şi citozină /molA B=1 mai mic de <4, pe când majoritatea bazidiomicetelor au acest procent peste <4 /Tabelul 11. &

Tabelul 1. Distribuţia molA B= la diferite ascomicete şi bazidiomicete Mol% G+

!rocentajul la drojdiile

!rocentajul la drojdiile

(< 7 (4

asco"icete 4,3<

ba#idio"icete -

4 7 

&,<

-

< 7 0

(E

&

4 7 

(,<

&

< 7 0

&:

&4

<4 7 <

<,<

<

<< 7 <0

(

&

:4 7 :

4,3<

:< - :0

-

&E 

5tudiile de ibridare a *D+ au fost utilizate pentru determinarea similarităţilor între specii. Metodele utilizate în aceste studii se referă la analiza spectrofotometrică a formării eteroduple#ului şi la cele fluorometrice şi colorimetrice. %&' Cenicile electroforetice utilizate în sistematica drojdiilor au creat posibilitatea realizării de studii la nivelul cromozomilor individuali. Multe specii de drojdii au o variaţie considerabilă ca număr şi dimensiune a *D+ cromozomal.

1.1.1. Aspecte de genetic$ "olecular$ 9ngineria genetică, sau în sens strict tenologia *D+ recombinant a revoluţionat rapid câteva domenii de bază în genetică şi biologia aplicată. $n ultimii ani drojdia Saccharomyces cerevisiae a

fost utilizată ca model e#perimental pe care s-a studiat e#presia genelor din

eucariotele superioare. $n Figura  sunt prezentate scematic procedeele de bază în tenologia *D+ recombinant la drojdii. 2a tulpinile de drojdii industriale aspectele de genetică moleculară se referă la alegerea vectorilor, promotorilor, la selecţia mar8erilor şi la semnalele de secreţie. *plicaţiile biotenologice sunt dependente de clonarea genelor eteroloage pentru drojdii, izolate din *D+ viral, procariote sau eucariote.

&


Figura . rocedeele de bază în ingineria genetică la drojdii.

+umeroşi vectori plasmidiali au fost construiţi pentru transformarea genetică a celulelor de drojdie /Tabelul 1. $n general pentru o transformare cât mai eficientă a celulelor de drojdie, vectorii trebuie să conţină! -

secvenţe de plasmide bacteriene / ! coli1, care servesc la producerea clonării şi amplificării şi care permit ca *D+ să se insereze în celula gazdăF

-

secvenţă /*G51 care se replică autonomF

-

secvenţă centromerică /=H+1 pentru stabilitatea segregării mitoticeF

-

mar8eri selectaţi corespunzător şi avantajosF

-

unul sau câteva situsuri pentru enzimele de restricţie, care permit inserarea *D+ eterolog. %'

Tabelul . @ectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie &<

Tipuri de vector

&'e"ple

lasmide de integrare

lasmidă integrativă de drojdie /Ilp1 lasmidă replicativă de drojdie /IGp1

lasmide de replicare independentă

lasmidă epizomală de drojdie /IHp1 lasmidele centromerice de drojdie /I=p1 lasmidă lineară de drojdie /I2p1 =romozomi artificiali de drojdie /I*=s1

lasmide specializate

lasmidă de e#presie /IKp1 lasmide Liller

aracteristici "recvenţe scăzute de integrare în loci cromozomali prin recombinare omoloagă. Ilps sunt integrate în copii singulare, iar transformanţii sunt stabili, ciar în absenţa presiunii selective. "recvenţe înalte de transformare /<44 7 (444 de transformanţi per µg *D+1 datorită elementelor *G5 care menţin replicarea e#tracromozomală. lasmidele sunt instabile pe timpul dezvoltării drojdiei datorită segregării asimetrice în diviziunea celulară. Irps sunt utilizate rar. *cestea sunt derivate din plasmidele de ( µm din Saccharomyces cerevisiae cu origine în secvenţele de replicare. Ieps sunt relativ stabile, susţinute e#tracromozomal de <4 7 &44 copii per celulă. 9ncluderea secvenţelor centromerice /=H+1 funcţionale de drojdie, conduce la segregarea stabilă în mitoză. lasmidele sunt susţinute de & 7  copiiJcelulă şi sunt stabile în diviziunea celulelor. *cestea sunt plasmide cromozomale artificiale care conţin secvenţe telomerice pentru susţinerea stagiului linear =romozomi artificiali, lineari liberi sunt foarte stabili /conţin secvenţe =H+1. 5unt utilizaţi pentru receptarea de inserţii libere de *D+, în analizele genomului uman, bogate în tenici fizice curente =onţine promotor transcripţional şi secvenţe terminale, de care genele eteroloage se pot lega. De asemenea, conţin secvenţe pentru modificarea şi secreţia proteinelor e#terne pL2& şi ( din "luyveromyces lactis sunt plasmide Liller lineare, care pot fi dezvoltate ca vectori de clonare

lasmide de >tilizate pentru pierderea totală a secvenţei de vectori dezintegrare bacterieni. /IDp1 romotorii sunt utilizaţi ca vectori de clonare în drojdii pentru mărirea transcripţiei genelor de interes. 5ecvenţele promotor care derivă din drojdii sunt /omoloage1 sau eteroloage. =ei mai frecvenţi promotori constitutivi de drojdie sunt genele glicolitice care conduc la o e#presie transcripţională înaltă. Hnzimele glicolitice din celule de drojdie fermentate pot fi între & 7

separată din e#presia genei care controlează disponibilitatea pentru anumiţi nutrienţi /galactaza în cazul *2&, fosfatul în cazul N<, metionina în cazul MHC(< sauu ionii de cupru în cazul =>&1 /Tabelul (1.

Tabelul (. Geglarea fiziologică a promotorilor transcripţionali în drojdii !ro"otor *2& N<

)eglare *i#iologic$ Gepresat de glucoză, indus de galactoză Gepresat de înalte şi indus de scăzute niveluri de fosfat anorganic

*D(

Gepresat de glucoză, derepresat natural către sfârşitul dezvoltării pe glucoză

M"a&

*ctiv în celule M*Ca, inactiv în celule M*C α sau aJ α

M"α&

9ndus de şiftul de temperatură scăzut

=>&

9ndus de ionii de =u

MH2&

9ndus de galactoză, represat de glucoză

MHC(<

Gepresat de metionină

ibrid LJ*GH

9ndus de diidrotestosteron

ibrid =I=JGH

9ndus de deo#icorticosteron

L sau C5Ja ( generator 9ndus de siftul de temperatură scăzut 5H

9ndus de şocul de căldură /0 4=1

*NK&

Gepresat de glicerol, indus de metanol /în #ichia pastoris$

MNK&

Gepresat de glicerol, indus de metanol / %ansenula polymorpha1

5ifturile de temperatură pot fi, de asemenea, utilizate pentru reglarea e#presiei genelor eteroloage în drojdie. %<' $n mod particular activitatea transcripţională puternică a genelor eteroloage poate fi găsită în drojdiile metilotrofe %ansenula polymorpha şi #ichia pastoris. %:' >n alt aspect de genetică moleculară relevat cu succes de tenologia *D+ recombinant este selecţia mar8erilor corespunzători care sunt utilizaţi la izolarea şi identificarea celulelor transformante /Tabelul 1.

Tabelul . 5elecţia mar8erilor genetici utilizaţi în tenologia *D+ recombinant la drojdii.

&3

Tipul de "ar,er

Gena 2H>(

aracteristici ene cu mutaţii au#otrofice

CG&

complementare pentru biosinteza

95

aminoacizilor

2I5( >G*

Gecesiv

ene cu au#otrofie complementară

*DH( *miloglucozidază β - 2actanază

Dominant

pentru nucleotide ene care conferă activitate enzimatică

=>&

Gezistenţă la cupru.

&EG

Gezistenţă la antibiotic aminoglicozidic.

C>+G

Gezistenţă la Cunicamicin.

L92L&

9munitate la to#ina Liller.

=(4

Mar8er cromogenic.

5MG&

Gezistenţă la metil sulfometuran.

5"*

=odifică formiat deidrogenaza /celule care se dezvoltă în :mM formaldeidă1. G

6gromicin

Metotre#atG =loramfenicolG DiuzonG

ene

care

conferă

rezistenţă

la

medicamente

OeocinG =anavanină G Mar8erii recesivi sunt gene care sunt complementare la o mutaţie au#otrofică specifică în tulpina de drojdie gazdă.Mar8erii specifici dominanţi sunt necesari pentru selecţia transformanţilor tulpinilor industriale de Saccharomyces cerevisiae. Hlementele moleculare implicate direct în secreţia de proteine sunt secvenţele semnal ale capătului + 7 terminal din proteina destinată e#creţiei. *ceste peptide semnal /formate din apro#imativ &< 7 4 aminoacizi1 care sunt îndepărtate de proteazele specifice, sunt codificate de către drojdii /native1 sau de gene străine eteroloage, care sunt inserate în joncţiunea dintre partea finală a celui de-al

Tabelul -. 5ecvenţele semnal utilizate pentru secreţia proteinelor eteroloage din drojdii. Tip omoloage

Gena secvenţei se"nal 5>=(

aracteristici =odifică invertaza periplasmică &E


N<

=odifică fosfataza

Co#ină Liller

"luyveromyces lactis

acidă

periplasmică din

α - factor

repro-Mfa& leader este cel mai frecvent utilizat

MH2&

=odifică melobioza şi secreţia de glicoproteină =odifică serumalbumina umană /5* prepro a

eteroloage

5*

fost utilizat în #ichia pastoris1

Genină de &ucor pusillus

2izozim de pui rolactin de bovine astrin uman =ele mai utilizate secvenţe semnal în Saccharomyces cerevisiae sunt cele derivate din invertază /codificată de 5>=(1, fosfatază acidă /N<1 şi α - factor /M"a&1. 5pecificitatea e#opepdidazelor LHK( şi 5CH& este pentru secvenţele de pe + 7 terminal ale punctului de sciziune /Figura (1 α - factor leader a fost folosit cu succes direct în secreţia numeroşilor agenţi terapeutici umani %3'.

Figura (. =ompoziţia şi procesarea α - factor leader în Saccharomyces cerevisiae

rocesul post 7 translaţional şi modificarea proteinelor recombinante de drojdie sunt importante aspecte moleculare, care necesită o atenţie deosebită în special în ceea ce priveşte producerea de proteine terapeutice umane. rimul pas în procesul post 7 translaţional este îndepărtarea iniţiatorului de metionină din proteina astfel sintetizată de către metionilaminopeptidaza, care este un proces comun eucariotelor superioare. Modificările

&0

cimice pe care drojdiile le elimină odată cu proteinele eteroloage includ! glicozilarea, fosforilarea, acetilarea, metilarea, meristilarea şi izoprenilarea %, E'. 5inteza şi totodată modificarea proteinelor eteroloage produse de către drojdii, suferă mai întâi o degradare proteolitică intracelulară, înaintea purificării lor. $n Saccharomyces cerevisiae asemenea

proteoliză poate fi unispecifică şi asociată cu vacuole sau poate fi

specifică şi cuplată cu sistemul ubiQuitin %, 0'.

1.. Integritatea i "enţinerea geno"ului "itocondrial 9nstabilitatea genomului mitocondrial /*D+mt1 este o problemă generală de la drojdii până la organismul uman. Nricum, controlul lui genetic nu este foarte bine cunoscut, cu e#cepţia de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. De la descoperirea, acum <4 de ani, a unor mutante petit de către Hprussi şi colaboratori, s-a arătat că mai mult de &44 de gene nucleare influenţează direct sau indirect soarta ro B din *D+ mitocondrial %&'. +u este surprinzător că mutaţiile genelor implicate în metabolismul *D+mt /replicare, reparare, recombinare1 pot cauza o pierdere completă a *D+mt /GN 4 petit1 şiJsau conduc la formele reduse ale acestui genom. Nricum, cele mai multe pierderi ale funcţiei de mutaţie, care măresc instabilitatea *D+mt la drojdii, se comportă indirect prin implicarea în controlul diferitelor funcţii genetice, cum ar fi translaţia mitocondrială, sinteza *C, omeostazia "e, metabolismul acizilor graşi, morfologia mitocondriilor. $n puţine cazuri s-a arătat că suprae#primarea genelor măreşte nivelurile mutantelor petit. Mutaţiile la alte gene sunt letale, în absenţa unui *D+mt funcţional, ceea ce transformă aceste drojdii petit pozitive în forme petit negative şi celulele petit nu pot fi recuperate în aceste conte#te genetice. Multe dintre aceste date sunt e#plicate numai dacă una dintre ele presupune că păstrarea genomului ro B depinde de o structură asemănătoare centromerului, indispensabilă pentru menţinerea *D+mt roB şiJsau a funcţiei subunităţilor de sinteză a *C codificate mitocondrial, în special *C:.

1.(. $ile MA! / ,ina#ei la drojdia Saccharomyces cerevisiae >n set de  protein 7 8inaze, cunoscute ca M*L /protein 8inaza mitogen activată1, este întâlnită în mod curent ca parte a căilor de semnalizare în celulele eucariote. *proape două decenii de e#perienţe în domeniul geneticii şi biocimiei, plus completarea recentă a ărţii genetice a Saccharomyces cerevisiae au adus la iveală doar < seturi M*L funcţionale şi distincte la această drojdie %&<'. (4


=onjugarea se#uală, creşterea celulară şi adaptarea la stres, de e#emplu, toate acestea necesită răspunsurile celulare mediate de M*L. N principală funcţie a acestor seturi pare a fi e#presia genelor, ca răspuns la semnalele e#tracelulare sau ca parte a proceselor de dezvoltare specifice. 5eturile M*L deseori par a regla ciclul celular şi invers. $n ciuda succesului erei ingineriei genetice, în descoperirea acestor căi e#istă încă multe lipsuri importante despre mecanismele moleculare ale activării acestor cascade, a modului cum aceste cascade reglează funcţiile celulei. De e#emplu, comparaţia căilor de semnalizare specifice diferitelor drojdii a scos la iveală o varietate foarte mare a diferitelor tipuri de proteine semnalizatoare, a căror funcţie activează M*L. Cotuşi modul de activare de către aceste proteine a M*L, rămâne neclar. Rtim, de asemenea, că toate căile M*L ale drojdiei se reglează reciproc şi interacţionează cu alte căi de semnalizare pentru a produce un model de e#primare coordonat a genelor, dar mecanismul molecular al acestuia este foarte puţin cunoscut.

1.. !rionii din Saccharomyces cerevisiae i Podospora sp. 5tudiile genetice au arătat că ( elemente genetice non 7 mendeliene la Saccharomyces cerevisiae,

numite />GH1 şi /591 sunt prionii lui >re(p şi respectiv 5upGH1 face

ca celula să se prerepreseze pentru catabolismul azotului, în timp ce /591 ridică eficienţa supresorului *G+ts. *ceeaşi abordare a dus la identificarea elementului non 7 mendelian /et-s1 al fungului filamentos #odospora anserina , ca prion al proteinei et 7 s. "orma prionică a proteinei et-s este cerută pentru incompatibilitatea eterocarionului, o funcţie normală a fungului, ceea ce sugerează că alte funcţii celulare normale pot fi controlate de prioni. />GH1 şi /591 implică o autopropagare şi agregarea >re(p şi 5upre(p şi 5up
1.-. Ingineria "etabolic$ la drojdii Saccharomyces cerevisiae este

cel mai intens studiat microorganism eucariot, care

ajută la cunoaşterea biologiei celulei eucariote şi, implicit, a biologiei umane. @reme de câteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost întrebuinţată în producerea de alimente şi băuturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit în numeroase procese (&

din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se lucrează uşor, deoarece este nepatogen, şi datorită multitudinii de aplicaţii apărute de-a lungul timpului în obţinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca organism G*5 /generall6 regarded as seif S organism considerat sigur, neto#ic1. De asemenea, fermentaţia şi procesele tenologice de producţie la scară largă cu Saccharomyces cerevisiae

fac ca acest organism sa fie atractiv, la îndemână, pentru câteva scopuri

biotenologice, aşa cum va fi ilustrat în continuare. >n alt motiv important pentru a justifica utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae în cadrul biotenologiei îl reprezintă susceptibilităţile sale la modificările genetice prin tenologia *D+ recombinant, care a fost mai departe înlesnite de accesul la secvenţa genomică completă a Saccharomyces cerevisiae, publicată în &00: %&:'. $mbunătăţirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat în mod tradiţional prin mutageneză la întâmplare şi pe încrucişările genetice a două tulpini, urmate de screening, în funcţie de calităţile de interes ale mutantelor. Dezvoltările recente ale unor metode sofisticate în domeniul tenologiei *D+ recombinant au permis să se manipuleze o anumită cale de interes şi de aici să se îmbunătăţească celula printr-o abordare mai directă. Cotuşi, acum este posibil să se introducă anumite perturbări genetice în sensul de a modifica puterea de iniţiere a unei anumite gene, de a induce deleţii asupra genelor sau de a introduce gene întregi în celulă %&E'. $mbunătăţirile propietăţilor celulare obţinute prin combinarea analizelor teoretice bazate pe informaţiile de biocimie şi pe aplicaţiile ingineriei genetice, au fost oferite de ingineria metabolică %&<'. *ceastă abordare constă în mare în două aspecte importante! &. partea analitic$ a ingineriei metabolice, care se ocupă cu studiul celulelor pentru identificarea tintelor cele mai potrivite şi (. ingineria genetic$ a celulelor care se ocupă de obţinerea unor celule cu modificările genetice dorite. >n mod de a grupa diversele ţinte pentru ingineria metabolică ar cuprinde! -

e#tensia categoriei substratuluiF

-

îmbunătăţiri ale productivităţii şi producţiei /profitului1F

-

îmbunătăţirea performanţei procesului biotenologicF

-

îmbunătăţirea propietăţilor celulare.

((


1.-.1. 0oi concepte asupra ingineriei "etabolice După cum s-a menţionat şi în introducere, ingineria metabolică implică o abordare directă asupra aplicaţiei tenologiei *D+ recombinant pentru îmbunătăţirea tulpinilor, şi a fost definită ca Tîmbunătăţirea directă a formării produsului sau a propietăţilor celulare prin modificarea unor reacţii biocimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea tenologiei *D+ recombinantU %&E'. $n acestă definiţie termenul Treacţii biocimiceU trebuie interpretat în sensul lui mai larg. =eea ce distinge ingineria metabolică de aplicaţiile clasice de biologie moleculară este folosirea unei abordări directe. *ceasta presupune cunoştinţe bogate despre sistemul folosit şi, după cum a fost menţionat în introducere, ingineria metabolică conţine două părţi! partea analitică şi partea sintetică. *ceastă situaţie este ilustrată în Figura

. $n anumite cazuri partea sintetică o precede pe cea analitică, dacă natura substratului are nevoie de o e#tindere prin e#presia unei enzime eterogene, dar în toate cazurile este important ca părţile analitică şi sintetică să meargă mână în mână. *cest lucru este foarte bine ilustrat prin încercările de a e#tinde natura substratului. *ici, în mod clar, primii paşi sunt de a introduce gene eteroloage care activează metabolismul substratului de interes, iar în acest scop este important să luăm în consideraţie două strategii diferite! a. introducerea unei gene ce codifică o proteină de legătură a membranei, care transportă un anumit substrat în celulă în combinaţie cu o genă ce codifică o proteină responsabilă pentru scindarea substratuluiF b. introducerea unei gene ce codifică o proteină secretată în mediul e#tracelular, unde substratul de interes este transformat sau scindat în substraturi care ar putea fi asimilate direct de organismul gazdă.

(

Figura . Aspecte variate ale ingineriei metabolice împărţite în partea analitică şi partea sintetică.

9ndiferent de strategia aleasă, este important să se asigure că genele eterogene sunt e#primate suficient în noul sistem gazdă. *ceasta poate implica luarea în considerare a unor posibile modificări postranslaţionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de interes, iar aceasta necesită analize atente ale tulpinii recombinante. După obţinerea unui organism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obţin rate scăzute şi (


producţii în general mici ale produsului din substratul respectiv. entru a identifica problema cea mai importantă şi a direcţiona următorul pas sintetic este necesar să se detvolte o analiză detaliată a fiziologiei celulei. *ceasta poate fi ilustrată în mod clar în încercarea de a transforma #iloza la etanol prin fermentaţii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. *stfel, ingineria metabolică aproape întotdeauna va implica o strânsă interacţiune între părţile analitică şi sintetică, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcţii de tulpini, înainte de obţinerea unei tulpini recombinante optime. $n ingineria metabolică la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetică este relativ devansată de partea analitică. *ceasta se datorează comple#ităţii metabolismului celular, ce poate interacţiona cu e#primarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin concentraţia de enzime. $n multe cazuri sunt necesare multiple modificări, iar pentru fiecare modificare, pot apărea scimbări neaşteptate ale metabolismului celular. artea analitică se referă în mod clasic la fiziologie, în ultimii ani numeroase tenici avansate fiind utilizate pentru o analiză mult mai elaborată a fiziologiei celulare. *ceasta include tenici ale *D+ pentru analiza transcriptoamelor /cuantificarea simultană a tuturor genelor transcrise într-o celulă1, gel bidimensional de electroforeză pentru analiza proteoamelor /cuantificarea simultană a unui număr mare de proteine într-o celulă1, gaz cromatografie cu sprectrometria de masă /= 7 M51 şi licid cromatografie cu spectrometrie de masă /2= 7 M51, pentru analiza nivelurilor metabolice intracelulare, e#perimente cu = & pentru analiza reţelei metabolice, studii avansate de fermentaţie cu monitorizare on ( line a variabilelor de cultivare mai importante şi bioinformatica /modele matematice pentru analiza structurii căilor şi structurii flu#urilor1.

1.-.1.1. Anali#a transcriptoa"elor i proteoa"elor *naliza metodologiei *D+ în domeniul transcriptoamelor este o tenică încă nouă în prezent nefiind e#emple despre modul cum a fost folosită tenica în ramurile ingineriei metabolice. Deoarece multe provocări în ingineria metabolică implică scimbări genetice multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte importantă pentru ingineria metabolică în viitor, deoarece această analiză permite studierea scemei e#primării multor gene. =a şi analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este importantă în ingineria metabolică. Deseori căile de activitate sunt corelate direct cu concentraţia proteinelor, şi când e#primarea genelor şiJsau interacţiunile proteină 7 proteină sunt supuse unei regularizări metabolice, este important să se cuantifice concentraţia proteinelor în diferite tulpini recombinante. $n mod clar, o analiză detaliată a proteomului poate fi valoroasă, deseori fiind (<

suficientă stabilirea concentraţiei de proteine implicate în căile studiate şi uneori măsurarea unor proteine reglatorii ce afectează e#primarea genelor relevante.

1.-.1..$ile de anali#$ =ăile de analiză sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaţia analizei flu#ului metabolic /M"*1 şi analiza controlului metabolic. =ăile de analiză s-au dovedit a fi un succes, ca instrument ajutător pentru partea analitică a ingineriei metabolice. M"* este o abordare globală a celulei, unde se ia în calcul reţeaua completă a reacţiilor intracelulare, unde sunt cuantificate flu#urile, prin ramurile individuale ale reţelei. "lu#urile metabolice pot fi estimate din balanţele şi măsurătorile de metaboliţi ale câtorva căi, prin introducerea substraturilor marcate cu =&, urmate de măsurătorile distribuţiei acestora în metaboliţii intracelulari. $n acest caz spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară sau = 7 M5 poate fi folosită pentru a măsura tiparul metaboliţilor precursori marcaţi. *plicarea de substraturi marcate permite determinări de flu# ale reacţiilor reversibile şi cuantificarea raţiilor de flu# între căile biosintetice ce duc la acelaşi metabolit. =ompararea distribuţiilor flu#ului obţinute în diferite condiţii fiziologice poate da informaţii de preţ despre interacţiile dintre diferite căi sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacţii biocimice, care nu au fost descoperite în prealabil într-un anumit microorganism %(4'. Cotuşi, M"* poate fi folosit în alegerea unei strategii bune pentru ingineria metabolică, dar, poate fi folosit şi ca un instrument pentru caracterizarea fiziologică a unei tulpini, ce a fost manipulată în vederea introducerii unei propietăţi noi sau modificate. >n domeniu în care M"* este interesat este îmbunătăţirea productivităţii. *cest lucru este ilustrat în "igura (, în care se prezintă o cale foarte simplă, în care substratul * este convertit în produsul ), cu formarea produsului =. 5ubstratul * poate fi glucoza, produsul ) poate fi etanolul şi produsul = poate fi glicerolul. Depăşirea obţinerii produsului de substrat este determinată de raţia flu#urilor V ) şi V*, unde productivitatea este dată de flu#ul V). 9ntermediarul 9 nu se poate acumula în interiorul celulei, flu#ul acestui metabolit va fi egal cu flu#ul ce iese din polul metabolitului. / Figura -1. "lu#urile sunt descrise de ecuaţia! V * S V) B V=, unul din aceşti termeni poate fi calculat, dacă celelalte două sunt măsurate. *cesta este conceptul balanţei metaboliţilor. N strategie clară pentru a îmbunătăţi obţinerea totală de V ) este de a reduce sau de a elimina flu#ul V= şi astfel în mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul V ). Nricum, formarea lui = joacă de obicei un rol important în metabolismul celular, iar eliminarea V= de o deleţie a unei gene, va fi letală pentru celulă sau va conduce spre au#otrofie. $n unele cazuri flu#urile pot fi determinate de constrângeri adiţionale, dacă (:


anumiţi cofactori ca +*D/1 sunt implicaţi în diferite ramuri. Modularea distribuţiei flu#ului în jurul punctului metabolic 9, cere bineînţeles analiza completă a reţelei metabolice şi de aceea conceptul de M"* este foarte important. M"* este în general cel mai folositor în cazurile în care o fracţiune relativ mărită a lui = este direcţionată spre produs în vederea obţinerii de metaboliţi primari. +u în ultimul rând, conceptul de M"* poate, de asemenea, să contribuie la înţelegerea modului în care producerea de metaboliţi secundari sau proteine eteroloage este legată de metabolismul central al lui =, prin canalul metaboliţilor precursori. %(&' M"*, de asemenea joacă un rol important în clasificarea ramurilor metabolice. rin analiza diferitelor mutante este posibilă obţinerea de informaţii despre reglarea diferitelor flu#uri, dacă o anumită locaţie a căii metabolice este fle#ibilă sau nu. entru o locaţie metabolică rigidă, enzimele din jurul punctului metabolic 9 din Figura  pot fi reglate prin regularizarea alosterică. *stfel, implicarea activităţii uneia dintre enzime, în cascada de reacţii dintre intermediarul 9 spre produsul ), ar putea să se rezolve printr-o creştere a flu#ului V ) şi implicit a randamentului în produs.

Figura -. "lu#ul metabolic V*, V) şi V= prin intermediul 9 care este un precursor al metaboliţilor ) şi =.

*ceasta sugerează un alt aspect important al căilor de analiză, şi anume identificarea enzimei, care e#ercită controlul flu#ului într-o cale metabolică dată. De fapt, problema cu locul de ţintire al genomului, pentru a obţine o creştere a flu#ului printr-o anume cale, este legată de toate categoriile de inginerie metabolică menţionate în introducere. (3

Figura . =ăile metabolice ale glucozei şi #ilulozei.

*naliza controlului flu#ului este o e#aminare a bazelor celulare TlocaleU ce deseori sunt implicate într-o singură cale metabolică, în contrast cu M"*, unde se considera întreg metabolismul celular. 5tudierea controlului flu#ului determină efectele perturbărilor în activităţile enzimatice, pentru a identifica cea mai bună ţintă enzimatică pentru manipularea genetică. 9nteresul general este de a suprae#prima genele specifice de codificare a enzimelor, care e#ercită cel mai mare control asupra flu#ului dintr-o cale, deoarece suprae#primarea unei căi întregi poate fi foarte laborioasă şi deseori imposibilă. entru e#aminarea controlului flu#ului printr-o anume cale metabolică, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca o unealtă folositoare. H#istă o varietate de metode pentru determinarea aşa 7 numiţilor Tcoeficienţi de control al flu#uluiU, care determină un flu# relativ mărit datorită unei oarecare creşteri a activităţii enzimelor individuale %&:'. 2a dezvoltarea analizei căilor metabolice este, de asemenea important să se determine intermediarii ce ar lua parte într-un anumit mecanism metabolic, care ar putea fi to#ici pentru celulă în anumite condiţii. $n plus, este important să ştim dacă o anumită cale intermediară este implicată într-o cale de transducţie 7 semnal, care (E


regularizează flu#ul prin calea metabolică de interes, prin anumite interacţiuni specifice proteină 7 proteină sau prin influenţă la nivel transcripţional %(('. =ea mai bună strategie utilizată în studiile de inginerie metabolică la Saccharomyces cerevisiae pentru consumul de #iloză a

fost introducerea genelor KI2& şi KI2( originale din

drojdii capabile să utilizeze #iloza / )andida shehatae, #ichia stipitis 1. ena KI2& codifică #iloz-reductaza /KG1 care reduce #iloza la #ilitol cu consum de +*D/1. =onversia #ilitolului în #iluloză este obţinută de gena KI2( care codifică #ilitol-deidrogenaza /KD1 /Figura 1.

1.-.. reterea productivit$ţii i producţiei *spectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum câţiva ani. Hste posibil să fie introduse propietăţi noi în drojdia de bere, printr-o puternică cone#iune între calea analitică a ingineriei metabolice şi manipularea genetică a celulei, pentru a ajuta ca procesul să fie mai profitabil. >nul dintre principalele motive pentru cererea unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatică şi înceată a α acetolactatului, la componentul nedorit şi fără aromă 7 diacetilul, care este convertit enzimatic la acetonă şi subsecvenţial la (,  butan 7 diol. N cale de a evita pierderea aromei, cauzată de diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a α - acetolactatului, pentru a se trece peste formarea acetilului. Cotuşi, modificările genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea α - acetolactat decarbo#ilazei eterogenă, determină tulpinile transformate să producă acetona direct din α acetolactat, ceea ce accelerează procesul de creştere prin diminuarea fazei de lag de la săptămâni la ore / Figura 21. α - *cetolactat decarbo#ilaza a fost evidenţiată cu succes în drojdii şi provine de la "lebsiella terrigena, !nterobacter aerogenes şi * cetobacter xilinum. %(' *lte încercări de a minimaliza formarea de diacetil în drojdiile de bere au fost încununate de succes, prin screening pentru anumite mutante şi suprae#primarea unor gene specifice, care codifică enzime implicate în procesul de biosinteză a valinei.

(0

Figura 2. =ăile biocimice ce conduc la glicerol, piruvat şi etanol.

rin tenicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil şi e#punerea gradată în mediu deficient în valină şi izoleucină /izoleucină - şi valină-1, s-au descoperit tulpini cu activitate de sinteză a acetolactatului scăzută, ce determină un flu# de carbon scăzut, direcţionat spre formarea de α - acetolactat. +umai jumătate din cantitatea de diacetil a fost produsă de unele din acele tulpini în comparaţie cu tulpinile parentale. N altă strategie de succes a fost cea de creştere a flu#ului, prin calea biosintetică a valinei, în scopul de a trece peste formarea diacetilului. Manipularea căii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosită pentru a se creşte productivitatea de etanol. =ând E enzime diferite ale glicolizei au fost e#primate separat în multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o producere mai mare de etanol decât tulpina de tip sălbatic. +ici ciar suprae#primarea enzimelor ce catalizează reacţiile ireversibile, ca e#ocinaza, fosfofructocinaza şi 4


piruvatcinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. *ceste rezultate ilustrează rigiditatea controlului flu#ului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae. Nricum, alte studii au raportat că folosirea fosfofructazei a îmbunătăţit productivitatea de etanol în cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob. N problemă majoră în legătură cu producerea de etanol prin fermentaţia anaerobă la Saccharomyces cerevisiae este

formarea substanţială de glicerol, ca produs secundar. $n

condiţiile de creştere aerobă, +*D citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la +*DB prin formarea de glicerol, în concordanţă cu deidrogenazele +*D mitocondrial e#tern, codificate de genele +DH& şi +DH( şi alternativ printr-un sistem necunoscut. *naerob, o#idarea +*D citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece fosforilarea o#idativă nu funcţionează în astfel de condiţii. H#istă două gene, D& şi D(, amândouă codificând glicerol -  - fosfat deidrogenaza, care regenerează +*D Bdin +*D, în timp ce converteşte diidro#iaceton 7 fosfatul la glicerol -  - fosfat, dar izoenzima codificată de gena D( s-a demonstrat ca fiind cea mai importantă dintre cele două, în condiţii de anaerobioză. =onversia totală a glucozei la etanol este redo# neutră, deoarece +*D este format de gliceraldeida -  - fosfat -deidrogenaza şi deoarece conversia acetaldeidei la etanol include regenerarea +*D - din +*D /Figura 21 de către alcool deidrogenaza 9 /codificată de *D&1 %('. *stfel, formarea glicerolului este importantă pentru menţinerea ecilibrului redo# din citosol, pentru a reo#ida +*D format. N posibilă strategie pentru a optimiza producţia de etanol poate fi deducerea formării glicerolului, prin redirecţionarea flu#ului de carbon, prin manipularea metabolismului redo#. =ând o mutantă gpd( a fost crescută în condiţii de anaerobioză a fost obţinută o producţie mai mare de etanol cu EA în concordanţă cu reducerea de 4A a formării glicerolului, dar creşterea specifică ma#imă a fost redusă cu 
limitatoare pentru sinteza biomasei, înainte ca transidrogenaza să fie capabilă de a susţine sinteza de +*DB, observându-se de asemenea şi lipsa creşterii în condiţii de anaerobioză. &

Figura 3. *similarea + B în Saccharomyces cerevisiae , unde ( - o#oglutaratul şi + B sunt transformate în glutamat prin două căi diferite.

$ntr-o altă abordare asupra implicării ingineriei metabolice în mărirea producţiei de etanol la Saccharomyces cerevisiae s-a intervenit în metabolismul energetic care a fost condus în sensul scimbării cerinţelor cofactorilor, în asociaţie cu asimilarea de amoniac. *similarea de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descrisă în Figura 3. *moniacul şi ( 7 o#oglutaratul pot fi convertiţi în glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat deidrogenazei, folosind +*D /d&1 sau +*D/d(1 drept cofactori %(('. *moniacul poate fi asimilat şi de glutamin 7 sintetaza /lu&1, cu formarea de glutamină, care este convertită în glutamat prin acţiunea glutamat 7 sintetazei /lt&1F suma celor două reacţii ale lu& şi lt& este arătată în "igura <. *ceste două reacţii cuplate folosesc +*D şi *C şi au un nivel crescut dacă formarea de glutamat apare doar pe această cale. 5trategia este de a reduce surplusul de +*D format în asociaţie cu sinteza biomasei în combinaţie cu producerea unei creşteri de consum de *C, care ar reduce cerinţele referitoare la producerea de glicerol şi ar creşte formarea de etanol. Deleţia genei D999 va da o creştere a producţiei de etanol cu EA şi o descreştere a producţiei de glicerol, dar ma#imul ratei specifice de creştere a fost pe jumătate 7 în comparaţie cu cel al unei tulpini de tip sălbatic, datorită unei reduceri a ratei de sinteză a glutamatului. rin deleţia genei D999 şi suprae#primarea genelor 2+& şi 2C& de către promotorii L, producţia de etanol a fost mărită cu A, în comparaţie cu tulpina gd&, suprae#primarea acestor două gene reducând ma#imul ratei specifice de creştere la 04A faţă de tipul sălbatic. =ând D( a fost suprae#primată de un promotor, într-o tulpină mutantă (


D, ma#imul ratei specifice de creştere a fost în principal egal cu cel al unei tulpini de tip sălbatic. Nricum scăderea observată în formaţiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o creştere considerabilă a producţiei de etanol, ci, mai degrabă dintr-o creştere a producerii de biomasă. Cotuşi ingineria metabolică care diminuează formarea de glicerol prin solicitarea unei cantităţi mărite de +*D reo#idat în celulă, nu conduce neapărat la o mărire a producţiei de etanol. entru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de +*D ar trebui combinată cu un consum mai mare de *C în formarea biomasei, unde celula compensează pentru cererea energetică mărită, prin creşterea flu#ului spre etanol. *cest e#emplu ilustrează cum un flu# îmbunătăţit pe una din căi poate fi obţinut prin ingineria unei căi complet diferite şi arată că este important ca întreaga reţea metabolică să fie luată în consideraţie. $n completarea e#emplului mai sus amintit, mărirea ratei de conversie a *C la *D poate fi obţinută prin introducerea activităţii unei *C-aze unei anumite celule, unde producţia unui anumit component poate fi îmbunătăţită. Gecent, au fost descrise numeroase aplicaţii ale acestei abordări %(:'. $n contrast cu drojdiile folosite în industria băuturilor alcoolice, este de dorit să direcţionăm flu#ul de carbon spre glicerol în timpul formării de etanol la drojdiile producătoare de vin, deoarece glicerolul poate îmbunătăţii calitatea vinului, oferindu-i consistenţă.

1.-.(. I"bun$t$ţirea per*or"anţelor procesului entru a îmbunătăţi producţia la nivelul produşilor biotenologici, este foarte important să se utilizeze disciplinele de inginerie genetică, care se ocupă de designul bioreactorului şi optimizarea tenologiilor fermentative, care poate duce la o îmbunătăţire a performanţelor procesului biotenologic, obţinându-se supraproducţii. roblematica dezvoltării unor metode optime, pentru îmbunătăţirea anumitor operaţii ale procesului tenic este legată de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae de îmbunătăţii performanţele procesului. Saccharomyces cerevisiae care

poate suferi o creştere pseudoifală, poate forma

asociaţii floculare, proprietate ce este de obicei atribuită drojdiilor de fermentaţie %(3'. N tulpină de drojdie de bere potrivită ar trebui să fie în stare de a produce floculare, deoarece această proprietate este cea mai convenabilă de a limpezi berea în comparaţie cu celelalte metode convenţionale, cum ar fi filtrarea şi centrifugarea %(E'. +umeroase studii privind flocularea au generat o bază mare de date, dar din nefericire, compararea acestor date este restricţionată, datorită diferenţelor privitoare la condiţiile de 

testare şi de creştere. Două mecanisme de floculare complet diferite au fost observate până acum! fenotipul +eW"lo, găsit în numeroase tulpini de drojdii de bere, şi fenotipul "lo&, găsit în cele mai multe tulpini floculare de laborator.=ele două fenotipuri diferă remarcabil ciar prin felul de a flocula. "enotipul "lo& dă naştere la floculaţie în timpul creşterii, neţinând seama de semnalele pe care le primeşte din mediu, cum ar fi limitarea nutrienţilor, în timp ce flocularea fenotipului +eW"lo se pare a fi lansată la sfârşitul creşterii e#ponenţiale, când îşi face apariţia lipsa de glucoză. >ltima apariţie a floculării la fenotipul +eW"lo este un avantaj evident pentru industria băuturilor, ajutând la separarea drojdiilor de băutură, dar genetica fenotipului +eW"lo rămâne a fi descoperită. Cotuşi o continuare a muncii este necesară pentru a da o imagine completă asupra genelor implicate în fenotipul "lo&, deoarece sunt necesare mai multe cunoştiinţe genetice, decât pentru fenotipul +eW"lo. "enotipul "lo&, conţine una sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiată gena "2N&. *ceasta codifică o proteină a suprafeţei celulare, care joacă rolul principal în procesul de floculare. roteina "lo& este ancorată în peretele celular unde partea + - terminală este e#pusă mediului, iar în timpul floculării acest fragment +-terminal se poate ataşa de manoproteinele din peretele celular vecin. ena "2N& a fost integrată cu succes în genomul unei tulpini de drojdie de bere monofloculară, obţinându-se o tulpină floculară stabilă. "locularea prin fermentare cauzează o micşorare a numărului de celule, mărind timpul general de fermentaţie. ena "2N& din tulpinile cu fenotipul "lo&, pare a fi legată la nivel transcripţional de o creştere în transcrierea "2N&, corelată cu o creştere a floculării. "locularea constitutivă a fost observată în toate stadiile de creştere, dar a fost intensificată în fazele de declin şi în faza staţionară a creşterii. entru a introduce flocularea într-o gazdă nefloculantă ar fi necesar să se stabilească un sistem genetic care să e#prime gena pentru floculare doar spre sfârşitul fermentaţiei. *stfel, ingineria metabolică ar trebui să se concentreze pentru a determina un anumit sistem genetic, care conţine una sau mai multe gene floculare dominante. 5ubiectul mecanismului de control care este responsabil pentru apariţia floculării la limitarea nutrienţilor la tulpinile fenotipului +eW"lo este încă necunoscut %(E, (0'. Deşi, introducerea floculării la drojdiile de bere este o metodă convenabilă de separare a drojdiei din mediu se utilizează încă filtrarea berii care este o etapă tenică importantă în industria de băuturi. rezenţa β - glucanilor în orz, împiedică filtrarea datorită vâscozităţii mărite, /Saccharomyces cerevisiae nu poate idroliza legăturile β &, ale β - glucanilor1 şi de aceea este necesară adăugarea unor enzime comerciale. *lternativ, poate fi introdusă in drojdia de bere o genă eteroloagă care codifică β - gluconaza de +acillus subtilis şi 


Crichoderma yeesei. >ltima opţiune serveşte ca sarcina pentru ingineria metabolică, deoarece substratul este mărit pentru a include şi β - glucanul şi în consecinţă procesul de obţinere a berii poate fi îmbunătăţit. %4'

1.-.. 4"bun$t$ţirea propiet$ţilor celulare >n efort mărit s-a depus pentru a îmbunătăţi propietăţile e#istente ale Saccharomyces cerevisiae, legate de e#ploatarea industrială a acestui organism. 9nteresante în acest sens sunt

cercetările legate de a obţine o reducere a represiei glucozei, folosită în consumul de sucroză şi maltoză, care sunt prezente în amestecurile de zaăr din industrie şi care sunt metabolizate în mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produsă aerobic din melase, care conţin 4A până la <4A sucroză. roducţia de etanol şi produsele de panificaţie sunt procese anaerobe folosite la scară largă, unde Saccharomyces cerevisiae metabolizează amestecurile de zaăr. Malţul folosit pentru producerea de etanol conţine <4 7 :4A maltoză, iar amidonul prezent în aluatul pentru pâine este continuu descompus în oligozaaride prin acţiunea amilazelor %&' Saccharomyces cerevisiae idrolizează e#tracelular sucroza şi intracelular maltoza prin acţiunea invertazei /5uc(1 şi respectiv maltazei /Mal51 / Figura 51. Cransportorul maltozei /MalC1 joacă un rol esenţial în e#primarea genelor M*2, deoarece maltoza este cerută ca un inductor al acestor gene, în contrast cu e#primarea genei 5>=(, care nu are nevoie de inducere. ena M*2 cuprinde, de asemenea, gena M*2G, care codifică o proteină reglatoare responsabilă pentru inducerea genelor M*2C şi M*25.

Figura 5. Metabolismul sucrozei şi maltozei, în concordanţă cu genele respective! 5uc( invertaza, MalC permeaza, Mal5 maltaza, MalG responsabilă de reglarea proteinelor pentru inducerea genei Mal5 şi MalC.

=ând maltoza sau sucroza sunt prezente în mediu împreună cu glucoza, fazele de lag intermitente sunt situate între consumul glucozei şi consumul iniţial de sucroză sau maltoză, <

fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. *cest mecanism reglator poate avea un efect costisitor asupra proceselor menţionate mai sus, datorită timpului destinat procesului de control al glucozei. 5istemul reglator care asigură consumarea glucozei înaintea altor zaaruri a fost studiat mai ales la nivel transcripţional, la nivelul represiei glucozei. Gepresia glucozei, înlesnită de proteina Mig&, controlează e#primarea ambelor gene 5>=( şi M*2. Mecanismul molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig&, este o cascadă reglatorie care poate implica un comple# de proteine ce conţine 5sn:, Cup& şi Mig&, unde Mig& dirijează comple#ul spre un consens specific, spre promotorii genelor ţintă. enele ţintă ale Mig& sunt limitate nu numai de genele ce codifică proteinele implicate în funcţiile periferice ale celulei, cum ar fi gena 5>=(, gena M*2 şi gena *2 /ce codifică proteinele responsabile de utilizarea galactozei1 şi de genele metabolismului central al carbonului %(, '. entru a depăşi represia glucozei e#ercitată de gena 5>=(, deleţia M9& într-o tulpină de laborator aploidă /;4 7 &a1 s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o creştere a e#primării genei 5>=(, ce a fost obţinută atunci când celulele au crescut pe glucoză. $n plus, micşorarea controlului de glucoză a fost observată la creşterea a ( mutante mig& derivate dintr-o altă tulpină de laborator aploidă şi o tulpină poliploidă industrială, respectiv pe amestecurile sucroză 7 glucoză. N altă proteină recent descoperită, Mig(, contribuie de asemenea la controlarea e#primării genei 5>=(. Deleţia adiţională a M9( într-o tulpină mutantă mig& a arătat o depreciere continuă a e#primării genei 5>=(. 5tudiile fiziologice ale deleţiilor tulpinilor mig&mig( au indicat că fărămiţarea lui M9( a condus la o continuare a micşorării controlului glucozei şi o mărire a activităţii respiratoriiF mai mult, s-a obţinut o creştere de &(A a ratei specifice de creştere pe glucoză în comparaţie cu tipul sălbatic. rin urmare, deleţia concomitentă a lui M9& şi M9( s-a dovedit a fi un succes în producţia drojdiilor de panificaţie, deoarece controlul glucozei este micşorat cu succes în metabolismul sucrozei %'. Gata de consumare a glucozei folosită în procesul industrial poate fi mărită fără a apărea efectul =rabtree, iar rata specifică de creştere, care serveşte ca un important parametru în producţia drojdiilor de panificaţie, este mărită prin această abordare. 5trategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor M*2 pentru diminuarea e#tinderii controlului glucozei e#ercitată asupra acestor gene este diferită de strategiile mai sus amintite. Cransferul genei M9& în tulpina aploidă de tip sălbatic )(( a micşorat încet controlul glucozei e#ercitat asupra genelor M*2. Nricum, acest efect nu s-ar fi putut obţine cu mutante mig& derivate din aploida =H+. L&& 7 3D şi tulpina poliploidă industrială D&(.%<' Culpinile mutante mig& derivate din ultimele două tulpini de tip sălbatic au :


început să consume maltoza la niveluri mai scăzute de glucoză, când au fost cultivate în medii comple#e cu glucoză 7 maltoză, în comparaţie cu tipurile parentale. 5-a concluzionat că aceasta se datorează unei inactivări mai puternice a metaboliţilor permeazei maltozei. 5cindări adiţionale ale genei M9( în mutante derivate din tipul sălbatic =H+. L&& 7 3D au arătat un fenotip uşor mai represat decât mutanta mig&. Desfacerea lui M9& /şi M9(1 poate derepresa anumite proteine implicate în semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediază inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arată că inactivarea catabolică a permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de control metabolic indică de asemenea, că permeazele maltozei limitează metabolismul maltozei %:'. $n loc de a ţinti gene reglatoare ca M9& şi M9(, îmbunătăţirea consumului de maltoză din amestecurile glucoză 7 maltoză au fost obţinute prin e#primarea constitutivă a genelor structurale M*2. H#primarea constitutivă a M*2C şi M*25 în mutanta mig& derivată din tipul sălbatic )((, a arătat o utilizare simultană a glucozei şi maltozei. =ând M*2C şi M*25 au fost suprae#primate în tulpina de tip sălbatic, maltoza a fost utilizată în defavoarea glucozei. După cât se poate presupune, suprae#primarea genei M*2C contracarează complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului în transportorul maltozei. $n sprijinul micşorării controlului glucozei, suprae#primarea celor două gene strcturale M*2 a crescut rata specifică de creştere cu 4,4 -& şi la glucoză şi la maltoză, comparativ cu cea a tipului sălbatic %3'. Deci, această strategie pare să fie atractivă pentru micşorarea controlului glucozei în metabolismul maltozei în cazul drojdiilor de fermentaţie, ceea ce reduce timpul de producere a etanolului. =ontrolul redus al glucozei arată, de asemenea, un timp redus al procesului de producere a pâinii, care este mai departe micşorat deoarece aluatul poate creşte şi mai repede, ca rezultat al măririi ratei specifice de creştere. Deleţia genelor ce codifică proteinele represoare de transcripţie sau suprae#primarea genelor ce codifică activatorii transcripţionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru ingineria metabolică, în anumite sisteme metabolice. *ceastă strategie poate rezulta din suprae#primarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripţional implicând proteina represoare de deleţie sau proteina represoare. $n anumite cazuri această abordare va fi favorabilă în comparaţie cu suprae#primarea genelor ce codifică unele sau toate enzimele unei anumite căi metabolice %(('.

1.. !roducerea de proteine heteroloage 3

De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca şi a importantei capacităţii acestei drojdii de a e#prima gene străine în combinaţie cu aparatul ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazdă atractiv pentru producerea de anumite proteine eterogene. +umeroase proteine eterogene care au fost folosite în scopul de a diagnostica sau ca agenţi terapeutici umani şi vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae. 9nterferonul uman a fost prima proteină recombinantă produsă de Saccharomyces cerevisiae în

&0E&, iar în anul următor a fost produs primul vaccin obţinut prin intermediul

ingineriei genetice %E'. roducţia industrială de insulină de către Saccharomyces cerevisiae, acoperă aproape jumătate din nevoia de insulină a &< de milioane de diabetici din întrega lume %0'. $n ultimii ani secreţia de insulină a Saccharomyces cerevisiae a fost îmbunătăţită prin ingineria proteinelor secvenţei leader, iar de îmbunătăţirile realizate va beneficia nu numai farmaciile şi diabeticii, ci şi potenţialul de organism-gazdă al Saccharomyces cerevisiae pentru producerea, de alte

proteine eterogene.

Saccharomyces cerevisiae are

o cale secretorie multiplă şi este capabilă de a produce

modificări posttranslaţionale ale proteinelor eterogene, cum ar fi maturarea proteolitică a proormonilor şi formarea legăturilor bisulfidice.%4' *ceste trăsături se aseamănă cu cele ale celulelor mamiferelor, iar unele proteine ale mamiferelor active biologic pot fi e#primate prin urmare cu succes şi secretate de Saccharomyces cerevisiae. $n plus, transformarea Saccharomyces cerevisiae cu *D+ străin şi binescunocuta tenologie de fermentare a acestui

organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazdă bună pentru producerea de proteine eteroloage. =u toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezintă unele dezavantaje, când este folosită pentru producerea unor anumite proteine recombinante eterogene. *stfel de probleme au fost observate ca rezultat al instabilităţii plasmidiale ducând la iperglicozilarea proteinelor eterogene secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. entru a depăşi astfel de modulări nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite ca organisme gazdă %&, ('. =elulele aploide de împerecere de tip α ale Saccharomyces cerevisiae, secretă feromonul factor - α, printr-o combinare eficientă a celulelor aploide a şi α. "actorul - α al Saccharomyces cerevisiae

prepro 7 leader este cel mai folosit ca sistem de e#primare

secretorie pentru proteinele eterogene în numeroase şi diferite tulpini, incluzând şi Saccharomyces cerevisiae.

"uziunea între secvenţa prepro 7 leader cu o genă eterogenă,

permite ca Saccharomyces cerevisiae să secrete proteine eterogene, deoarece secvenţa leader E


mediază translocarea cotranslaţională / Figura 161 a fuziunii proteinei în eucariote %3'. reregiunea secvenţei leader este separată de o peptidază 7 semnal, iar în aparatul olgi endoproteaza Le#( separă preregiune în partea =-terminală a maturării dibazice Le#(. $nainte de secreţie, peptida spaţiatoare a maturării Le#( de la e#tremitatea =-terminală este înlăturată prin acţiunea dipeptidil 7 aminopeptidazei, codificată de gena 5CH& şi proteina eterogenă este eliberată în mediul e#tracelular %'. De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a îmbunătăţi secreţia de insulină prin folosirea factorului α prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaeF întregul α - factor prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile iniţiale în secreţia de insulină cu o peptidă spaţiatoare având o secvenţă lu 7 *la 7 lu 7 *la, care rezultă prin fuziunea proteinelor arătate în "igura &4 %'.

Figura 16. 9lustrarea unui α factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

$n acest studiu, peptida spaţiatoare a fost îndepărtată cu greu de dipeptidil 7 aminopeptidaza, obţinându-se în principal un precursor al insulinei lu 7 *la 7 lu 7 *la, deci spaţiatorul a fost îndepărtat prin mutageneza directă asupra locului. *ceastă modificare a factorului α al secvenţei leader a relevat cu succes e#primarea şi secreţia a numeroşi precursori insulinici. *lte studii au arătat avantajul unui spaţiator, deoarece poate fi atinsă o îmbunătăţire a procesării Le#(p, ceea ce în cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficientă a Le#(, poate cauza o iperglicozilare şi o depreciere a producţiei de insulină. =ând spaţiatorii potriviţi şi creaţi în aşa fel încât să poată fi îndepărtaţi de tripsină sau de *chromobacter lyticusce cu o protează specifică 26s&, au fost introduşi între Le#( dibazic şi precursorul insulinic, producţia de precursor al insulinei a fost îmbunătăţită. rezenţa unui spaţiator nu numai că s-a dovedit a fi un succes pentru secreţia secvenţei leader a factorului α fuzionată cu precursorul insulinei, dar şi glicozilaza + 7 lincată a celor două părţi a αfactorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joacă un rol de 0

pivot în procesul de secreţie, deoarece lipsa acestor două glicozilaze micşorează semnificativ secreţia precursorului insulinei %<'. N altă e#primare a fost recent demonstrată la Saccharomyces cerevisiae sub designul secvenţelor prepro 7 leader obţinute prin combinarea unei abordări raţionale şi a unei optimizări treptate %:'. Dacă liderii sintetici au fost folosiţi într-un conte#t spaţiator potrivit, producţia de precursor de insulină a depăşit producţia obţinută cu α - factori prepro 7 leaderi, şi mai departe liderii sintetici au facilitat secreţia nu numai a insulinei, dar şi a altor proteine eterogene %:'. H#perimentele pulsatorii au arătat un timp de transmisie prelungit al liderului sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Hucariote cu fuziunea proteinelor ce conţin α - factor prepro 7 leader, fapt ce oferă o e#tindere a timpului pentru împacetarea corectă a precursorului insulinei şi deci producţie mărită. =ând prepro 7 leaderii sintetici lipsesc din glicozilaza + 7 lincată, părţile fuzionează cu proteina precursoare a insulinei obţinându-se o producţie mai mare a precursorului de insulină împacetat corect în comparaţie cu cea obţinută datorită secvenţelor leader cu α - factori. Cotuşi, lipsa de legături + 7 glicozilate ale prepro 7 leaderilor, nu a avut un impact asupra capacităţii de secreţie, ceea ce contrastează cu ceea ce a fost pentru prepro 7 leaderii α - factori, după cum s-a menţionat mai sus %3'. $nlocuirea părţii de maturare Le#(, cu o altă parte procesată enzimatic, aparţinând prepro 7 leaderilor cu legăturile + 7 glicozilază lipsă, a dus la o secreţie a precursorului insulinei neprocesat, iar acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultură şi maturat in vitro prin adăugarea de l6s6l 7 protează specifică produsă de *chromobacter lyticus %3'. $nlocuirea situsului de maturare Le#( cu un alt situs proteolitic

poate fi potrivită

pentru secretarea de proteine eterogene, ce au secvenţa de maturare Le#( în structura lor, deoarece o anume proteină poate fi scindată de endoproteaza Le#(, ceea ce cauzează o descreştere a producţiei de proteine eterogene. Deci, prin alegerea unei enzime proteolitice a cărei secvenţă de procesare nu este prezentă în proteina eterogenă de interes, această proteină poate fi secretată ca o proteină de fuziune neprelucrată într-o tulpină mutantă 8e#( şi treptat maturarea se poate induce in vitro. $n continuare, secreţia unei proteine eterogene neprelucrate ce are un pro 7 leader sintetic poate fi comparată avantajos cu secreţia unei proteine eterogene prelucrate, deoarece acest pro 7 leader induce o stabilitate şi o solubilitate a proteinei de fuziune, ceea ce este de preferat înainte de începerea purificării şi maturării proteinei de fuziune. +oua descoperire a secvenţei sintetice prepro 7 leader s-a demonstrat a fi o pârgie e#trem de puternică pentru e#primarea şi secreţia de insulină, iar aceste secvenţe 4


leader pot activa e#primarea şi secreţia proteinelor eterogene, ceea ce nu este posibil cu factorul α - prepro 7 leader folosit în mod tradiţional. =onceptele descrise mai sus relatează câteva e#emple de obţinere de tulpini de Saccharomyces cerevisiae

cu propietăţi noi sau îmbunătăţite prin inginerie genetică şi

metabolică. 9deea de bază în utilizările tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a satisface din ce în ce mai multe scopuri biotenologice. Deoarece secvenţa completă genomică a drojdiei este cunoscută, scimbările genetice ţintă sunt mai uşor de obţinut prin tenologia *D+ recombinant, ceea ce facilitează şi accelerează studiile de inginerie metabolică.. Cotuşi, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funcţiilor ei metabolice poate limita anumite abordări ale metabolismului ingineresc, acest microorganism are cu siguranţă un potenţial mărit pentru căile energetice. >n număr de noi aplicaţii bazate pe Saccharomyces cerevisiae

vor apărea în viitor, iar acestea, împreună cu e#emplele

menţionate, vor ilustra clar potenţialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabrică celulară în procesele biotenologice.

7ibliogra*ie 1. 5pencer, 9., 5pencer, D., easts -echnology , 5pringer @erlag, )erlin eidelberg +eW Ior8, -:<, /&001. . ;al8er, M. ., east #hysiology and +iotechnology, ;ile6 9. and 5ons, (:-&0, /&0EE1. (. )err6, D. G., Gussell, 9. and 5teWard . ., east +iotechnology, *llen and >nWin, 2ondon, /&0E31. . innen, *., )u#ton, "., =anduri, )., ein, 9., ottinger, C., Me6ac8, )., olig, ., .ene expression in recombinant micro/organism, *. 5mit, Marcel De88er 9nc., +eW Ior8, &(&-&0, /&00<1. -. iper, .;., Lir8, +., .enetically !ngineered #roteins and !nzymes from yeasts, roduction =ontrol, *. ;iseman, Hllis orWord, 2eicester, >L, &3-&E0, /&00&1. . "aber, L. +., order, ;., *b. ., @ecnuis, M., east , 11, &&-&, /&00<1. 2. )ra8e, *. 9., east .enetic !ngineering , . V. )arr, *. V. )ra8e and . @alenzuela, )utterWarts, )oston, (:0-(E4, /&0E01. 3. H#art, M. G., )ussineau, =. M., )urrent opinion in +iotechnology, 2, <(<-<4, /&00:1. 5. ilt, ;., ;olf, D. ., &olecular &icrobiology, , (3-((, /&00(1. 16. ;olf, L., onconventional easts in +iotechnology , 5pringer @erlag, )erlin eidelberg +eW Ior8, /&00:1. 11. 2odder, V., -he easts, +ort olland ubl. =o, amsterdam, /&0341. 1. rillinger, ., NberWin8ler, "., >mile, =., )auer, G., .en *ppl &icrobiol , (5, &-, /&001. 1(. Lutzman, =. ., ðods !nzymol , , <-E, /&001. 1. 2utti8, M. *. ., Nver8amp, ., 1 +iol)hem, 2(, (<(0-(<, /&00E1. 1-. 5tepanopoulos, ., *ristodon, *., +ielsen, V., &etabolic engineering , academic ress, 9nc. 5an Diego, =alif., /&00E1. 1. 2indQuist, ., &olecular #sychiatry, 1, 3:-30, /&00:1. &

Drojdiile.pdf

Recommend Documents