Sara Zapata García Manuela Zapata López Carolina Cartagena Durango
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
PALABRAS CLAVES Bacterias aerobias, microorganismos, medios de cultivo, métodos de inoculación.
RESUMEN Las bacterias están presentes en los diferentes ecosistemas, pero para su crecimiento requieren de condiciones óptimas las cuales les permitan vivir. En esta práctica se llevó a cabo el cultivo y el aislamiento de diferentes bacterias, para ello se empleó distintos medios de cultivo cada uno de ellos con propiedades desiguales, por otra parte para llevar a fin dicha siembra se realizaron diferentes métodos de cultivo. Todo esto se realizó con la finalidad de identificar las particularidades de crecimiento de algunos microorganismos dependiendo del medio de cultivo, los medios de cultivo se dividen dependiendo del propósito, en este caso era para observar que bacterias pueden crecer en los diferentes agares. Se contempló el desarrollo de E. Coli el agar nutritivo sembrado con el método francés. En el agar eosina azul de metileno el cual es un agar selectivo crecieron S. Aureus y E. Coli pero no germinó la bacteria B. Cereus. Por otra parte en el agar manitol sal solo se observó la proliferación de S. Cilius pero no se desarrollaron B. Cereus ni E. Coli. En comparación con los otros medios de
cultivo en el agar sangre crecieron las tres bacterias S. Aureus, B. Cereus y E. Coli.
MARCO TEORICO Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que pueda confundirse morfológicamente es necesario usar medios de cultivos, ya que nos permiten diferenciar las características del crecimiento de las bacterias y establecer su identidad según el medio de cultivo que se use. 1 Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales como el agua, el suelo, aire, el hombre y otros seres vivos, alimentos, entre otros. Haciendo parte de los diferentes ecosistemas. Por esto se deben usar los medios de cultivo adecuados que se asemejen al ambiente si queremos posibilitar el crecimiento de la bacteria. 1 Un medio de cultivo está diseñado para posibilitar el desarrollo y nutrición de las bacterias por esto cuenta con una cantidad de sustancias como: carbono, agua, azufre, fosforo, nitrógeno, potasio, sodio, magnesio, entre otros. También su crecimiento depende de muchos factores entre ellos: un pH preferiblemente neutro, humedad, oxigeno, temperatura, presión osmótica, todo esto en condiciones adecuadas. 2 Los medios de cultivo se clasifican dependiendo de las características que se necesiten para su óptimo desarrollo los cuales según su consistencia pueden ser:
Líquidos: no contienen agar y favorecen el crecimiento bacteriano ya que las bacterias poseen una gran libertad de movimiento y al difundirse por todo el medio encuentran su componente nutritivo y requerimiento de oxigeno más óptimo con gran facilidad, por ejemplo: las aerobias estrictas crecen en los primeros 10-15mm de la superficie del medio, las microaerofilas ligeramente por la superficie del medio, las anaerobias estrictas en los 10-20mm del fondo y las facultativas por todo el medio. Solidos: su concentración de agar es de 1.5% a 2%, en estos las bacterias crecen con mayor dificultad, ya que los nutrientes pueden agotarse fácilmente, se utilizan para ver colonias, aislar microorganismos, características de crecimiento, color, tamaño, taxonomía, entre otros. semi-solido: su concentración de agar es de 0.5% y se utiliza para estudiar el movimiento y algunas propiedades bioquímicas. 2
También según su aplicación se usa:
Simples: son apropiados para la mayoría de microorganismos ya que poseen requisitos nutricionales mínimos para desarrollarse. Enriquecidos: permiten el crecimiento de bacterias difíciles de cultivar, puesto que se añade ciertos componentes muy ricos en nutrientes. Selectivos: estos medios contienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias cuyo crecimiento no interesa, permitiendo así aislar una determinada especie. Diferenciales: en este se les adiciona sustancias para el crecimiento de determinadas bacterias y al actuar sobre dichas sustancias adquieren un color que las diferencia de otras colonias. Enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen la multiplicación de bacterias cuando la muestra obtenida es pobre. 2
De acuerdo con su aplicación los componentes usuales de los medios de cultivo son:
Extracto de carne: constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales orgánicas y otros nutrientes. Peptonas: son proteínas degradadas, ricas en nitrógeno y carbono. Cloruro de sodio: importante para proporcionar un adecuado equilibrio osmótico. Tampones estabilizadores del pH: necesarios para contrarrestar las variaciones del pH debido a los productos del metabolismo bacteriano. 2
Nutrientes para medios de enriquecimiento:
Extracto de levadura: rico en vitaminas del complejo B, proteínas y ácidos nucleicos.
Extracto de glóbulos rojos: suministra los factores X (hemina) y V (difosfopiridin-adenin-nucleotido o coenzima I) imprescindibles para el crecimiento bacteriano de algunos microorganismo. Infusión de hígado o corazón y cerebro: son infusiones ricas en aminoácidos azufrados que reducen el potencial de óxido reducción. 2
Agentes reductores: Se adicionan tioglicolato sódico, cisteína, ácido ascórbico a los medios de cultivo para promover la anaerobiosis. 2
Agentes selectivos:
Colorantes: el cristal violeta, azul de metileno, el verde brillante y otras
sustancias usadas por su efecto toxico sobre las Gram positivas. Cloruro sódico a altas concentraciones. Bilis o Sales biliares Antibióticos Cicloheximida o actidiona: se añade para impedir el crecimiento de hongos ambientales en los medios de cultivo. 2
Azucares: Se puede adicionar para fines nutritivos o para investigar la actividad metabólica.
2
Indicadores de pH: Es esencial para detectar variaciones en la acidez o alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Los medios de cultivo usados en el laboratorio fueron:
Agar nutritivo: está compuesto de extracto de carne, peptona, ClNa, agar y agua destilada. Se usa como medio de cultivo general para la mayor parte de los microorganismos y como base para la preparación de medios selectivos y enriquecidos. 2 Agar sangre: compuesto por extracto de carne, peptona, ClNa, sangre, agra y agua destilada. Lleva como base el agar nutritivo y se le adiciona sangre desfibrinada en una porción del 5-10%, principalmente sangre de conejo, carnero y caballo ya que ofrecen buenas reacciones hemolíticas. No se usa sangre humana procedente de banco puesto que contiene citrato que puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos y glucosa que falsea las reacciones de hemolisis, aparte de anticuerpos y agentes antimicrobianos. Aquí crecen la mayoría de bacterias patógenas y algunas levaduras. Este medio es adecuado para el cultivo y aislamiento de microorganismos exigentes, también para estudiar la actividad hemolica. 2 La hemolisis puede ser de 3 tipos: α hemolisis: clarificación parcial de la sangre en una colonia, que produce un cambio de color gris verdoso o pardusco en el medio; β hemolisis: zona de clarificación completa de la sangre alrededor de las colonias debido una lisis completa de eritrocitos que produce una eliminación de la sangre del medio debajo de las colonias y a su alrededor; γ hemolisis: sin lisis o camb io de color en los eritrocitos. 3 Agar MacConkey: está compuesto por peptona, lactosa, ClNa, sales biliares, cristal violeta, rojo neutro, agar y agua destilada. Los medios usados para el
aislamiento selectivo de enterobacterias se caracterizan por contener lactosa y un indicador de cambio de pH que detecta la actividad fermentadora sobre este azúcar. Además estos medios de cultivos llevan sustancias inhibidoras de Gram positivos. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como inhibidores. El indicador vira a rojo ladrillo en medio acido. Las bacterias que fermentan la lactosa producen colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una zona opaca debida a la precipitación de sales biliares; las no fermentadoras dan colonias incoloras más o menos transparentes. 2 Agar EMB (Eosina azul de metileno): compuesto por peptona, fosfato dipotásico, lactosa, eosina azul de metileno, agar y agua destilada. Su uso es prácticamente el mismo del agar MacConkey. El azul de metileno actúa como indicador e inhibidor al mismo tiempo. Las colonias fermentadoras de lactosa presentan un tono violeta más o menos intenso. Por ejemplo Escherichia Coli origina colonias muy oscuras, frecuentemente con brillo verde metálico que facilita su detección en aguas contaminadas con materias fecales. 2 Agar AMS (Manitol sal): es un medio de cultivo altamente selectivo, pues tiene una alta concentración de cloruro de sodio que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias, sin embargo tolera los estafilococos. Además el cultivo contiene manitol como único carbohidrato y rojo fenol como indicador del pH, cuyo ámbito de viraje esta entre pH 8,4 (rojo) y pH 6,8 (amarillo). Cuando hay producción de ácido a causa de la fermentación de manitol, las colonias aparecen rodeadas de un halo amarillo; el medio permanecerá sin cambio de color o acentuara a rojo medio si las bacterias no fermentan el manitol. 4 Caldo nutritivo: es un medio líquido compuesto por una infusión de carne, ClNa, peptona, extracto de levadura y también fosfato disódico. Es usado como base para otros caldos que puedan contener más nutrientes. 5
METODOLOGÍA Para este laboratorio se utilizaron cepas de Gram positivas y cepas de Gram negativas, se implementaron medios de cultivo como lo fue el agar nutritivo que es en medio simple, el caldo nutritivo, el agar EMB que es un medio selectivo, también el agar AS que es un medio enriquecido, el agar AMS que es un medio diferencial y otros materiales como mecheros, asas y agujas de inoculación, cinta de enmascarar.
Se realizó el procedimiento en 3 tipos de cultivo, en cultivo en placa de agar, en cultivo en agar inclinado y cultivo en caldo nutritivo. En el cultivo en placa de agar se utilizan varios métodos de siembra por estrías en superficie entre las cuales tenemos el francés y el clásico de los cuales teníamos como objetivo conseguir colonias separadas para lograr un mejor análisis En el método francés flameamos el asa y tomamos la muestra de E. coli y la pusimos en la caja de petri con el inoculo extendiendo el cultivo haciendo líneas paralelas, después flameamos de nuevo el asa e hicimos otras líneas paralelas de forma vertical y después volvimos a flamear e hicimos las líneas de forma horizontal hasta que cubrir toda al caja.
En el método clásico utilizamos barias cepas por lo cual marcamos en la cinta de enmascarar los nombres de dichas bacterias, en el cual también se utilizó un asa flameado pero a diferencia del anterior este se esparcía por la caja de petri en forma de zig-zag hasta cubrirla. En el cultivo de agar inclinado lo primero que hicimos fue rotular los tubos y ponerles los datos necesarios para la observación que se hizo al día siguiente. Luego de flamear el asa se tomó una muestra del cultivo teniendo cuidado en el remover el tapón y mantenerlo en la zona estéril ya luego se tomó el tubo en el que se iba a inocular el cual se flameo la boca para introducir la porción de cultivo haciendo una estría en la superficie en línea recta. Ya para terminar se flamearon las asas. Esquema 1
Esquema 1
Esquema 2
En el cultivo en caldo nutritivo realizamos los mismos pasos del anterior pero en este caso la muestra de cultivo la sumergimos y la agitamos con el asa ene l medio líquido Esquema 2.
RESULTADOS Y DISCUSION
1. CULTIVO EN CAJA PETRI DE AGAR NUTRITIVO METODO: Francés BACTERIA: Sherichia coli CONSITENCIA: Solido
El agar nutritivo es un medio de cultivo simple utilizado para propósitos generales como para el aislamiento y recuento de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. 6 Se aconseja como medio de cultivo general para la mayor parte de los microorganismos y como base para la preparación de otros medios 7 enriquecidos y selectivos. El método utilizado fue el francés. En la imagen 1 se pueden observar algunas colonias separadas. El crecimiento de la Scherichia coli , se puede decir fue porque este cultivo no es selectivo por tanto la mayoría de las bacterias crecen en él. La bacteria cultivada presento las siguientes características:
Forma
Puntiforme
Color
Blanco Transparentoso
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Forma
Circular
Color
Blanco Transparentoso
Borde
Entero
Elevación
Convexa
2. CULTIVO EN AGAR-SANGRE Método: Clásico Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus. Imagen 2 En el agar sangre crecen la mayoría de bacterias y levaduras, ya que es un medio enriquecido de nutrientes que se usa principalmente para microorganismos exigentes. 8 Como se observa en la imagen 2 las bacterias Staphylococcus aurerus, Bacillus cereus y Scherichia coli, sembradas en este cultivo formaron colonias. S t a p h y l o c o c c u s au r e r u s
Se observaron colonias grandes con las siguientes características:
Forma
Ameboide
Color
Amarillo opaco
Borde
Ondulado
Elevación
Convexa
Es una colonia Beta hemolítica, porque se puede observar un halo transparente alrededor de la colonia. Tanto la S. aureus y B. cereus son colonias B-hemoliticas, pues poseen enzimas
llamadas hemolisinas que hacen lisis de los globulos rojos. 8 Scherichia coli
La colonia de Scherichia coli presentó las siguientes características:
Forma
Puntiforme
Forma
Circular
Color
Gris apagado
Color
Gris apagado
Borde
Entero
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Elevación
Convexa
Es una colonia gamma hemolítica porque la E. coli no es capaz de realizar hemolisis. 9
3. CULTIVO EN AGAR EMB (EOSINA AZUL DE METILENO) Método: Clásico Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus. Imagen 3 Scherichia coli
Esta bacteria en agar EMB presenta un brillo verde con negro producido por miembros que fermentan ávidamente lactosa. La colonia de Scherichia coli presentó las siguientes características:
Forma
Puntiforme
Forma
Circular
Color
Verde brillante
Color
Verde brillante
Borde
Entero
Borde
Entero
Elevación
Convexa
Elevación
Convexa
Las bacterias Staphylococcus aureus y Bacillus cereus no muestran crecimiento, porque son bacterias Gram positivas, y en este medio de cultivo solo crecen bacterias Gram negativas. 9 4.
CULTIVO EN AGAR MANITOL SAL
Método: Clásico Bacterias: Scherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.
Imagen 4 Ninguna bacteria mostro crecimiento. (Imagen 4) La S. aureus es una bacteria capaz de crecer en este medio pues los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal y la S. aureus posee coagulasa que fermenta el manitol y se visualiza como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Pero en este cultivo no crecio, se concluye que fue por falta de tiempo ya que La American Public Health Association (A.P.H.A) recomienda la incubación durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis. 10
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