PRÁCTICAS DE ECOLOGÍA MICROBIANA - 2010
Alberto Fonte Polo
COLUMNA DE WINOGRADSKY La columna de Winogradsky es un sistema acuático en el que se ayuda a los microorganismos a establecerse en regiones diferenciadas según su metabolismo, y constituye un modelo de ecosistema, similar a los tapetes microbianos que se hallan en aguas dulces o saladas, donde proliferan microorganismos del medio acuático y de los sedimentos. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el microbiólogo ruso Sergei Winogradsky (1856-1953), quien usó la columna para estudiar los microorganismos del suelo. La columna de Winogradsky es un sistema que permite observar en el laboratorio el proceso evolutivo de los microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los diferentes ambientes empleando diferentes estrategias para la obtención de energía. Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se desarrollará una sucesión de comunidades bacterianas interrelacionadas metabólicamente, de un modo similar a lo que ocurre en la naturaleza, que se podrán observar fácilmente por su distinta coloración. Además, la columna es un sistema anóxico en miniatura que puede usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento. Para la realización de esta práctica se usará agua estancada procedente de un lago, de un estanque, de una acequia o de un río, aunque también podría usase agua de mar si se quisiera prepara una columna marina. Y se estudiará el ciclo del azufre, n o obstante podría enfocarse la práctica para otros ciclos biogeoquímicos equivalentes (nitrógeno, carbono u otros elementos).
Materiales y procedimiento para la construcción de la columna de Winogradsky 1. Se usa una columna grande de cristal (una probeta de 100 ml) o de plástico transparente (una botella). 2. Se añade una fuente de carbono y energía para la cadena trófica microbiana, en este caso es celulosa, que puede administrarse en forma de tiras de papel de filtro o de periódico, hierba, serrín, etc. Es importante que la celulosa permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no en la zona superficial, ya que las bacterias que degradan la celulosa son anaeróbicas. Deben evitarse los sustratos fácilmente fermentables, que pueden producir una formación excesiva de gas. 3. Se llena la columna con lodo, de una charca o del fondo de un río, ricos en materia orgánica, hasta 1/3 de su volumen. 4. Se añade a la mezcla una fuente de sulfato (sulfato de calcio, CaSO 4, o yeso) y un agente tamponador del pH (carbonato cálcico, CaCO 3). El lodo también puede mezclarse con el contenido de un huevo, como fuente de azufre. Se 1
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añade también bicarbonato sódico (NaHCO 3), cloruro de amonio (NH 4Cl) y tampón fosfato pH 7,3. La mezcla se compacta para forzar la salida de las burbujas de aire, hasta obtener una capa de unos 10 cm. Se añade agua, de la propia charca o río donde se haya recogido el fango, hasta rellenar casi completamente completamente la columna (hay que dejar con aire unos 5 cm de la misma). Si no se dispone de suficiente agua de río, se puede terminar de rellenar la columna con agua corriente. Se tapa la columna, con parafina o con papel de aluminio, para evitar la evaporación. Se coloca cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada, y se deja durante varias semanas. Se examinará la columna periódicamente, anotando los cambios de color y grosor de las diferentes capas (Fig. 1). Y se tomarán muestras de las capas para estudiar los diferentes tipos de microorganismos.
Figura 1. Columna de Winogradsky después de un mes (izquierda), dos meses (centro) y tres meses (derecha). La estratificación se hace cada vez más evidente.
Microorganismos de la columna de Winogradsky
Una vez establecida la columna, se pueden diferenciar tres zonas características en base a su concentración relativa de oxígeno: 1) zona aeróbica, es la más superficial, dispone de una alta concentración de oxígeno; 2) zona microaerófila, inmediatamente debajo de la anterior, con una menor concentración de oxígeno; 3) zona anaeróbica, que constituye el lecho de lodo (Fig. 2). Las algas y cianobacterias forman una capa superficial de color verde brillante, y al producir oxígeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona superior de la columna. Mientras que, en el fondo de la columna, las bacterias reductoras del sulfato producen sulfuro, que provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre (fotótrofos anoxigénicos). De modo que se establecen dos gradientes en la columna, uno de oxígeno y otro de sulfuro de hidrógeno (H 2S). 2
Las bacterias quimiorganotrofas crecen a lo largo de toda la columna, los microorganismos aerobios y microaerófilos en la parte superior, los anaerobios en las zonas donde hay sulfuro de hidrógeno. Luz solar
O2 Zona aerobia
O2 Algas y cianobacterias
Zona microaerófila s e s a g e d a v i t a l e r n ó i c a r t n e c n o C
Bacterias oxidadoras del azufre aerobias Beggiatoa, Thiobacillus, Thiothrix
Bacterias rojas no del azufre Rhodospirillum, Rhodopseudomonas
a u g a e d a n m u l o C
Bacterias rojas del azufre Chromatium
Zona anaerobia
H2S Bacterias verdes del azufre Chlorobium
o d o L
Bacterias reductoras del sulfato Desulfovibrio
2 – SO4
Bacterias fermentadoras de celulosa Clostridium
H2S
Bacterias metanogénicas y quimiolitotrofos del azufre. Figura 2. Esquema de una columna de Winogradsky típica.
Al cabo de cuatro o seis semanas comenzarán a observarán una serie de comunidades microbianas en la columna, que de arriba abajo son (Figs. 2 y 3):
Zona aeróbica: esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre. El agua de la parte superior de la columna contiene abundantes poblaciones de microorganismos aerobios, que aparecen normalmente en hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos, arroyos, etc.). Suelen ser microorganismos flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en nuevas áreas, así como microorganismos fotosintéticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxígeno que producen estos productores primarios difunde desde la superficie, creando condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes.
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Zona microaerófila: es la zona en la que solapan ambos gradientes, el de oxígeno y el de sulfuro de hidrógeno. Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa, Thiothrix o Thiobacillus, que usan como fuente de carbono la materia orgánica, y oxidan el H 2S que llega por difusión desde las capas inferiores a azufre elemental. La reacción química que se lleva a cabo es la 0 siguiente (reacción de Bunsen): O 2 + H2S → H20 + S . Son, por lo tanto, microorganismos mixótrofos. mixótrofos. Estos géneros acumulan gránulos gránulos de azufre en sus citoplasmas por oxidación del H 2S. Si se deja evolucionar el sistema, cuando la concentración de H 2S es muy baja, los gránulos de azufre elemental intracitoplasmático presentes en estas bacterias empiezan a desaparecer por 0 2 – oxidación total a sulfato (H 2S → S → SO4 ). Zona anaeróbica: esta zona contiene H 2S (procedente del fondo), en la zona anaeróbica superior predominan las bacterias fotosintéticas anaerobias, y en la columna se observan una serie de bandas de colores rojo y verde: Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium o o Rhodopseudomonas, son bacterias anaerobias fotoorganótrofas, que sólo pueden realizar la fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico. Forman una capa de color rojo-anaranjado. Las bacterias verdes no del azufre son termófilas y, por lo tanto, no crecen en la columna a temperatura ambiente. o Bacterias rojas del azufre ( Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa de color rojo-púrpura) y bacterias verdes del azufre (Chlorobium, Pelodyctium). Estas bacterias son fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica, no producen oxígeno ya que no utilizan H2O como elemento reductor sino H 2S, generando en este proceso 2 – sulfatos (SO4 ). La reacción que tiene lugar es la siguiente: 2 H 2S + CO2 0 → [CH2O] + H2O + 2 S . Estos microorganismos aparecen como zonas de crecimiento en el lodo de la columna, pero también pueden desarrollarse en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos.
En la zona anaerobia más profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiración anaeróbica y fermentación. Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter , o Desulfotomaculum o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H 2S en el proceso. La reacción de reducción bacteriana – 2 – + del sulfato es la siguiente: SO 4 + 8 H → H2S + 2 H2O + 2 OH . Este H2S reaccionará con el hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II), que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos acuáticos son frecuentemente negros. La reacción sería la siguiente: 2 –
SO4 (ión sulfato)
H2S (sulfuro de hidrógeno) 2+ Fe SFe (Sulfuro de hierro) → Precipitado negro 4
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Sin embargo, no todo el H 2S reacciona con el hierro (II), parte de éste difunde hacia arriba a lo largo de la columna de sedimentos y es utilizado por las bacterias verdes y rojas del azufre que crecen en las zonas superiores. Bacterias fermentadoras: utilizan la celulosa del papel aportado como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium. Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxígeno desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa hasta residuos de glucosa y, a continuación, fermentan la glucosa para obtener la energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, etc.) como productos finales de esa fermentación. Estos compuestos orgánicos serán, a su vez, respirados por las bacterias reductoras del sulfato. Cuando la celulosa se agote, usarán la materia orgánica producida por el resto de bacterias. También pueden aparecer bacterias metanogénicas que generan CH 4, que se observa como burbujas de gas en el fondo de la columna.
Figura 3. Esquema de los algunos microorganismos característicos de la columna de Winogradsky.
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Para el estudio de las bacterias de la columna de Winogradsky, se puede introducir una pipeta larga para recoger una pequeña muestra de lodo o agua, que puede ser usada en microscopía y para inocular medios de cultivo de enriquecimiento para aislamiento y caracterización. caracterización.
Bibliografía:
Brock Biología de los microorganismos . 10ª edición (2003). J. Parker, J.M. Martinko, M.T. Madigan. Pearson Education. Manual Práctico de Microbiología. 3ª edición (2005). R. Díaz, C. Gamazo, I. López-Goñi. Elsevier-Masson. http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html (Figura 3).
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