CURSO: ANÁLISIS DE PAI
Conjunto de biomoléculas compuestas principalmente por Carbono, Hidrógeno. Y Oxígeno y en menor grado Fósforo, Azufre y Nitrógeno. Son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos (benceno, cloroformo, éter, hexano, etc) Posee una estructura polar y apolar en gran mayoría. 2
La parte polar es hidrofílica (hidroxilo – OH, carboxilo –COO-, Fosfatos –PO4-)
La parte apolar es hidrofóbica (C-H, CParte hidrofílica C)
Parte hidrofóbica 3
Dependiendo si poseen ácidos grasos o no:
Saponificables: poseen ácidos grasos
Insaponificables: no poseen ácidos grasos 4
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Unidades básicas de los lípidos saponificables, y consisten en moléculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada con un número par de átomos de carbono (12-24) y un grupo carboxilo terminal. La presencia de dobles enlaces en el ácido graso reduce el punto de fusión. Los ácidos grasos pueden ser saturados e insaturados. 6
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Carácter anfipático: Ya que el ácido graso esta formado por un grupo carboxilo y una cadena hidrocarbonada, esta última es la que posee la característica hidrófoba; siendo responsable de su insolubilidad en agua. Punto de fusión: Depende de la longitud de la cadena y de su número de insaturaciones, siendo los ácidos grasos insaturados los que requieren de menor energía para fundirse. 9
Esterificación: Los ácidos grasos pueden formar ésteres con grupos alcohol de otras moléculas. Saponificación: Por hidrólisis alcalina los ésteres formados anteriormente dan lugar a jabones (sal de ácido graso). Autooxidación: Los ácidos grasos insaturados pueden oxidarse espontáneamente, dando como resultado aldehidos donde existían los dobles enlaces covalentes.
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Llamados también gliceroles, son ésteres de ácidos grasos con glicerol (glicerina), formados por esterificación. Existen 3 tipos de glicéridos: Monoglicéridos: un ác. graso unido a la molécula de glicerina Diacilglicéridos: dos ác. Grasos se unen a una molécula de glicerina Triacilglicéridos: una glicerina y 3 ác. grasos.
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Reserva energética
Función estructural
Función reguladora, hormonal o de comunicación celular
Función transportadora
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Pueden producir compuestos volátiles que imparten olores y sabores desagradables, debido a que el enlace éster de los acilgliceridos es susceptible a la hidrólisis química y enzimática, y a que los ácidos grasos insaturados son sensibles a reacciones de oxidación. 15
El grado de deterioro depende del tipo de grasa o aceite.
Los que mas fácilmente se afectan son los de origen marino, seguidos por los aceites vegetales y finalmente por las grasas animales. 16
Catalizadas por las enzimas lipolíticas llamadas lipasas, y en ciertas condiciones, por efecto de las altas temperaturas, se liberan ácidos grasos de los triacilgliceridos y de los fosfolipidos. Aceite de soya (incremento del índice de acidez) Leche (aceites volátiles – deterioro sensorial)
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Oxidación de ácidos grasos de doble enlace con otras sustancias . Mientras mas concentración de acidos grasos insaturados se presentan, se acelera la autoxidación. Se distinguen 3 reacciones: Iniciación Propagación Paralización 18
Iniciación Formación de RL a partir de ácidos grasos no saturados o de peróxidos lipídicos (hidroperóxidos) Propagación acumulación de peróxidos lipídicos Paralización Los RL se asocian para dar compuestos no radicales. Estos RL provienen de la descomposición de peróxidos lipídicos que son sustancias muy inestables y reactivas
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Son dos tipos: Hidrolítica y Oxidante
La hidrólisis enzimática se caracteriza por la producción de ácidos grasos.
La ranciedad oxidante produce peróxidos pr la presencia de oxígeno atmosférico
Las temperaturas altas influye en ambos tipos de deterioro acelerando mas la rancidez oxidante. 20
Temperatura
Luz
Oxígeno
Humedad
Radiaciones ionizantes
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Sabores oxidados
Efectos sobre el color
Efecto sobre la textura
Toxicidad de las grasas
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El contenido en lípidos libres: grasas neutras (triglicéridos) y de ácidos grasos libres, se puede determinar por extracción del material seco y reducido a polvo con eter de petróleo o con éter dietílico en un aparato de extracción continua. 24
Se dispone de éstos en numerosos diseños, pero básicamente son de dos tipos.
El tipo Bolton o Bailey-Walker dá una extracción continua debido al goteo del disolvente que se condensa sobre la muestra contenida en un dedal que es un filtro poroso, alrededor del cual pasa el vapor caliente del disolvente. El tipo Soxhlet dá una extracción intermitente con un exceso de disolvente condensado.
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La eficiencia de estos métodos depende tanto del pre-tratamiento de la muestra como de la selección del disolvente. Harrison (1939) investigó el uso de varios disolventes sobre la harina de pescado. Encontró que el % de material extraído aumenta en un 9% con la polaridad del disolvente cambiando a hexano, heptano, éter dietílico, disulfuro de carbono, ciclohexano, benceno, cloruro de metileno, tricloroetileno, cloroformo y acetona hasta casi el 16 % con dioxano. 26
Equipo soxhlet 1. Esferas 2. Balón 3. Brazo para ascenso del vapor 4. Cartucho de extracción o cartucho soxhlet 5. Muestra (residuo) 6. Entrada del sifón 7. Descarga del sifón 8. Adaptador 9. Refrigerante (condensador) 10. Entrada de agua de refrigeración 11. Salida de agua de refrigeración
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Extracción completa de la grasa neutra es afectada por presencia de cantidades elevadas de sustancias solubles en agua como carbohidratos, glicerol y ácido láctico. Analizador de grasas de Foss-Let:
Instrumento diseñado para extraer la grasa de las semillas oleaginosas triturando y extrayéndolas con tricloroetileno. El disolvente se filtra rápidamente a un dispositivo medidor que contiene un flotador controlado por un campo magnético ajustable, calibrado para el contenido en grasas. El ajuste del campo hasta que asciende el flotador dá una indicación sensible de la concentración en grasas.
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Un procedimiento útil para la extracción de grasas de alimentos húmedos y semisólidos, que impiden el desecado inicial, es mezclar la muestra con sulfato de calcio, sulfato de sodio anhidro o con vermiculita.
Cuando la muestra se hace pulverulenta y seca, se transfiere a un cartucho de Soxhlet en un aparato de extracción.
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Los lípidos asociados pueden ser liberados si la muestra del alimento se disuelve completamente antes de hacer la extracción con disolventes polares. La disolución del alimento se puede lograr por hidrólisis ácida o alcalina. En el método ácido (proceso de WernerSchmidt) el material es calentado en baño de agua hirviente con ácido clorhídrico para romper las proteínas y separar la grasa como una capa que flota sobre el líquido ácido. 30
La concentración del ácido durante la extracción debe ser aproximadamente 6M, por ejemplo, 10 gr de leche se tratan con 10 ml. de ácido concentrado ó 1 a 2 gr de alimento sólido se mezcla con 8 a 9 ml de agua y 10 ml de ácido. Las proteínas se disuelven en el ácido y la grasa que se separa puede ser extraída por agitación, cuando menos tres veces, con éter dietílico o con una mezcla de éter dietílico y petróleo ligero. 31
En alimentos como la leche deshidratada y queso procesado es aconsejable el tratamiento del tratamiento original con amoníaco antes de adicionar el ácido. Si el material que se analiza contiene una elevada proporción de azúcares, el método de extracción ácida es menos aconsejable que el método alcalino. 32
El éter dietílico tiende a coextraer algún material no-lípido, por lo que los lípidos extraídos y pesados en el extracto seco necesitan ser eliminados cuidadosamente con éter de petróleo y el residuo no-lípido se vuelve a secar y pesarse para dar por diferencia, el contenido de grasa total en la muestra. La hidrólisis ácida tiende a descomponer los fosfolípidos, por lo cual la correlación con la extracción con cloroformo/metanol puede ser pobre en algunos alimentos. 33
En la disolución usando álcali (método de Rose-Gottlieb), el material se trata con amoníaco y alcohol en frío y la grasa se extrae con una mezcla de éter y petróleo ligero.
El alcohol precipita las proteínas que se disuelven en el amoníaco; entonces las grasas pueden ser extraídas con éter. 34
El petróleo ligero es entonces adicionado ya que reduce la proporción de agua y consecuentemente también las sustancias no grasas solubles, tales como la lactosa en el extracto.
La extracción alcalina da resultados muy exactos, lo que hace que la técnica sea muy recomendable.
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Estos consisten en disolver la muestra en ácido sulfúrico y separar la grasa por centrifugación en tubos de vidrio calibrados especialmente. En los EUA se usa el método de Badcock y en los países europeos el método de Gerber es el usado comúnmente en las determinaciones de rutina de grasa en leche y en productos lácteos. Para ciertos alimentos, en particular los no lácteos, se obtiene una separación más limpia si se usa una mezcla de los ácidos acético y perclórico en lugar del ácido sulfúrico.
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Consiste en separar la grasa dentro de un recipiente medidor, llamado butirómetro, y medir el volumen expresando el resultado en tanto por ciento en masa. 37
Materiales: Butirómetros y una centrífuga específica para los mismos. Pipeta de 11 mL, de doble aforo, para tomar la muestra de leche con exactitud. Centrifuga: se encarga de separar la grasa de la materia orgánica que se ha desintegrado por acción del acido sulfúrico Reactivos: Ácido sulfúrico Gerber y alcohol amílico (2-metilbutanol).
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Medir, en una probeta, 10 mL de ácido sulfúrico Gerber y añadirlos dentro del butirómetro.
La grasa está en la leche en forma de pequeños glóbulos rodeados por una capa protectora. La separación completa de la grasa precisa la destrucción de esta envoltura protectora. Este proceso se lleva a cabo por medio del ácido sulfúrico concentrado, de entre el 90 y el 91 % de masa (ácido sulfúrico Gerber).
Una vez preparada la muestra, tomar 11 mL de leche e introducirlos en el butirómetro 39
En este paso, el butirómetro se calienta considerablemente y los productos que se forman tiñen la disolución de color marrón. La grasa liberada en este proceso será separada posteriormente por centrifugación
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Añadir 1 mL de alcohol amílico al butirómetro y cerrarlo. Agitar bien la mezcla. Centrifugar los butirómetros
Los butirómetros se introducen en la centrifugadora y se centrifugan durante unos cinco minutos
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Lectura del resultado
En la escala del butirómetro se puede leer el contenido en grasa de la leche como contenido de masa en tanto por ciento (en la imagen 1,9%).
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Grasas y aceites Indice de refracción Punto de fusión
Puntos de humeado, de flama de encendido Prueba de frío Color
Tubo capilar Punto de caída
Lovibond Espectrofotométrico
Indice de iodo Número de saponificación Acidos grasos libres Valor de acidez Indice de grasa sólida Contenido de grasa sólida Consistencia
Oxidación de lípidos (estado inicial) Valor de peróxido Hexanal Prueba de ácido tiobarbitúrico Oxidación de lípidos (estabilidad) Indice de estabilidad de aceite Método de oxígeno activo Bomba de oxígeno Fracciones de lípidos Composición de ácidos grasos
Esteres de metilo de ácidos grasos Acidos grasos poliinsaturados Acidos grasos isomeros trans
Colesterol 44
– Aceites y grasas • productos comeriales, crudos o refinados • a temperatura ambiente: – grasas >>sólidos – aceites >>líquidos
• En terminos de etiquetado – grasa total: ácidos grasos totales (trigliceridos) – grasa saturada: suma (en gramos) de todos los acidos grasos saturados – categoría opcional, grasa poliinsaturada: intercaladados cis-cis-metilenos ácidos grasos poliinsaturados
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• ¿Por qué es importante caracterizar una grasa? – Salud – Etiquetado – Estabilidad de las grasas: vida de anáquel y de seguridad • Alimentos con <1% de grasa puede tener una vida de anáquel limitada por la oxidación de lípidos y la consiguiente rancidez.
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Preparación de la muestra
Conocimiento de la estructura, química y de los principales componentes lipidicos y sus constituyentes Evitar exposición al calor, luz, o aire Pre-secado: al vacio, liofilización Reducción de tamaño Hidrólisis ácida: ruptura de enlaces covalentes entre proteínas y lípidos
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o Indice de refracción – Se define como la proporción de la velocidad de luz a través del vacio (aire) a la velocidad de luz a través del aceite a una temperatura específica. – Medida de pureza y puede ser usado para identificar aceites – El indice de refracción se mide en un refractometro a 20 o 25 °C para aceites y a 40 °C para grasas.
o Punto de fusión – Se define como la temperatura a la cual la grasa se derrite y se vuelve completamente clara y líquida. – Medida de pureza – En el método de tubo capilar, la grasa se llena en un tubo capilar y se toma la temperatura a la que la grasa esta totalmente derretida. 48
o Indice de iodo – Se usa para caracterizar aceites, como control de calidad del proceso de hidrogrenación (durante el refinamiento), como una indicación del grado de oxidación. Determinación de índice de iodo – Se determina cuando una cierta cantidad de aceite o grasa se disuelve en un solvente y se hace reaccionar con una cantidad conocida de iodo. – El aceite o grasa reaciona con el iodo a nivel del doble enlace. – ICl + R-CH=CH-R >> R-CHI-CHCl-R + ICl – Una solución de ioduro de potasio reduce el exceso de ICl y libera iodo – ICl + 2KI >> KCl + KI + I2 – El iodo liberado es titulado con una solucion estandarizada de tiosulfato de sodio usando almidón como indicador y el valor de iodo es calculado. 49
o … Indice de iodo – I2 + almidón + 2Na2S2O3 >> 2NaI + almidón + Na2S2O3 (B S) N 12.69 – Indice de Iodo = muestra (g)
– donde: B= blanco (mL) S= muestra (mL) N= normalidad de la solucion de Na2S2O3 12.69 es para convertir los mEq de tiosulfato a gramos de iodo. El peso molecular de iodo es 126.9
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o Indice de saponificación – El proceso de saponificación es el proceso de dividir o degradar una grasa neutra en glicerol y ácidos grasos mediante el tratamiento de la grasa con una base O
=
HC-O-C-R2 O
H2C-OH + 3KOH
calor HC-OH
H2C-O-C-R3
H2C-OH
triglicerido
glicerol
+
=
=
H2C-O-C-R1 O
K+-O-C-R1 O K+-O-C-R2 O K+-O-C-R3 Sales de acidos grasos de potasio =
=
=
O
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o ...Indice de saponificación – Se define como la cantidad de base necesaria para saponificar una cantidad dada de aceite y grasa. – Se expresa como miligramos de KOH necesarios para saponificar 1g de muestra – El valor de saponificación es un índice del peso molecular promedio de los trigliceridos en la muestra – El peso molecular promedio del triglicerido puede ser dividido entre 3 para dar un peso molecular promedio de los ácidos grasos presentes. – A más pequeño el valor de saponificación, más grande el promedio de la longitud de la cadena del ácido graso 52
o ...Indice de saponificación Determinación de índice de saponificación – Se determina agregando una cantidad en exceso de hidróxido de potasio a la muestra. La solución es calentada para saponificar la grasa. – El hidróxido de potasio que no reaciona es titulado con una solución estandarizada de HCl usando fenolftaleína como indicador. – El valor de saponificación: (B S) N 56.1 Valor de saponificación= muestra (g)
donde: B=blanco (mL) S=muestra (mL) N= Normalidad del HCl 56.1=peso molecular del KOH
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o Acidos libres y valor de ácidez – La medida de la acidez de una grasa normalmente refleja la cantidad de ácidos grasos que vienen de la hidrolización de los trigliceridos.
H2C-OH
O HO-C-R1
HC-OH
O HO-C-R2
=
HC-O-C-R2 O
+ 3H2O
H2C-O-C-R3
H2C-OH
triglicerido
glicerol
+
=
=
H2C-O-C-R1 O
O HO-C-R3 acidos grasos libres =
=
=
O
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o ...Acidos libres y valor de ácidez – Los ácidos grasos libres es el porcentaje por peso de un ácido graso específico, por ejemplo porcentaje de ácido oleíco. – Valor de ácidez se define como los mg de KOH necesarios para neutralizar los acidos grasos libres presentes en un gramo de grasa o aceite – Algunas veces la acidez de aceites y grasas comestibles se expresa en mililitros de hidroxido de sodio de cierta normalidad requeridos para neutralizar los acidos grasos en 100g de aceite o grasa – Además de ácidos grasos libres, ácidos de fosfato y amino ácidos pueden contribuir a la acidez
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o ...Acidos libres y valor de ácidez – En la grasa cruda los ácidos grasos libres o valor de acidez estima la cantidad de aceite pérdida durante los procesos de refinamiento* designadas a remover ácidos grasos – En grasas refinadas, un alto grado de acidez indica un refinamiento ineficiente o que la grasa se hidrolizo después del almacenamiento o uso. – También puede ocurrir que los catalizadores o aditivos ácidos agregados al aceite contribuyan a un alto valor de acidez – Si los ácidos grasos libres son volátiles pueden ser el resultado de los productos liberados durante las reacciones de ranciamiento hidrolítico
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o ...Acidos libres y valor de ácidez Determinación del valor de acidez – La muestra líquida de aceite o grasa se mezcla con etanol (95%) neutralizado y añade fenolftaleína. La muestra luego es titulada con NaOH – El porcentaje de ácidos grasos libres se calcula: – %Acidos grasos libres (como oleico)=
mLbase Nbase 28.2 muestra (g)
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o Oxidación de lípidos (estado inicial) • Rancidez – Rancidez hidrolítica triglicerido >> glicerol + ácidos grasos ácidos grasos de cadena corta>>> olor ráncido – Rancidez oxidativa* (autooxidación) triglicerido >> peroxidos (muy reactivos), aldehidos (hexanal), cetonas, ácidos orgánicos, hidrocarbonos Cantidad de reactantes y productos
consumo de oxígeno
detección de rancidez
peroxidos (productos primarios) productos secundarios
período de inducción
Tiempo 58
• Valor de Peróxido – Se define como los miliequivalentes (mEq) de peroxido por kilogramo de grasa. – Es un método de titulación para la determinación de peróxidos o grupos de hidroperóxidos (productos iniciales de la oxidación de lípidos). – El valor de peróxido mide la oxidación en los estados iniciales. Los peróxidos después se descomponen para formar otros productos – Un valor bajo puede representar el comienzo de la oxidación o un estado avanzado de la oxidación. Condición que puede diferenciarse al hacer un análisis de peróxido en el tiempo o durante almacenamiento – Es díficil realizarlo en muestras de alimentos pues se necesita al menos 5g de aceite o grasa. – Es un buen análisis para la evaluación de aceite y grasa durante almacenamiento 59
• ...Valor de Peroxido Determinación de valor de peróxido – El aceite o grasa se disuelve en una mezcla de ácido acetico glacial e isooctano (3:2). – Se agrega ioduro de potasio en exceso, el cual reacciona con el peróxido. H+, calor ROH + K+OH- + I2 ROOH + K+I(en exceso)
– La solución es luego titulada con una solución estandarizada de tiosulfato de sodio usando almidón como indicador. I2 + almidón + 2Na2S2O3 2NaI + almidón + Na2S4O6 (azul)
(incoloro)
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• ...Valor de Peroxido – Valor de Peroxido (mEq de peroxido/Kg grasa) =
(S B) N 1000 muestra (g) donde: S= muestra (mL) B= blanco (mL) N= normalidad de la solucion de Na2S2O3
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• Hexanal – De los varios productos producidos durante la oxidación de lípidos, uno de los más comunes es el hexanal – La medida de hexanal del espacio de cabeza es otra forma de determinar el grado de oxidación de lípidos – Se realiza mediante un análisis del espacio de cabeza por cromatografia de gases – El hexanal puede correlacionar con la determinación sensorial de oxidación de lípidos. Debido a que el hexanal es el que mayor contribuyente de los olores de rancidez Determinación de hexanal – Se toma un volumen del aire de cabeza del recipiente que este conteniendo el aceite o grasa. – Normalmente se aplica calor para favorecer el desprendimiento de compuestos volátiles – Este aire se analiza en un cromatografo de gases y la cantidad de hexanal se expresa en función de la cantidad de muestra usada. 62
• Prueba de ácido tiobarbitúrico – Esta prueba mide la los productos secundarios de la oxidación de lípidos, malonaldeídos (MA). – El acido tiobarbitúrico (ATB) reaciona con el maldonaldeído y produce un compuesto (complejo) de color rojo que es medido espectrofotometricamente – Esta prueba no es especifica, de modo que se expresa como substancias que reacionan con el acido tiobarbiturico – Puede usarse una muestra de alimento. Pero normalmente se destila este compuesto y el destilado se hace reaccionar con el ácido tiobarbitúrico. OH 2
+ N
ATB
OH
OH HN S
MA
OH
=
=
N HS
O O H-C-CH2-C-H
NH N
OH
O
ATB-MA complejo
N H
S
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o Oxidación de lípidos (estabilidad) Indice de estabilidad – Determina el período de inducción burbujeando aire purificado a través del aceite o grasa (110-130°C). – Luego, los ácidos volátiles (principalmente ácido fórmico) son atrapados en agua. – La conductividad del agua es medida continuamente, metodo de Rancimat (o se puede medir los productos de la oxidación) y se puede obtener una curva como la siguiente:
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Oxidacio n de lipidos
sin antioxidante
con antioxidante
Tiempo 66
o ...Oxidación de lípidos (estabilidad) Método de bomba de oxígeno – Una forma de determinar la estabilidad oxidativa es midiendo el tiempo requerido para el inicio de la oxidación; el que es medido como el tiempo de desaparición del oxígeno en un sistema cerrado. – La bomba de oxígeno consiste en un contenedor cerrado que tiene un manómetro. La muestra es puesta en el contenedor y el oxígeno es usado para presurizar el contenedor a 100 psi. – El contenedor es luego puesto en un baño maría (100°C) . El período de inducción se determina midiendo el tiempo hasta que una caída rápida de la lectura del manómetro ocurra, la que corresponde con el período de rápida absorción de oxígeno por la muestra – Puede ser usado directamente con los alimentos 67
Valor de Anisidina
En la presencia de acido acetico, la panisidina reacciona con los aldehidos produciendo un color amarillento. La absorbancia molar a 350 nm aumenta si el aldehido contiene dobles enlaces El valor de anisidina es una medida de 2alkenals Una expresion llamada el valor de Totox o valor de oxidacion equivalente a 2 x valor de peroxido + valor de anisidina
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• UV espectrometria – medida de la absorbancia a 234 nm (dienes conjugados) y 268 nm (trienes conjugados) es usada para el monitoreo de la oxidacion – El grado de oxidacion no correlaciona muy bien con la magnitud de absorbancia, excepto en las primeras etapas
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o Fracciones de lípidos • Composición de ácidos grasos – La composición de ácidos grasos o el perfil de ácidos grasos de un alimento se determina cuantificando la clase y la cantidad de acidos grasos que estan presentes, usualmente extrayendo los lípidos y analizandolos usando cromatografía de gases (en columnas capilares). – Para incrementar la volaticidad antes del análisis por cromatografía de gases, los trigliceridos y fosfolipidos son tipicamente saponificados y los acidos grasos liberados son esterificados para formar esteres de metilo.
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H2C-OH
O H3C-O-C-R1
HC-OH
O H3C-O-C-R2
=
HC-O-C-R2 O
CH3OH NaOH, BF3
H2C-O-C-R3
H2C-OH
triglicerido
glicerol
+
=
=
H2C-O-C-R1 O
O H3C-O-C-R3 esteres de metilo de acidos grasos =
=
=
O
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• Colesterol – Los lípidos extraídos de la grasa son saponificados. – El colesterol se encuentra en la fracción no saponificada, es extraído y derivatizado (metilado) para formar esteres de trimetilo – La cuantificación se realiza usando cromatografía de gases con columnas capilares Determinación de colesterol – Principio: los lípidos son extraídos y saponificados, la fracción nosaponificada es luego extraída – El extracto graso en cloroformo es filtrado atraves de sulfato anidro. – El filtrado es evaporado usando nitrogeno gaseoso – Se añade hidroxido de potasio y etanol
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– Se añade alicuotas de benzeno y 1 N de hidroxido de sodio y se agita – La capa líquida se separa y el proceso se repite con 0.5 N de hidroxido de potasio – Despues de varios lavados con agua, la capa de benzeno es secada con sulfato de sodio anidro y luego se concentra en un rotavapor – El residuo es disuelto en dimetilformamida (DMF) – Una alicuota se derivatiza agregando hexametildisilazina y trimetilclorosilano – Se agrega agua y un estandar interno en heptano – Luego la solución es centrifugada – Una porción de la capa de heptano se inyecta en el cromatografo de gases
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