República Bolivariana de Venezuela Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental
Centrifugación
Esquema
1. Defini Definició ción n de de Centr Centrifug ifugaci ación ón 2. Princi Principio pioss Físico-Qu Físico-Químic ímicos os Sedimentación: Principio de Arquímedes Principio de Stokes 3. Fuerzas uerzas que que intervie intervienen nen en el proce proceso so Fuerza Centrífuga Fuerza Centrípeta Fuerza Friccional 4. Compon Component entes es de de la la Centr Centrífug ífuga a Rotor Motor Cámara de Vacío Control de Velocidad, Tiempo y Temperatura 5. Variable ariabless que afectan afectan la Centrifug Centrifugació ación n Masa y densidad de la partícula Densidad del medio Aceleración de la gravedad Coeficiente de Difusión Tiempo Temperatura Presión y Velocidad 6. Tipos ipos de de Ce Cent ntríf rífug uga a Centrífugas simples Centrífuga de alta velocidad Ultracentrífugas Micrófugas 7. Tipos ipos de Centr Centrif ifug ugac ación ión Centrifugación Analítica Centrifugación Preparativa: Diferencial y en gradiente de densidad 8. Importancia Importancia de la Centrifug Centrifugación ación en la separación separación y análisis análisis de de muestras. muestras.
1.
Definición de Centrifugación
Es un método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos de diferente densidad median mediante te una centrifu centrifugad gadora ora,, la cual cual imprim imprime e a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, gravedad, provocando provocando la sedimentación del del sóli sólido do o de las las part partíc ícul ulas as de ma mayo yorr densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas Todas las partículas, por poseer masa, se ven v en afectadas por cualquier fuerza (ori (orige gen n de una una ac acel eler erac ació ión) n).. La ce cent ntri rifu fuga gaci ción ón impo impone ne,, grac gracia iass a la aceleración centrífuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partículas experime men ntan una acelerac ración que las obliga a sedime men ntar. La centrifugación puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analítica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar, mientras que en la segunda se procede al anál anális isis is de las las ma macr crom omol oléc écul ulas as en una una ultr ultrac acen entr trifu ifuga gaci ción ón.. Exis Existe ten n diversos métodos de centrifugación y una extensa variedad de técnicas derivadas de esta. El obje objeti tivo vo de la ce cent ntri rifu fuga gaci ción ón es sepa separa rarr part partíc ícul ulas as de dife difere rent ntes es características. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración G. G=velocidad G=velocidad angular2 x radi radio o de giro giro.. O otra otra form formul ula a es G=ve G=velo loci cida dad d angular + radio 2. Principi Principios os Físico-Qu Físico-Químic ímicos os
Tod Todas as las las part partíc ícul ulas as susp suspen endi dida dass en un líqu líquid ido o tien tienden den a sepa separa rars rse e espontáneamente, en función del tiempo de una manera natural, por acción de un fenómeno llamado sedimentación, debido a la gravedad terrestre. Un soluto suspendido en un líquido por acción de la gravedad terrestre se separa y pasa a ocupar el fondo del recipiente que la contiene, quedando el líquido en la parte superior. - Principio de Arquímedes : es un principio físico que afirma que un
cuerpo total o parcialmente sumergido en un fluido estático, será empujado con una fuerza igual al peso del volumen de fluido desplazado por dicho objeto. De este modo cuando un cuerpo está sumergido en el fluido se gene genera ra un em empu puje je hidr hidros ostá táti tico co resul esulta tant nte e de las las pres presio ione ness sobr sobre e la superficie superficie del cuerpo que actúa siempre hacia arriba arriba a través del centro de gravedad del cuerpo del fluido desplazado y de valor igual al peso del fluido desplazado. Esta fuerza se mide en Newtons (en el SI) y su ecuación se describe como:
Donde ρf y ρs son respecti respectivam vament ente e la densid densidad ad del fluido fluido y del sólido sólido sumergido; V el volumen del cuerpo sumergido; y g la aceleración de la gravedad. gravedad.
- Principio de Stokes: Algunos de los principios básicos en la teoría de la sedimentación se derivan de la Ley de Stokes . Para simplificar el
problema se suele considerar que las partículas a aislar en Biología son esferas; esferas; cuando cuando éstas se encuentran en un campo gravitacional gravitacional y alcanzan alcanzan una velocidad constante, la fuerza neta sobre cada esfera es igual a la fuerza de resistencia que opone el líquido a su movimiento. En este caso particular de la ley de Stokes se comprueba qué: -La velocidad de sedimentación de cada partícula es proporcional a su
tamaño, velocidad dad de sedime sedimenta ntació ción n es propo proporci rciona onall a la densid densidad ad de la -La veloci partícula y a la del medio, -La velocidad de sedimentación es nula cuando ambas densidades se igualan, -La velocidad de sedimentación disminuye al aumentar la viscosidad del medio, y velocid idad ad de sedi sedimen menta taci ción ón aumen aumenta ta al aumen aumenta tarr el ca camp mpo o de -La veloc fuerza. Si las partículas partículas están cayendo verticalmente verticalmente en un fluido viscoso viscoso debido a su propio peso puede calcularse su velocidad de caída o sedimentación igualando la fuerza de fricción con la fuerza de gravedad. gravedad.
donde:
V s es la velocidad de caída de las partículas (velocidad ( velocidad límite) límite) g es la aceleración de la gravedad, gravedad, ρ p es la densidad de las partículas y ρf es la densidad del fluido.
3. Fuerzas Fuerzas que que intervien intervienen en en el proceso: proceso:
Fuerza centrífuga: Es la que tiende a alejar los objetos del centro
de rotación rotación mediante la velocidad velocidad tangencial, tangencial, perpendicular perpendicular al radio, en un movimiento circular. circular.
La fuerza centrífuga es una de las fuerzas ficticias que parecen actuar sobre un objeto cuando su movimiento se describe según un sistema de referencia en rotación. La fuerza centrífuga surge cuando analizamos el movimiento de un objeto desde un sistema de referencia no inercial, inercial, o acelerado, que describe un movimiento circular uniforme. La fuerza centrífuga será el producto de la masa por la aceleración centrífuga, en un sistema de referencia no inercial.
Fuerza centrípeta: Se llama así a la fuerza que tira de un objeto
hacia el centro de un camino circular mientras que el objeto sigue dich dicha a traye trayect ctori oria a a una una rapidez co cons nsta tant nte e (sie (siend ndo o la rapid rapidez ez la magnitud de la velocidad). velocidad).
El término centripeta proviene de las palabras latinas centrum (centro) and petere (dir (dirig igirs irse e haci hacia. a... ..), ), y pued puede e ser ser deri deriva vada da a part partir ir de las las leyes leyes descubiertas por Isaac Newton. Newton. La fuerza centrípeta siempre actúa en forma perpendicular a la dirección de movimiento del cuerpo sobre el cual se aplica. En el caso de un objeto que se mueve en trayectoria circular con rapidez cambiante, la fuerza neta sobre el cuerpo puede ser descompuesta en un componente perpendicular que cambia la dirección del movimiento y uno tangencial, paralelo a la velocidad.
Fuerza friccional: La fuerza de fricción a veces también es conocida
como resistencia al rozamiento. Esta es la fuerza friccional que se gene genera ra en la supe superf rfic icie ie del del tubo tubo de ensa ensayo yo (con (con una una mues muestr tra) a) causada por el movimiento del aire alrededor de esta. Es por ello que las muestras en una centrífuga deben estar en un tubo de ensaye grue grueso so,, y liso liso (lo (lo ma mass esta establ ble e posi posibl ble) e),, porq porque ue si no esto estoss se romperían. Esto ayuda a minimizar la fuerza de fricción.
Sobre una macromolécula en solución, sometida a un campo de fuerza cent ce ntrí rífu fugo go o gravi gravita tato tori rio, o, ac actú túan an tres tres fuer fuerza zas: s: la fuer fuerza za del del campo campo,, el empuje del solvente y la fuerza de fricción (las dos últimas se oponen a la primera). 4. Componen Componentes tes de la centrífug centrífuga a
Una centrifuga es un dispositivo para separar partículas en una solución de acuerdo a su tamaño, textura, densidad, viscosidad del medio y velocidad del rotor. Sus componentes son:
Rotor: Dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos.
Existen varios tipos
colocan en un dispositiv dispositivo o (cestilla) (cestilla) que, * Rotor basculante: Los tubos se colocan
al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Así pues los tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje de giro. *Rotor de ángulo fijo: Los tubos se insertan en orificios en el interior de
rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo tubo se sitú sitúa a paral paralel elo o al eje de giro giro.. Este Este tipo tipo de rotor rotores es es típi típico co de ultracentrífugas y se emplea en separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerados (por ej. de cloruro de cesio).
Motor: Es eléctrico y capaz de girar a docenas de miles de veces por
minuto. Permite que la técnica sea ejecutada. Cámara de Vacío: Es una pieza cóncava que sirve para contener dentro dentro de ella el rotor y su respect respectivo ivo soporte soporte que lo une o conecta conecta con el motor. egula a la Cont Contro roll de Veloc elocid idad ad,, Tiem Tiempo po y Tempe emperat ratur ura: a: Regul velocidad del dispositivo al igual que el dispositivo regulador de la temperatura necesaria para la centrifugación de las muestras.
5. Variables ariables que que afectan afectan la Centrifug Centrifugació ación n Masa y densidad de la partícula
Son propiedades físicas características que pueden afectar directamente la centrifugación. La masa es conocida como la cantidad de materia contenida en un cuerpo o sustancia; mientras que la densidad es la cantidad de masa contenida en un volumen determinado.
Densidad del medio
Los medios muy densos o pocos densos afectan a la centrifugación. La sacarosa, si su concentración aumenta, esto hace que aumente la densidad del medio y la viscosidad del mismo. Si el medio es mucho más denso afectara en la determinación del aumento de la densidad del medio por la sacarosa.
Aceleración de la gravedad
Se relaciona con la fuerza de atracción de la tierra sobre los objetos. Al aumentar la gravedad aumenta la velocidad.
Coeficiente de Difusión
Es la facilidad con que cada soluto en particular se mueve en un solvente determinado. Esto dependerá de la consistencia del medio líquido.
Tiempo
La centrifugación centrifugación debe hacerse en el tiempo justo, ya que en el proceso se pierden elementos de gran importancia para el estudio.
Temperatura
Básicamente lo mismo que en el tiempo. Esto también dependerá del tipo de análisis que se desea realizar. realizar.
Presión y Velocidad
La pres presió ión n vien viene e sien siendo do la relac elació ión n que que exis existe te entr entre e una una fuer fuerza za y la superficie donde se aplica. La velocidad, en cambio, la magnitud con la que se cambia a posición de un objeto. Ambas afectan a la centrifugación ya que el aumento o disminució disminución n de las mismas pueden hacer perder componente componente importantes de lo que se quiere analizar. 6. Tipos Tipos de Centrí Centrífug fugas: as:
Cent Centrí rífu fuga gas s de ba baja ja velo veloci cida dad, d, de sobr sobrem emes esa a o clíni línica cas s (simples)
Centrífugas de alta velocidad.
Velocidad entre 18000 y 25000 rpm. Refrigeradas, algunas con sistema de vacío. Útiles en la separación de fracciones celulares. Insuficientes para la separación de ribosomas, virus o macromoléculas.
Ultracentrífugas.
Pequeño tamaño. Sin refrigeración. Máxima velocidad: 5000 rpm. Útil para partículas grandes (células, precipitados de sales insolubles…etc.)
Velocidad: a partir de 50000 rpm. Presentan sistemas auxiliares: sistemas de refrigeración, sistemas de alto vacío. 2 tipos: - Analíticas: obtención de datos precisos de propiedades de sedimentación (s, PM). -Preparativas: aislamiento de partículas de bajo S (microsomas, virus, macromoléculas).
Micrófugas: variante de las anteriores.
Velocidades altas: más de 10000 rpm y tubos cortos. c ortos. Volúmenes muy pequeños. Útiles en Biología Molecular. Molecular.
7. Tipos Tipos de de Centri Centrifug fugaci ación ón
Centrifugación Analítica
Se pretende es estimar propiedades físicas (coeficiente de sedimentación o peso peso mo mole lecu cula lar) r) de algu alguna na part partíc ícul ula a en co conc ncre reto to:: sus sus prop propie ieda dade dess hidrodinámicas. Para ara pode poderr apli aplica carr la tecn tecnol olog ogía ía de la ce cent ntri rifu fugac gació ión n anal analít ític ica a deben deben cumplirse una serie de requisitos:
-
Que se aplique a sustancias lo más puras posible, no a grandes mezclas. Que presenten una mayor capacidad de giro, en torno a las 100.000 r.p.m. En cuanto al tipo de rotores, se necesita que las paredes del tubo se encuentren alineadas con las líneas de fuerza y estén provistos de sistemas ópticos capaces de detectar la sedimentación de la partícula en cada momento.
Las moléculas se observan en un sistema óptico durante la centrifugación, para detectar las macromoléculas en solución a medida que se mueven en el campo gravitacional. Las muestras se centrifugan en celdas con ventanas que se disponen en el plano paralelo al sentido de giro del rotor. A medida que el rotor gira, las imágenes de la celda, se proyectan en un sistema óptico sobre un film o una computadora. La concentración de la solución en varios puntos en la celda se determina por la absorción de luz de la longitud de onda apropiada.
Centrifugación Preparativa: Diferencial y en gradiente de densidad
El objetivo de la centrifugación preparativa es aislar partículas específicas. Exis Existe ten n dos dos mé méto todo doss de sepa separa raci ción ón en ce cent ntri rifu fuga gaci ción ón prep prepar arat ativ iva: a: Diferencial y En gradiente de densidad. Centrifugación diferencial: Es el método más común de separación, y es rara la purificación enzimática que no lo utiliza. En este método, el tubo de centrífuga se llen lena con una mezcla unifor forme problem lema. Tras la centrifugación se obtienen dos fracciones: un pellet que contiene el material sedimentado y un sobrenadante con el material no sedimentado. El método es bastante inespecífico, y a priori no se puede saber si la partícula buscada queda quedará rá en el sobr sobren enad adan ante te,, en el pell pellet et o repar reparti tido do entr entre e ambos ambos;; sin sin embargo es una técnica muy útil, sobre todo para aislamiento de células y orgánulos subcelulares. Centri Cent rifu fuga gaci ción ón en grad gradie ient nte e de dens densid idad ad:: Este Este mé méto todo do es algo algo má máss complicado que la centrifugación diferencial, sin embargo presenta ventajas que compensan el trabajo añadido. La técnica no solo permite la separación de varios, si no todos, los componentes de la muestra, sino que también permite realizar medidas analíticas. El método de gradiente de densidad implica la utilización de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El cons nsig igue ue co con n un solu soluto to pref prefer erib ible leme ment nte e de baja baja ma masa sa gradiente se co mole mo lecu cula larr en un solv solven ente te en el que que la mues muestr tra a a anal analiz izar ar pued pueda a ser ser suspendida. La muestra se sitúa en la parte superior del gradiente como una una fina fina band banda. a. La sepa separac ració ión n de los los co compo mpone nent ntes es de la mues muestr tra a se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones varia ciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad: -Centrifugación zonal: La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrífuga
las las part partíc ícul ulas as co come menz nzar arán án a sedi sedime ment ntar ar a trav través és del del grad gradie ient nte, e, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. -Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopícnica: Separa las partículas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y la centri centrifug fugaci ación ón lle llevad vada a a cabo. cabo. Mientr Mientras as en la centri centrifug fugaci ación ón zonal zonal la densidad densidad del gradiente gradiente no debe exceder exceder a la de las partículas partículas a separar, separar, en la centrifugación centrifugación de equilibrio en gradiente gradiente la condición fundamental fundamental es que la densidad máxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas. La ce cent ntri rifu fugac gació ión n de equi equili libr brio io en gradi gradien ente te perm permit ite e que que las las espe especi cies es sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llam llama a ce cent ntri rifu fuga gaci ción ón isop isopíc ícni nica ca.. En este este punt punto o no se prod produc ucir irá á una una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un "colchón" de material que posee una densidad superior que la suya propia.
Cent Centri rifu fuga gaci ción ón zona zonall
superior Colocación de la Parte gradiente de muestra Separación en función de
Cent Centri rifu fuga gaci ción ón iso isopí pícn cnic ica a
de unLa muestra se disuelve en densidaduna solución isocrática.
preformado. Masa de la partícula.
Densidad de la partícula.
8. Importanci Importancia a de la Centrifugació Centrifugación n en la separación separación y análisis análisis de muestras.
La centrifugación es muy importante en el área de la salud, específicamente es utilizada para obtener suero de sangre completa y así obtener del mismo resultados veraces. Muchos de los análisis no necesitan de suero y pueden realizarse sin necesidad de la centrifugación, pero en el caso de los análisis de hormonas, química sanguínea, electrolitos, inmunología, serología, entre otros, se utiliza ésta técnica.
República Bolivariana de Venezuela Venezuela Universidad del Zulia Facultad de Medicina Escuela de Bioanálisis Cátedra: Análisis Instrumental
Centrifugación
