c c
c c
cc c
V V à à
à ! " ! ! #$# % & ! ' ( ) *+, ( + +
* +," -. /0-.* +, 1 + " ) + ( (*+," 2. /0-. " 3 '2. - & à - 4# ' + ( ) + " ( #( ! 4!
à 3 & ' *+, 3 5 *+, 3
( 3 6. ! 4!( -
r
r
a
r
" à ( 7 " ' ( ! 8 4 ) / : ) / 8'9 '9 1' & à () "" à / £ £
5 5
V £ 3 £ 9 / ß à ß à (
V CATALISIS MOLECULAR a a ( + 5 /+ 5 + " 5 à ! ( à ) a / # ' " & ; <#=0.
#==1 . '> " " à ( ( + ) 4 ( 4+ ( " 1 5
( (
( +
a Ea a (
(
"
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUBSTRATO SOBRE LA CATALISIS ENZIMATICA à in vitro ( ) > ( + ( ) ( ( 7"
+ " ( ( ( ' ( (
" " ( ( (
à ( ( 3 ( ) à ( + 36.
" ! - à - #6- ( ! > - " ( + ( ( "
à ! ( " ( *+, 3 -/
0
/ v0 ( ( *+, Km0 ! 6
Vmax0 ( +03 6.?
0
-:*+,0.*+, -0*+, EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA + ( ( ( 7 " ( ' 7 ( )
" à 7 @ = 7 $ = ! 7 A B 7 à
" ( ( (
ENZIMA
pH OPTIMO
5
# @
C
D D
1
D A
'
$ D
D B
E(
D B
EFECTO DE LA TEMPERATURA
a " %@=1
à D=1 " "+ ( ( " ( " ( ==1
CONOCIMIENTOS PREVIOS 1. ¿Cuáles son las características estructurales del almidón?
p £ p 6 £ p ! " # $ $ $
.¿Qué tipo de enzima es la alfa amilasa salival?
$ " % $ & ' " ( 3. ¿Cuáles son los productos que origina la acción de esta enzima sobre la el almidón?
à ( ( " à F4 F#4% F#4A 9 " è. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración de la enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura. £ Concentración del sustrato
3 / v & ( " { à ( Vmax ( )
(
= ë+ (
3
Figura: representación de una cinética típicamente michaeliana.
£
Efecto de la temperatura en la actividad enzimática.
Ü Incremento de la velocidad con la temperatura/
( & ( Ü Decremento de la velocidad con la temperatura/
" &
)
|
Figura: dependencia de la actividad enzimática con la temperatura
£
Efecto del pH en la reacción química
:
Efecto del pH en la ionización del sitio activo/ 7 5 " ( 5 ) ) 4 : : 87 487. 7 " Efecto del pH para la desnaturalización de la enzima/ 7 ( ( ( ( /
#==
@=
= 7
=#.%@ADB$#=##
Figura: efecto de la variación en el pH sobre la actividad enzimática.
El pH óptimo varía para las diferentes enzimas/ 7
" ( ( 5 ) & 7 . & 7 7 MATERIALES Y METODOS Materiales £ £ £ £ £ £ £ £ £ £ £
5 + =@G + H 7@ = H 7A B H 7B = C ( " à 3 H > 1
Métodos EXPERIMENTO 1. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA PROCEDIMIENTO: COMPONENTE Sol. Almidón 0.5% Agua destilada Preparado enzimático Incubar a è0°C
SISTEMA/mL I .0
II .0
III .0
IV .0
0.è 0.1
0.3 0.
0. 0.3
0.1 0.è
1. Añadir primero el agua y luego la disolución de enzima, pues de lo contrario la reacción dará inicio y no se tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución de enzima al último tubo, poner en marcha el cronómetro y comenzar a medir el tiempo del experimento. . Control de la actividad enzimática. Al cumplir 1min de la reacción; en la lingotera, colocar pequeñas cantidades de cada uno de los tubos en una excavadura, y agregar gotas de lugol. Continuar el control del sustrato a intervalos de 1 min hasta que el yodo no reaccione con el almidón. 3. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo del lugol, el que no mostrará cambio.
è. Control. Adicionar en una excavadura unas gotas de agua y lugol para tenerlo como solución blanco. 5. Construya la tabla TUBOS Enzima (ml) Tiempo total de reacción (min) Velocidad de la reacción(1/t)
1
3
è
m. Con estos datos construya un gráfico de [E] en el eje de ordenadas versus velocidad de reacción (1/t) en el eje de abscisas.
EXPERIMENTO . ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH PROCEDIMIENTO: COMPONENTE
SISTEMA /mL
Buffer fosfato pH 5,0
I .0
Buffer fosfato pH m.8
II
III
.0
Buffer fosfato pH 8,0
.0
Sol. Almidón 0.5%
0
.0
.0
Sol. enzima
.0
.0
.0
V ( %=I1" " & ( ) 8I#
! "#$"%& '#( $ )p "*)( "+ p ,'- $+ ! "#$& SISTEMA /mL
+$! $" "# !% % * " +$ ,-
/0 /0 /0
/ / /0
/0 /0 /0
. / /0
A intervalos de 1 min ensaye la presencia del almidón mediante la reacción con lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental N°1
Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:
TUBOS Enzima (ml)
1
3
è
Tiempo total de reacción (min) Velocidad de la reacción(1/t) Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción (volumen/tiempo) en el eje de ordenadas versus volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento)
EXPERIMENTO N°è: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA PROCEDIMIENTO COMPONENTE
SISTEMA /mL I II
III IV V Sol. de almidón 0.5% Preparadoenzimático Hervir el tubo n° 1 durante 5min y reponer el volumen de agua perdida por evaporación Incubar los tubos a: è0°C è0°C 50°C 0 °C Temperatura ambiente Ensayar en ellos la reacción con lugol a intervalos de 1 min. Anotar el tiempo que demora en desaparecer la coloración azul.
1
3
5
è
Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:
V =.@G ( ( à 8 J7.@G =.@G ( " ( VV VVV ( " 7.+J% ( ( " #=G =.@G ( ( " ( à ( ( 3VV ( > ( ( V V a =
" %@ 1 £ 1 ( ( 7 ( " ( '7 ( ) " £ à ( ( + ) 4 ( 4+ ( " 1 5 ( ( ( + £
V V V
E K H 7 #L V V
/66 6 6 6 VV6
/66KKK 6" 6 4.$A$#D
/66KKK 6 #6 4 4DDA.DB
/66KKK" (6K M0 NA(B a
.. &. " ". /. 0 0 " CUESTIONARIO EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN DEL ENZIMA 1. Describa que características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón " " " E ( / > " " 8 - " à 9 ( ) 9 ( . 5 ( . Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de reacción versus [E], tomando como concentración del enzima el volumen de la solución utilizado en cada tubo. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de reacción el inverso del tiempo?
EXPERIMENTO : ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DEL pH
1. Describa lo observado, al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de la enzima alfa amilasa ¿aqué conclusión llega acerca del pH óptimo de esta enzima?
Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la ȕ-amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6.7 y 7.2
. ¿Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la realización de este ensayo?
El pH no afecta la actividad enzimática directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la reacción como substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la velocidad de la reacción. Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación. EXPERIMENTO 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO 1. Anexe la tabla y el gráfico elaborados según las indicaciones del trabajo práctico, tomando como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?
. Analice el grafico y plantee las conclusiones a que puede llegar en este caso. 3. Describa las dificultades presentadas en este ensayo. EXPERIMENTO è: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA 1. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento según las indicaciones del trabajo práctico. . Explique que le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a è0°C 3. ¿ por qué no se puede emplear el término de temperatura optima ?
