Corresponde al resumen de las 3 solemnes correspondientes a la universisdad andres belloDescripción completa
Tecnología Del DNA Recombinante DNA Recombinante: Una molécula de DNA formada por la unión de segmentos de DNA de distintos orígenes. Los DNAs recombinantes son utilizados en el clonamiento de genes, en la modificación genética de organismos y como herramienta general en biología molecular.
Algunas técnicas utilizadas: • Corte de DNA en secuencias específicas por endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) • Hibridización o Hibridación de ácidos nucleicos: permite encontrar una secuencia específica de DNA o RNA sobre la base de la complementariedad de bases • Clonamiento de DNA: una molécula de DNA puede ser copiada para generar muchas copias idénticas de ella • Amplificación de segmentos de DNA por la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
Endonucleasas o Enzimas de Restricción
Permiten generar un mapa o patrón de restricción
Análisis de DNA Digerido con Enzimas de Restricción
DESNATURACIÓN Y RENATURACIÓN (HIBRIDACIÓN DEL DNA)
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (polymerase chain reaction) Hebras de DNA complementarias separadas por calor
Partidores definidos
Síntesis de DNA
Región amplificada
El primer ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias específicas de DNA. El DNA aislado de células es calentado para separar sus hebras complementarias. Estas hebras son hibridizadas a dos fragmentos de DNA de hebra simple (oligonucleótidos), que han sido sintetizados químicamente. Estos dos oligonucleótidos sirven como partidores específicos para la síntesis de DNA por la DNA polimerasa, la cual copia el DNA que se encuentra entre las regiones de unión de los partidores.
DENATURACIÓN:
HIBRIDACIÓN:
PARTIDORES
ELONGACIÓN:
PARTIDORES
Cada ciclo tiene 3 etapas: denaturación (separación de hebras), hibridización (unión de partidores al templado) y elongación (polimerización de desoxirribonucleótidos para sintetizar DNA sobre el templado).
La cantidad de DNA producido se duplica en cada ciclo, lográndose una amplificación exponencial del fragmento deseado, a partir de poca cantidad de DNA. La enzima utilizada para amplificar DNA en el PCR es la de la bacteria Thermus aquaticus (Taq Polimerasa). Este organismo vive en ambientes de temperaturas muy altas (géiseres), lo cual permite que su DNA polimerasa resista las temperaturas requeridas para la amplificación por PCR
Early Exponential CT Phase Log-Linear Phase
Linear Ground Phase
M 10fg 100fg 1pg 10pg 100pg 1ng 10ng control
RT-PCR EN TIEMPO REAL (SYBR Green)
λ
• SYBR Green I binds dsDNA • SGI fluorescence increases when bound to dsDNA • As dsDNA accumulates, more SGI binds the DNA and the fluorescence increase
λ
λ
λ PCR Reaction Progression
λ
λ
λ λ
λ
λ
λ λ
λ
λ
λ
λ
RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)
• • •
Target specific hybridization probe 5’ reporter and 3’ quencher Utilizes FRET quenching
Light*
Light
R
Reporter
Q
Quencher
R
Energy
Q * heat for BHQs
RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)
λ
1. During PCR, probe hybridizes to target sequence
Taq
R
R Taq
Q
2. Probe is partially displaced during extension 3. Probe cleaved by 5’- 3’ nuclease activity of polymerase 4. Illuminated free reporter exhibits unquenched fluorescence
iScript qRT-PCR Standard Curve Comparison: cDNA serial dilution vs. total RNA serial dilution 40
HeLa, β-actin
cDNA Standard Total RNA Standard
35 T
30
25
20
15
y e
10
total -3.382 0.999 38.09 97.6%
cDNA -3.394 0.999 38.91 97.1%
Slope Corr. Coef. Intercept PCR efficiency
5
1
d u
2
3
4
5
6
7
Log Starting Quantity (femtograms of input RNA) Note: 1/10th of cDNA reaction used for PCR
8
9
RESUMEN • Corte con enzimas de restricción
DNA
• Hibridación de ácidos nucleicos
DNA RNA
(Southern) (Northern) (Hibridación in situ)
• Clonamiento de DNA: una molécula de DNA puede ser copiada para generar muchas copias idénticas de ella (bacterias y levaduras) • Amplificación mediante PCR
