BANDEO CROMOSOMICO CURSO:
Genética I INTE TEGRAN GRANTE TES S: IN Cachi Piña Isabelita
Gonzales Sánchez Joslin Gonzales Seclen Cristhian Ramírez Ramírez Wilson Zapata Díaz Javier DOCENTES:
MSc Cesar G!zmán "i#o Ma# Marco G!zmán $ello
INTRODUCCIÓN Los primeros cariotipos fueron útiles para contar los números de cromosomas, pero muchas veces las anomalías cromosmicas, como los reordenamientos e!uili"rados o las pe!ue#as deleciones cromosmicas, eran indetecta"les$ %n la d&cada de '()* se desarrollaron las t&cnicas de tincin para producir las "andas cromosmicas características de los cariotipos modernos$ Las t&cnicas de "andeo fluorescente, permitieron la completa individuali+acin de los cromosomas humanos, se pudo compro"ar !ue el cromosoma -' asociado al síndrome de Do.n, en realidad es m/s pe!ue#o !ue el --, pero am"os mantuvieron el número !ue primitivamente se les ha"ía asi0nado$ Cada cromosoma en las c&lulas som/ticas humanas est/ formado por una serie de "andas continuas$ Las "andas se u"ican en re0iones a lo lar0o de los "ra+os cromosmicos las re0iones tienen límites definidos !ue pueden ser los e1tremos de los "ra+os, los centrmeros ciertas "andas$
O23%TI4O5
Conceptuali+ar el "andeo cromosmico cu/les son las "andas$
Identificar las tinciones o m&todos utili+ados en los diferentes tipos de "andeos o "andas$
NOMECLATURA DE BANDEOS MORFOLÓGICOS
%n relacin con la nomenclatura para descu"rir los diferentes "andeos cromosmicos, se emplea un cdi0o de tres letras6 la primera, indica el tipo de "andeo utili+ado, la se0unda, la t&cnica de deteccin empleada la tercera, el tipo de tincin$
QFQ: 2andas 7 por fluorescencia usando !uinacrina$ GTG: 2andas 8 por tratamiento en+im/tico con tripsina utili+ando 8iemsa$ RFA: 2andas R por fluorescencia usando naran9a de acridina$ RHG: 2andas R mediante desnaturali+acin t&rmica utili+ando 8iemsa$ THG: 2andas T por desnaturali+acin t&rmica empleando 8iemsa$ CBG: 2andas C por hidr1ido de "ario utili+ando 8iemsa$
Nomeclatura de a!deo" d#!$m#co"% GBG: 2andas 8 por incorporacin de 2rdU utili+ando 8iemsa$ RBA: 2andas R por incorporacin de 2rdU empleando naran9a de acridina$ RBG: 2andas R por incorporacin de 2rdU utili+ando 8iemsa$ GB&AAu: 2andas 8 por incorporacin de 2rdU empleando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal$
RB&AAu: 2andas R por incorporacin de 2rdU usando anticuerpos específicos unidos a partículas de oro coloidal$
Ba!deo Cromo"'m#co
Consiste en someter a los cromosomas a desnaturali+aciones, a di0estin en+im/tica o a am"os, se0uido de una tincin con colorante específico para :DN$ %sto hace !ue los cromosomas se ti#an con una serie de "andas claras oscuras$ ;a diversos tipos de "andeo6
Ba!deo G Los cromosomas son sometidos a di0estin con la en+ima tripsina de manera controlada$ Los cromosomas se desnaturali+an mediante calor en solucin salina
Ba!deo Q 5e ti#en los cromosomas con un colorante fluorescente !ue se enla+a preferentemente a :DN a"undante en :T se o"servan mediante fluorescencia U4$ Las "andas fluorescentes indican los mismos se0mentos !ue las "andas 8$
Ba!deo T Identifica un su"0rupo de "andas R !ue est/n concentradas so"re todo en los telmeros$ Las "andas T son las R !ue se ti#eron de manera m/s intensa$
Ba!deo C La t&cnica de 2anda C fue descu"ierta por casualidad ori0inada en un e1perimento en donde :DN sat&lite marcado en ratn fue hi"ridi+ado in situ con cromosomas de ratn$ %n este e1perimento, el :DN del cromosoma fue desnaturali+ado con NaO; renaturali+ado en "uffer 55C$ Los sitios hi"ridi+ados
fueron detectados por autoradio0rafía usando coloracin de 8iemsa para cromosomas$ La prue"a de hi"ridi+acin preferencialmente fue en las re0iones centromericas de los cromosomas$ 5in em"ar0o tam"i&n se not !ue el 8iemsa coloreo otras re0iones en otros cromosomas$ %sta "anda se caracteri+a por te#ir a!uellas re0iones ricas en heterocromatina constitutiva !ue corresponden a secuencias de :DN altamente repetitivas> se encuentran principalmente en centrmero, telmeros :DN sat&lite en ocasiones constricciones secundarias como son los NOR?s$
M(todo" d#!$m#co" 5e aplica so"re las c&lulas en cultivo$ Uno de ellos es a#adir istopos radiactivo, como la timidina tritiada, en un periodo temprano de la replicacin, para !ue se vaa a#adiendo al :DN$ %l resultado es un patrn de "andas de replicacin temprana, !ue suele coincidir con las "andas R$ 5i se hu"iese a#adido la timidina tritiada en un momento tardío de la replicacin, las "andas coincidirian con las 8$
Ba!deo R :l tratar a los cromosomas antes de te#irlos, con calor o productos !uímicos particulares, las "andas claras oscuras !ue aparecen est/n invertidas$ 5i las "andas 8 7 se ti#en mal, entonces el "andeo R se emplea para "rindar un contraste superior, permitiendo así !ue las "andas se lean m/s f/cilmente$ %s la inversa del "andeo C ti#e las re0iones no centrom&ricas, preferi"lemente a los centrmeros$
Ba!da" A)&NOR 5e conoce como "andas :0@NOR a!uella !ue colorea las Re0iones
Or0ani+adoras Nucleares
La Re0in Or0ani+adora Nucleolar es el sitio en donde est/n locali+ados los 0enes de :DNr> el nucleolo est/ compuesto por cinco componentes estructurales, el centro fi"rilar, el componente fi"rilar, el componente 0ranular, el intersticio nucleolar, la cromatina condensada asociada$ %n eucariotas el or0ani+ador nucleolar consiste de múltiples repeticiones arre0ladas en tandem, de las secuencias para :RN@r 'B5 -B5 intercalado con secuencias espaciadoras$ Los espacios pueden ser transcritos, pero su transcripcin nunca inclue un ri"osoma maduro$ Usualmente se refiere a :DN ri"osomal <:DN@r= como una repeticin de 0enes con secciones en tamdem arre0ladas a0rupadas dentro de uno o varias re0iones del set de cromosomas$
H#r#dac#'! )e!'m#ca com*arada +CGH,
La t&cnica de C8; permite el rastreo de dese!uili"rios 0lo"ales presentes en el 0enoma en una única hi"ridacin sin necesidad de o"tener c&lulas en divisin <allionemi col$, '((-=$ ;a sido la primera t&cnica com"inada de cito0en&tica e hi"ridacin in situ fluorescente !ue ha permitido reali+ar un an/lisis 0lo"al del 0enoma$ :un!ue inicialmente se descri"i como una valiosa t&cnica para el an/lisis de dese!uili"rios en el número de copias de :DN en tumores, en la actualidad es de 0ran utilidad para el an/lisis de dese!uili"rios cromosmicos constitucionales a partir de cual!uier tipo de muestra$ 2/sicamente, la t&cnica consiste en marcar los :DNs 0enmicos de la muestra pro"lema de un individuo control con fluorocromos distintos cohi"ridarlos en presencia de :DN Cot@' so"re una preparacin cromosmica de un individuo normal$ Las se#ales fluorescentes son detectadas anali+adas mediante an/lisis di0ital haciendo uso de un soft.are específico$ De este modo podemos anali+ar las re0iones de copia única de cada cromosoma$ : partir del an/lisis de un mínimo
de '*@'- metafases se o"tiene el valor promedio se 0eneran los perfiles de 0anancias$
H#r#dac#'! --#! "#tu-- .luore"ce!te +FISH,
%s una t&cnica cito0en&tica de marca9e de cromosomas mediante la cual se locali+a un determinado fra0mento de la secuencia de los /cidos nucleicos pone de manifiesto la presencia o ausencia de secuencias 0&nicas específicas$ 5e puede aplicar so"re núcleos interf/sicos de e1tensiones celulares o cortes de te9ido o directamente en cromosomas$ La posi"ilidad de poder utili+ar las t&cnicas de I5; so"re c&lulas !ue no est/n dividi&ndose es importante en a!uellas neoplasias con "a9a tasa de divisin celular, como en los síndromes linfoproliferativos crnicos$ %sta t&cnica permite la r/pida determinacin de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la ad9udicacin de un marcador 0en&tico a un cromosoma estos se0mentos de :DN son llamados sondas$ -
Las mol&culas fluorescentes6 son mol&culas !ue son sometidas a un proceso de emisin llamado fluorescencia, en el cual las mol&culas son e1citadas por la a"sorcin de radiacin electroma0n&tica$ Las especies
e1citadas se rela9an al estado fundamental, li"erando su e1ceso de ener0ía en forma de fotones$ Los m&todos de fluorescencia se aplican mucho menos de"ido al número relativamente limitado de sistemas !uímicos !ue se pueden hacer fluorescer$ La "iotina o fluoresceína es una de las mol&culas fluorescentes !ue se utili+a en la t&cnica de I5;$ La t&cnica consiste en preparar cortas secuencias de DN: de una sola he"ra, a las cuales como a hemos visto son llamadas sondas, !ue son complementarias de las secuencias de DN: !ue se !uieren marcar e1aminar$ %stas sondas se HmarcanH con mol&culas fluorescentes !ue a hemos definido anteriormente$ %stas sondas se hi"ridan o unen al DN: complementario , como est/n marcadas con mol&culas fluorescentes, permiten locali+ar las secuencias en las !ue se encuentran$ : diferencia de otras prue"as utili+adas para estudiar los cromosomas !ue re!uieren !ue las c&lulas se encuentren en divisin activa, la hi"ridacin fluorescente in situ puede ser llevada a ca"o en c&lulas no activas$
La FISH ut#l#/a tre" t#*o" de "o!da: •
So!da" de "ecue!c#a 0!#ca +locu" e"*ec1.#co,: estas sondas se hi"ridan a una re0in mu concreta o particular correspondiente a una "anda cromosmica o a un 0en$ %sta sonda es útil cuando se ha aislado una pe!ue#a parte de un 0en se !uiere averi0uar en !u& cromosoma se encuentra$ Con estas sondas podemos visuali+ar alteraciones estructurales o num&ricas tanto en núcleos en interfase como en metafase$ Aodemos detectar la presencia de c&lulas tumorales residuales con una anomalía característica de estirpe o su"tipo, como la t<(>--= en la leucemia mieloide crnica, la t<'>')= !ue afecta al AJLKR:R en la leucemia mieloide a0uda$
•
So!da" al.o#de" o ce!trom(r#ca": son sondas !ue contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas !ue se encuentran en los centrmeros de los cromosomas$ Como pueden utili+arse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta,
con lo !ue se puede averi0uar si un individuo tiene el número correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma e1tra$
•
So!da" *ara cromo"oma" com*leto": son colecciones de sondas de un tama#o reducido, cada una de las cuales se hi"rida a una secuencia diferente a lo lar0o de todo un cromosoma$ Utili+ando estas li"rerías de sondas, se puede marcar todo un cromosoma 0enerando un cariotipo espectral$ De esta manera, se consi0uen im/0enes en color !ue permiten e1aminar los cariotipos de una forma m/s e1acta !ue los tradicionales cariotipos "asados en "andas m/s o menos oscuras$ %sta t&cnica es particularmente útil para e1aminar anormalidades
cromosmicas,
con
estas
sondas podemos
detectar
alteraciones estructurales o num&ricas de los cromosomas, pero slo en c&lulas en metafase$ %s mu útil cuando tenemos cromosomas de mala calidad$
Aara locali+ar las secuencias de inter&s, la sonda de"e hi"ridar con la secuencia de :DN de la muestra$ %l primer paso consiste en desnaturali+ar las mol&culas de :DN
se1uales, tendremos una informacin r/pida del porcenta9e de c&lulas del donante c&lulas residuales del receptor$ La I5;, como complemento de la cito0en&tica convencional, puede ser de utilidad dia0nstica pronstica en el estudio de las neoplasias hematol0icas$ :m"as metodolo0ías tienen limitaciones venta9as$ La cito0en&tica re!uiere !ue las c&lulas del clon neopl/sico se est&n dividiendo$ Cuando los cromosomas son de mala calidad su interpretacin es dudosa$ 5e anali+an pocas c&lulas tiene una "a9a sensi"ilidad$ Aor el contrario la I5; se puede utili+ar so"re núcleos en interfase so"re c&lulas en metafase, pudiendo anali+arse m/s c&lulas !ue con la cito0en&tica, siendo adem/s una t&cnica con maor sensi"ilidad$ La informacin !ue nos aporta la t&cnica de I5; est/ limitada al reordenamiento "uscado, es decir a la sonda utili+ada$ 5in em"ar0o, con la cito0en&tica tenemos informacin de todos los cromosomas$ La t&cnica de I5; tiene un maor coste !ue la cito0en&tica$
A*l#cac#o!e" 2ueno al0unas aplicaciones a se han mencionado anteriormente en el te1to, no o"stante tal ve+ al0unos se mencionaran nuevamente$ %sta t&cnica ha resultado ser mu útil en el campo de la medicina reproductiva, con aplicacin en el dia0nstico 0en&tico preimplantatorio
%ntre las anomalías cromosmicas !ue pueden ser anali+adas, ca"en citarse6
A!omal1a" !um(r#ca": -
Alterac#o!e" e! cromo"oma" "e2uale": :lta frecuencia de mosaicismo en pacientes implica !ue, en muchos casos, slo se den defectos leves en el desarrollo$ 8ran relevancia en Jedicina Reproductiva por ir asociado, en maor o menor 0rado, a pro"lemas de fertilidad$ Tales son los casos de síndrome de linefelter , trisomía F monosomía F$
-
Edad mater!a a3a!/ada4 aorto de re*et#c#'! de cau"a de"co!oc#da 56o .allo de #m*la!tac#'!: J/s de la mitad de los casos son de"idos a alteraciones en los cromosomas 'E, ', 'B, -', --, F e G$ %n estos casos, la seleccin de a!uellos em"riones normales para los cromosomas citados, aumenta las pro"a"ilidades de conse0uir una 0estacin a t&rmino$
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Factor ma"cul#!o )ra3e: Con este estudio em"rionario, se pueden evitar las alteraciones cromosmicas sur0idas en la descendencia de a!uellos 0rupos de pacientes con calidad seminal "a9a !ue tienen !ue recurrir a la t&cnica de microineccin intracitoplasm/tica del espermato+oide
A!omal1a" e"tructurale": 5ur0en espont/neamente, en la maoría de los casos, como consecuencia de un fallo de meiosis durante la oo0&nesis o espermato0&nesis, en los casos en !ue los padres presentan cariotipos normales$ :l0unas veces, al0ún miem"ro de la pare9a puede ser portador de una anomalía estructural e!uili"rada, !ue podría transmitir a su descendencia$ De esta manera, por medio del estudio 0en&tico específico de em"riones de la pare9a portadora, podrían distin0uirse a!uellos em"riones dese!uili"rados cromosmicamente de los e!uili"rados$ Una ve+ hecha esta seleccin de em"riones, podrían transferirse con total tran!uilidad al útero materno los em"riones !ue no presentan la alteracin 0&nica$ Aara detectar translocaciones recíprocas se aplica un I5; en metafase usando sondas telom&ricas centrom&ricas, de
manera !ue la ausencia de una se#al del telmero indica !ue e1iste una translocacin, indistin0ui"le con un I5; en interfase$ Una aplicacin adicional del I5; en interfase es o"tener maor informacin so"re la or0ani+acin de los cromosomas en el núcleo interf/sico
CONCLUI5ON%5
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%l "andeo cromosmico consiste en someter a los cromosomas a desnaturali+acin o di0estin en+im/tica o am"os, se0uido de una tincin con un colorante especifico de :DN, haciendo !ue los cromosomas se ti#an en una serie de "andas, tanto claras como oscuras$ ;a diferentes tipos de "andas6 2andas 7 2andas 8 2andas R 2andas T 2andas C 2andas NOR Las tinciones o m&todos de las "andas son6 2andas 7 tincin con !uinacrina 2andas 8 tincin con 8iemsa 2andas R varios m&todos 2andas T varios m&todos 2andas C tincin con 8iemsaK e1traccin de :DN proteínas$ 2andas NOR tincin con plata <:0=$
Las "andas cromosmicas han permitido formar mapas caracteri+ando especies demostrando !ue cam"ios en estos patrones se pueden e1presar como una mutacin la !ue puede producir la muerte, p&rdida de capacidad reproductiva o 0enerar una enfermedad hereditaria$
2I2LIO8R:I: '$ 3uan Ramon Lacadena$ CITO8%NPTIC:$ 'Q %d$ Jar+o '(($ %DITORI:L COJALUT%N5%$ Jadrid@ %spa#a$
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