Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante Mayén Ávila Stephanie Alejandra Grupo: 405 Sección: A !edesma "orge
Profesor: Shiuru
Aspectos generales de la tecnología del ADN recombinante Al revelar los números métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y transfieren información genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas.
En los
últimos años, se han desarrollado técnicas que han permitido abordar el análisis y la manipulación del A! en una forma antes inimaginada. Este con"unto de técnicas se conoce como tecnolog#a del A! recombinante, nombre que pasa por alto el hecho de que la recombinación del A!, según todas las evidencias, se llevaba a cabo espontáneamente aun antes de que apareciese la primera ameba, mucho antes de la aparición de un primate curioso. $a tecnolog#a del A! recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y función de los genes, especialmente de los genes eucarióticos que eran inaccesibles por otros métodos. Esta tecnolog#a abrió de manera repentina y contundente el camino a una nueva comprensión genética humana, ya que permite el diagnóstico e%acto de muchas de las enfermedades hereditarias y su tratamiento e%itoso en el futuro &. $a tecnolog#a del A! recombinante no se desarrolló rápidamente. e hecho, tiene sus ra#ces en los estudios genéticos de las bacterias. espués de décadas de investigación básica y de una e%tensa acumulación de conocimientos, la tecnolog#a
se
volvió
factible y disponible para muchos
cient#ficos
ahora
utili'an
que estos
métodos. En la tecnolog#a del A! recombinante, los cient#ficos usan en'imas de las bacterias, conocidas como en'imas de restricción, para cortar moléculas de A! sólo en sitios espec#ficos. $as en'imas de restricción permiten a los investigadores cortar el A! en 1
fragmentos mane"ables. (ada fragmento se incorpora entonces en una molécula de vector adecuada, un transportador capa' de transportar el fragmento de A! al interior de una célula. $os bacteriófagos y las moléculas de A! denominadas plásmidos son dos e"emplos de vectores. El A! bacteriano es circular) un plásmido es una molécula de A! circular separada y mucho más pequeña, que puede estar presente y replicarse en el interior de una célula bacteriana. $os investigadores introducen plásmidos en las células bacterianas mediante el método conocido como transformación, la captación de A! foráneo por parte de las células. *ara que la transformación sea eficiente, el investigador altera la célula qu#micamente o por electroporación+descarga de un choque eléctrico+ para que la membrana plasmática sea permeable a las moléculas de A! plasm#dico. na ve' que un plasm#dico entra en una célula, se replica y se distribuye a las células hi"as durante la división celular. (uando un plásmido recombinante se replica de esta manera, se producen muchas
copias
idénticas
foráneo) en otras
palabras,
del
A!
el A!
foráneo se ha clonado -. •
ADN recombinante
na interesante propiedad de los segmentos de A! cortados por una misma restrictasa, es que sus e%tremos asimétricos protuberantes tienen tendencia a pegarse y empare"arse entre s# por puentes de hidrógeno cuando se me'clan. En &/-, habiendo perfeccionado el uso de las restrictasa, fragmentos de genoma modificados, e incluso secuencias de genoma de especies distintas, pudieron ser unidos nuevamente usando otro tipo de catali'ador biológico llamado en'ima A!+ligasa) de este modo, se constituyó as# el primer A! recombinante, un genoma reconstituido artificialmente al conectar fragmentos provenientes de fuentes distintas.
2
esde &/0 se reali'an e%perimentos de recombinación de A! de organismos totalmente
diferentes
1bacterias,
plantas,
animales2. En
&//
cient#ficos
norteamericanos introdu"eron por primera ve' en una bacteria material genético de células humanas, y desde &3- salió a la venta el primer medicamento 1insulina2 producido por manipulación genética. El ser humano ya cuenta con el potencial de transformar la información hereditaria de cualquier ser vivo, de acuerdo con una idea o patrón preestablecido, ra'ón por la cual a esta área se le llama ingenier#a genética y tiene una infinidad de aplicaciones. $a 4écnica del A! recombinante permite5
(ortar Aislar *egar 6eproducir 7ecuenciar fragmentos espec#ficos de A! y obtenerlo en cantidades ilimitadas con los genes que se deseen
Este A! se incorpora a la célula de otro organismo 1bacteria, hongo, planta o animal2 para 8e%presar9 la información formada por la unión de segmentos de A! de origen diferente. Esta técnica se presenta en etapas, las cuales son5
Corte especifico del ADN: en fragmentos pequeños mediante en'imas de restricción que reconocen una secuencia espec#fica de nucleótidos y cortan en ese punto cada una de las cadenas de A!. $os e%tremos quedan libres y pueden unrse a otros fragmentos de A! que hayan
sido cortados por la misma en'ima de restricción. Clonación del ADN: consiste en que de un fragmento de A! se obtienen miles de copias idénticas. $o primero que hay que hacer es obtener una molécula de A! recombinante que se desea clonar y un 3
vector de clonación. $os vectores de clonado son agentes capaces de introducir y unir mediante en'imas ligasas fragmentos en las células portadoras, los cuales se requieren para su recombinación 0.
Enzimas de restricción En &/: se descubrió un nuevo tipo de en'ima, llamada en'ima de restricción o restrictasa. $as restrictasas se descubrieron en bacterias, y son moléculas capaces de reconocer una determinada secuencia de A! 1llamada diana de reconocimiento2 y de cortar ambas cadenas en lugares concretos) de esta forma, por primera ve' en la historia, las secuencias de cada gen pudieron ser anali'adas por separado, ofreciendo a los cient#ficos la posibilidad de estudiar y en su caso manipular de forma directa la información genética. 7e conocen ya cientos de en'imas
de restricción capaces de cortar, aislar e incluso modificar fragmentos de
A!
de
diferentes
tamaños, ya que cada una es espec#fica determinada sentido
para
una
secuencia)
estricto,
se
en
podr#a
decir que el descubrimiento de estas en'imas permitió el arranque de la ingenier#a genética. $a tecnolog#a de las restrictasas es una de las más poderosas herramientas con que cuenta la ingenier#a genética en la actualidad. Estas ti"eras moleculares selectivas cortan el A! en secuencias concretas conocidas como palindrómicas+ es decir, que en ambas cadenas se encuentran las mismas bases pero en secuencia inversa complementaria2, que generalmente comprenden de ; a &: pares de bases, segmentos más fácilmente manipulables que posteriormente pueden ser reinsertados en una cadena, concretando asó la tecnolog#a del A! recombinante;.
Vectores: 4
Plásmidos como vectores. $os plásmidos presentan las cuatro caracter#sticas de un vector útil. *rimero, son pequeños,
como son tan pequeños, muchos
plásmidos tienen sólo una secuencia de reconocimiento para una en'ima de restricción dada. (uando una en'ima de restricción corta un plásmido de este tipo, lo transforma en una molécula lineal con e%tremos cohesivos. $os e%tremos cohesivos de otro fragmento de A! cortado con la misma en'ima de restricción se pueden aparear con los e%tremos cohesivos del plásmido, lo que genera un plásmido circular que contiene el A! nuevo en una locali'ación conocida. Virus como vectores. A menudo, se utili'an virus procariontes y eucariontes como vectores de A! eucarionte. $os virus al infectar naturalmente a la células, ofrecen una gran venta"a respecto de los plásmidos, que suelen requerir medos artificiales para inducirlos a ingresar en las células hospedadoras. Cromosomas artificiales como vectores. $os plásmidos bacterianos no son buenos vectores para hospedadores eucariontes como las levaduras, porque las secuencias de A! procariontes y eucariontes utili'an diferentes or#genes de replicación. *ara solucionar este problema, los cient#ficos han creado un 8cromosoma minimalista9 denominado cromosoma de levadura artificial. Esta molécula de A! artificial no sólo contiene el origen de replicación de la levadura, sino también las secuencias centroméricas y teloméricas, lo que lo convierte en un verdadero cromosoma eucarionte. Plásmidos como vectores para plantas. n vector importante para transportar A! nuevo a muchos tipos de plantas es un plásmido hallado en Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria vive en el suelo y causa una enfermedad de las plantas denominada agalla de la corona, que se caracteri'a por la presencia de e%crecencias, o tumores, en la planta <.
Unión de la secuencia ADN 5
*ara poder soldar fragmentos de A! obtenidos con restrictasas, sus e%tremos han de ser complementarios entre s# para que puedan formarse los puentes de hidrógeno entre bases complementarias. 7e descubrió que la mayor#a de las terminaciones de los fragmentos generados con restrictasas eran cohesivos, lo que permit#a una unión por complementariedad de bases. En este hecho se basan casi todos los procedimientos de clonación genética. $o que se hace es cortar con el mismo en'ima de restricción, tanto en el A! que se desea insertar en una célula como el A! del vector, que actuará como un ta%i para llevarlo hasta el cromosoma hospedador del fragmento foráneo de A!. *osteriormente, se me'clan las moléculas cortadas, ba"o unas condiciones que favore'can el alineamiento de las cadenas complementarias. As# es posible formar fragmentos en c#rculo formados por un vector tipo plásmido y el A! e%traño que desea introducir en una célula =. •
Biotecnología
$a biotecnolog#a es la utili'ación de células vivas para producir materiales útiles
para
alimentos,
las
personas,
fármacos
y
como
sustancias
qu#micas. $a posibilidad de insertar casi cualquier gen en bacterias o levaduras, "unto con los métodos para inducir el gen que fabrica su producto en grandes cantidades y lo e%porta de las células, ha convertido a estos microbios en fábricas versátiles de importantes productos. $a clave de esta e%plosión biotecnológica ha sido el desarrollo de vectores especiali'ados que no sólo transportan genes al interior de las células, sino que hacen que ellas los e%presen en altos niveles <.
6
Transgénicos: Plantas transgénicas. 7e obtienen de la forma siguiente5 7e obtiene el segmento de A! deseado. 7e introduce en un vector bacteriano) generalmente se usa Agrobacterium tumefasciens, que es una bacteria que ocasiona
tumores en las plantas. 7e infecta la planta con la bacteria. El A! de la bacteria se une con el A! de la planta y se producen
células transgénicas. Estas células transgénicas se cultivan y se multiplican en el
laboratorio. 7e obtienen nuevas plántulas a partir de células transgénicas. 7e trasplantan las nuevas plantas transgénicas para cultivos agr#colas.
Animales transgénicos. $os animales transgénicos tienen en sus células algún gen de otro organismo, llamado transgén, elaborado mediante la técnica del A! recombinante. Este gen debe llevar, además, secuencias reguladoras que permitan la e%presión del gen deseado) el transgén se inserta por microinyección en el óvulo fecundado o por transformación in vitro de células madre e%tra#das del embrión. Terapia génica: $a
terapia
génica
es
un
proceso
mediante el cual se inserta material genético en células afectadas a fin de reempla'ar genes defectuosos y corregir el daño que han causado al organismo, o dotar a las células de una nueva función que cubra las deficiencias en un
7
te"ido. En términos simples, la terapia génica busca eliminar las causas de la enfermad en ve' de aminorar los s#ntomas. $a terapia genética para transferir los genes usa varios veh#culos de origen viral o no viral llamados vectores. $a transferencia por un vector viral se conoce como transducción, mientras que la transferencia de genes por un vector no viral se llama transfección. >ormas de terapia génica)
Terapia génica en células somáticas. ?odifica la dotación genética de todas las células que no son se%uales, es decir, sólo a nivel de te"ido u órgano que sean transfectados. 7e reali'a mediante una inyección directa, e%tirpación previa del te"ido o mediante descendencia del paciente y sólo se permite su uso para estudios en donde se requiera potenciar algún carácter,
como la altura o el color, y no tratar ningún tipo de enfermedad. Terapia génica de células germinales o sexuales. @a dirigida a modificar la dotación genética de óvulos y espermato'oides, lo cual origina un cambio permanente en el individuo y su descendencia, e intenta corregir patolog#as congénitas. $a terapia génica se puede clasificar en terapia génica in vivo y en terapia génica e% vivo5 Terapia génica in vivo: $as células humanas se e%traen del paciente y se cultivan. 7e preparan los vectores del gen terapéutico y se introducen en las células cultivadas del paciente. As# se obtienen células modificadas que e%presan el gen terapéutico requerido para que se desarrollen su función normal. *or último, las células modificadas se transfectan al paciente. Terapia génica ex vivo: Esta terapia consiste en introducir directamente el gen requerido en sangre y ah# llega a las células blancas, también puede introducirse directamente en el te"ido u órgano afectado 0.
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Clonación: $a clonación es una técnica
fundamental
para la biotecnolog#a pues se puede clonar un gene, una célula o un
organismo
completo. (uando una célula se divide por mitosis, cuando un organismo se produce ase%ualmente e incluso cuando un embrión se divide formando dos, se puede decir que se trata de casos de clonación. $a clonación de animales y la que se utili'a para clonar lina"es de células madre se reali'a mediante una técnica muy distinta. (onsiste en reempla'ar el núcleo de una célula madre o de un óvulo con el núcleo de una célula somática adulta diferenciada, de manera que este nuevo núcleo reprograme a la célula huésped, y la convirtiera en una célula del te"ido que queremos producir, o en un cigoto h#brido, respectivamente ;.
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