IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS EN PLANTAS DE Aloe vera CULTIVADAS CULTIVADAS EN MUNICIPIOS DE RISARALDA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
MARIA FERLLEY VÉLEZ SERNA NATHALY VILLA PULGARÍN
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA QUÍMICA INDUSTRIAL PEREIRA 2012
RESUMEN Se realizó la identificación identificación de antraquinonas y cromonas presentes en acíbar y gel de Aloe vera en las fincas La Magdalena en Mistrató, Pite tierra en Santuario, La Esperanza en Belén de Umbría, La Aurora en Marsella y La Palma en Pereira en el corregimiento de La Florida ubicados en el departamento de Risaralda. Se implemento un método de secado del gel con el fin de concentrar el contenido total de antraquinonas y cromonas. La identificación y cuantificación se llevo a cabo mediante la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (CLAE) en fase reversa usando detector UV-Vis y para la obtención de espectros UV se usó detector DAD; el método empleado para el análisis de las antraquinonas y cromonas es precisa, exacta, reproducible y adecuada para el análisis de muestras de Aloe vera. Se encontraron diferencias significativas en cuanto al contenido de antraquinonas y cromonas haciendo uso del software InfoStat mediante el análisis de varianza ANOVA y el análisis de conglomerados. conglomerado s. El mayor contenido de estos metabolitos se encontró en la finca La Palma en La Florida en acíbar y gel, las fincas La Magdalena en Mistrató y La Aurora en Marsella presentaron contenidos similares e intermedios, mientras que en la finca Pite tierra en Santuario se encontró el menor contenido de antraquinonas y cromonas, estos resultados aporta a los productores de Aloe vera en el departamento información para darle uso comercial a sus plantas de acuerdo al contenido de estos metabolitos.
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1. JUSTIFICACIÓN
Durante los últimos treinta años se han emprendido en diferentes partes del mundo programas dedicados a la investigación de Aloe vera, debido a sus propiedades terapéuticas, nutricionales y cosméticas. A nivel mundial el mercado crece continuamente, debido a que el mucílago y el acíbar extraídos de este vegetal son productos cada vez mas apetecidos por la industria alimenticia, farmacéutica y cosmética [1]. En Estados Unidos, la mayor parte de Aloe vera es cultivada en el Valle de Río Grande al sur de Texas, en Florida y al sur de California. Internacionalmente, el aloe se puede encontrar en México, en los países a lo largo del pacífico, la India, América del d el sur, sur , América central, el Caribe, África y Australia. Los mercados mer cados más atractivos para productos de Aloe vera son los Estados Unidos, Francia, Reino Unido, Alemania, Italia, Canadá, Japón, España, Suecia y Corea [2]. En Latinoamérica la gran producción de cultivos de Aloe vera se da en México, seguido por República Dominica y Venezuela. En Colombia los cultivos de Aloe vera, se encuentran repartidos en diferentes departamentos, siendo de mayor participación los departamentos de atlántico y magdalena, El eje cafetero no tiene una participación considerable dentro de las estadísticas nacionales ya que sus cultivos son menores al 5%; esto debido a que la planta se introdujo a la región en el 2004 [3]. En la región cafetera con el ánimo de aprovechar las bondades del clima y la excelente calidad de sus suelos y a su vez como un fin social para dar una nueva alternativa a los cultivadores se ha implementado el cultivo del Aloe vera en los departamentos de Risaralda y Quindío [4]. [4 ]. En la planta de Aloe vera se pueden encontrar diversos componentes como agua, enzimas, vitaminas, minerales, aminoácidos, azúcares y antraquinonas [5]. Las antraquinonas son muy estudiadas debido a que otorgan propiedades curativas, laxantes, entre otras, a las plantas en las que se encuentran presentes. Estos metabolitos secundarios son de gran importancia debido a que actúan en la planta como mecanismo de defensa; es decir, son una respuesta al medio, el cual incide en su contenido tanto en el gel como en el acíbar.
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En la región se han realizado diversos estudios de caracterización del Aloe vera; en cuanto a antraquinonas se desarrollo un trabajo para dar cumplimiento a lo exigido por el INVIMA quien es el ente dedicado al control y vigilancia en la calidad y seguridad de los productos farmacéuticos y alimenticios; el cual pide que el análisis sea realizado por medio de la técnica fotométrica; sin embargo con este método solo se conoce el contenido total de antraquinonas. Teniendo en cuenta la importancia de estos compuestos en la planta y por sus diferentes aplicaciones, se considera necesario realizar un estudio que permita cualificar y cuantificar los diferentes isómeros de antraquinonas mediante técnica cromatográfica que brinde mayor información y permita establecer diferencias entre los cultivos de las zonas de la región cafetera y su posible aplicación.
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2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL Realizar el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas presentes en las hojas de Aloe vera procedentes de diferentes municipios del departamento de Risaralda, mediante la técnica de cromatografía líquida de alta eficiencia, con el fin de ampliar la información de los cultivos en la región. 2.2.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Desarrollar una técnica de cromatografía líquida de alta eficiencia para cualificar y cuantificar isómeros de antraquinonas y cromonas. Cualificar los principales isómeros de antraquinonas y cromonas presentes en hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda. Cuantificar los principales isómeros de antraquinonas y cromonas presentes en hojas de Aloe vera cultivados en diferentes municipios de Risaralda. Determinar el contenido de antraquinonas totales en plantas de Aloe vera procedentes de uno de los municipios de estudio empleando la técnica espectrofotométrica según el requerimiento de INVIMA y compararlo con el establecido por la técnica de cromatografía liquida de alta eficiencia en este estudio.
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3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Colombia, existen cultivos de Aloe vera localizados en varios departamentos. En la región cafetera se inició el cultivo en el 2004, sin embargo se importa materia prima para la elaboración de productos a base de Aloe vera. Desde su establecimiento en la región se han realizado diferentes estudios sobre su adaptación, plagas y suelos, pero no sobre sus características químicas generando esto una carencia de soporte técnico para productores y procesadores de Aloe vera. Se plantea el estudio comparativo del contenido de antraquinonas y cromonas presentes en los cultivos de Aloe vera en el departamento de Risaralda, por el método de cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE), para ampliar el conocimiento de la composición química del Aloe vera cultivado en Risaralda. ¿Será posible mediante el análisis cualitativo y cuantitativo de antraquinonas por CLAE establecer diferencias o similitudes entre plantas de Aloe vera cultivadas en diferentes municipios de Risaralda y así contribuir al mejor aprovechamiento de esta materia prima?
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Tabla 8. Composición química del mucilago de Aloe vera COMPONENTES
s e r a c ú z A
Vitaminas
Vitamina A, B1, B2, B5, trazas de B12, C, E, ácido fólico, colina Niacina [5].
Enzimas
Lipasa, amilasa, catalasa, oxidasa, fosfatasa alcalina [5].
Minerales
Calcio, potasio, cloro, hierro, zinc, cobre, azufre, sodio, cromo, manganeso, aluminio, magnesio y germanio [38].
Polisacáridos
Monosacáridos
Aminoácidos
s o c i l ó n e f s o t s e u p m o C
Fructosa, aloérido, celulosa, glucomananos neutros, galactogalacturonanos, glucogalactomananos, arabinosa, entre otros. Glucosa, manosa, xilosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y ácidos urónicos. Lisina, valina, cisteína, glicina, fenilalanina, metionina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina y serina [5]
CARACTERISTICAS Al igual que otros vegetales, el Aloe vera es rico en vitaminas y tiene un bajo contenido de grasa y alto en fibra, que son responsables de sus usos terapéuticos y propiedades funcionales como antioxidante [37]. La catalasa integra parte del sistema antioxidante y es importante ya que su función es destruir el H 2O2 generado durante el metabolismo celular [28]. Actúan como biocatalizadores que permiten la transformación química de sustratos, a partir de los cuales se producen los diferentes componentes necesarios para los procesos vitales [39]. Se ha demostrado que los polisacáridos, contribuyen a la actividad farmacológica en la estimulación de la proliferación celular y en actividades biológicas como anti -inflamatorias, antivirales, inmunomoduladoras, anti-ulcerativas, desinfectante, cicatrizante y como antioxidadante [25, 33, 40, 41] El Aloe vera proporciona 20 de los 22 aminoácidos requeridos por el cuerpo humano y 7 de los 8 aminoácidos esenciales que el cuerpo no sintetiza [5, 13]
Aloína, aloe emodina, 4Derivados Hidroxialoína, 5- Ejercen una amplia gama de actividades como: antifúngico, hidroxiantracénicos hidroxialoína, aloinósidos A y biológicas antimicrobiano, anticancerígeno y B. antioxidante [42]. Funcionan como analgésicos y poseen potentes Aloesina, aloeninas A y B, propiedades antibióticas, tanto para Derivados aloeresina A y B, 8-C- virus como para bacterias [5] cromónicos glucosil-7-o-metil-(s)aloesil.
5.1.7. Estudios sobre diferentes aplicaciones del Alo e vera. Debido a la gran cantidad de metabolitos secundarios que posee la planta y a sus múltiples aplicaciones se han realizado diversos estudios a nivel nacional e internacional, algunos de estos estudios se presentan en las tablas 9 y 10.
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Tabla 9. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera PA S
a i b 1 1 m o 0 l 2 o C
a í u 1 1 q r 0 u 2 T
a i b 9 0 m o 0 l 2 o C
ESTUDIO
Estabilización del gel de Aloe barbadensis Miller y disminución de su concentración.
Composición química y aplicaciones del Aloe vera
Conservacion de fresa (fragaria x ananassa
OBJETIVO
Disminución de la concentración de aloina y aloe-emodina por adsorción en columna con carbón activado
Revisar la historia, sus productos químicos, el uso medico, morfología vegetal, extractos y agronomía de Aloe vera.
RESULTADOS Se evidencia la poca influencia del proceso de estabilización en el contenido de aloe-emodina en el gel de Aloe, como si ocurre en el caso de la aloína. Se muestra la eficacia de la técnica propuesta para la estabilización del gel de Aloe Miller, con barbadensis concentraciones de aloína en solución permitdas por el Aloe Science Council [43]. Los extractos de Aloe vera son ampliamente utilizados en alimentos, cosméticos, salud, cuidado de la piel e industria medica. La administración de alimentos y fármacos de EE.UU. ha aprobado el estudio del desarrollo de Aloe vera en el tratamiento del cáncer y el SIDA. En el futuro se requieren estudios controlados para probar la eficacia del Aloe vera en distintas condiciones [44].
Obtener un recubrimiento comestible a partir del gel de Aloe vera para prolongar la vida útil de las fresas.
Se logro aumentar la vida útil de las fresas frescas en 10 días, disminuyendo las pérdidas de humedad [45].
Resaltar los efectos descubiertos recientemente y aplicaciones del gel de la hoja.
Las diferencias en la composición de la planta debido a la ubicación geográfica, así como las diferencias en los métodos de extracción de gel y técnicas de preparación de muestras, han contribuido a las discrepancias en los resultados obtenidos en numerosos estudios en términos de la composición química y la actividad biológica del gel de Aloe vera [46].
Aislar la resina del Aloe vera, y determinar su de zonas semiáridas de acción inhibidora de Falcón Venezuela, como corrosión en el acero. inhibidores de corrosión
Se aislaron y caracterizaron tres grupos de compuestos de antraquinonas responsables de la actividad inhibidora [47].
Determinar el efecto citoprotector del gel de Aloe vera sobre la mucosa gástrica y compararla con la del sucralfato en animales de experimentación.
El tratamiento con Aloe vera redujo significativamente el porcentaje de área hemorrágica con respecto al grupo control. Respecto a la profundidad de lesión, no existen diferencias significativas entre los valores promedios del grupo sucralfato y el grupo Aloe vera [48].
duch cv. camarosa)
mediante la aplicación de recubrimientos comestibles de mucílago de Aloe barbadensis Miller.
a c i r 8 f á 0 0 d 2 u S
l e 8 u 0 z 0 e 2 n e a V
7 0 0 2 ú r e P
Composición y aplicaciones del gel de la hoja de Aloe vera
Antraquinonas en Aloe
vera barbadensis Miller
Efecto protector del Aloe vera (sábila) en lesiones gástricas inducidas con etanol en ratas.
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Tabla 10. Estudios sobre diversas aplicaciones del Aloe vera PA S
ESTUDIO
OBJETIVO
6 0 0 2 a b u C
Gel de Aloe vera (L). N.L. Burm. y harina de Sagú como soporte sólido de medio de cultivo para plantas medicinales
a 3 e r 0 o 0 K 2
Revisión de la relación entre los componentes del Aloe vera y sus efectos biológicos
RESULTADOS
Estudiar el comportamiento del gel Se demostró que es posible la de Aloe vera y harina sustitución total o parcial del agar de sagú, como soporte solido del medio de empleado tradicionalmente, se cultivo de plantas logra un beneficio económico[49] medicinales Establecer la relación A la luz de muchas actividades entre los componentes farmacológicas de los componentes del Aloe vera y sus de Aloe vera, cada componente efectos sobre la base activo tiene varios factores de de los informes interacción, cada uno de los cuales publicados y otros puede ser afectado por otra sustancia hallazgos recientes. [5].
5.2. COMPUESTOS FENÓLICOS 5.2.1. Definición. Los compuestos fenólicos constituyen una de las familias más numerosas y ampliamente distribuidas en el reino vegetal, con más de 8000 estructuras actualmente conocidas. Estos compuestos han sido de interés porque son esenciales para la fisiología y la morfología de las plantas. Están involucrados en el crecimiento y la reproducción, y confieren resistencia a las plantas frente a agentes patógenos y depredadores [50]. Tienen un anillo aromático en común con uno o más grupos hidroxilos. Estos compuestos pueden ser divididos en varios grupos de acuerdo con su estructura química básica [50]. 5.2.2. Clasificación de los compuestos fenólicos. En la tabla 11 se puede observar la clasificación de los principales compuestos fenólicos de acuerdo con su estructura química. Tabla 11. Clasificación de los compuestos fenólicos [50] Estructura carbonada C6 C6-C1 C6-C2 C6-C3 C6-C4 C6-C1-C6 C6-C2-C6 C6-C3-C6 (C6-C3)2 (C6-C3-C6)2 (C6-C3)n (C6)n (C6-C3-C6)n
Clasificación Fenoles simples, benzoquinonas Acidos fenólicos Acido feniacetico, acetofenoles Acido hidroxicinamico, polipropano, cumarina, isocumarina Naftoquinona Xantanos Antraquinona, estilbeno Flavonoides, isoflavonas Lignanos, neolignano Bioflavonoides Ligninas Melanoidinas Taninos
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5.2.3. Antraquinonas. Entre los compuestos fenólicos caben destacar las antraquinonas, que son por mucho el grupo más amplio de las quinonas naturales y son la base y fuente de una importante cantidad de colorantes [51]; además son una clase de metabolitos secundarios vegetales con una funcionalidad p-quinoide en un núcleo antracénico [52]. 5.2.3.1. Definición y estructura. Las antraquinonas tienen dos grupos ceto-, su mayoría en posición 9,10 (ver figura 5). La antraquinona basal (9,10 dioxoantraceno), puede ser sustituida de varias formas, resultando en una gran diversidad de estructuras [53]. Exhibiendo numerosas actividades biológicas que los hacen buenos candidatos para nuevas investigaciones biológicas o farmacológicas, entre otras aplicaciones [54]. O 8 7
1 2
9 10
6
3 4
5 O
Figura 5. Estructura general de las antraquinonas 5.2.3.2. Propiedades generales de las antraquinonas Las agliconas antraquinónicas son compuestos sólidos, cuyo color va desde el amarillo al pardo rojizo. Son solubles en solventes orgánicos: Éter, cloroformo, alcohol caliente, benceno. Los glucósidos antraquinónicos son cristalizados, estas tienen un color más pálido que la aglicona correspondiente y son solubles en agua caliente y soluciones hidroalcohólicas. 5.2.3.3. Funciones de las antraquinonas. Se ha reportado que las antraquinonas ejercen una amplia gama de actividades biológicas incluyendo antifúngico, antimicrobiano, anticancerígeno y antioxidante [42]. Funcionan como analgésicos y poseen potentes propiedades antibióticas, tanto para virus como para bacterias [55]. 5.2.3.4. Fuentes de las antraquinonas. Las antraquinonas están ampliamente distribuidas en microorganismos, plantas, equinodermos e insectos. Las familias vegetales más ricas en compuestos antracénicos son las rubiáceas, las 32
ramnáceas y las poligonáceas; y en una menor proporción las liliáceas, leguminosas, bignoniáceas, melastomatáceas, droseráceas, vismiáceas, etc. En las plantas inferiores como los líquenes se conoce una gran variedad de antraquinonas, incluyendo antraquinonas halogenadas. Estas sustancias pueden encontrarse en diferentes partes de la planta como hojas, tallos, madera y frutos; se les encuentra principalmente en forma de glicósidos y en menor proporción en forma libre o agliconas. Sus componentes más importantes y activos son los derivados hidroxiantracénicos (15 – 40%) como la antraquinona glicosidada aloína A y B; aloinósido A y B y 5hidroxialoína [13].
5.2.4. Aloína. Es un liquido amarillo de sabor amargo, considerada el compuesto antraquinónico más importante del Aloe vera, es una antrona-C-glucósido con nombre IUPAC 10-glucopiranosil-1,8-dihidroxi-3-(hidroximethil)-9(10H)antracenona, también conocida como barbaloína, está presente en las hojas de especies de aloe, su contenido varía desde la estación, la especie y la edad de la hoja. Varios estudios indican un contenido entre 10 - 25% del peso seco de exudado de las hojas [56]. La aloína se produce de forma natural como una mezcla de diastereisómeros, aloína A (Ajuste a C 10, C1,: S, S) y aloína B (en la configuración C 10, C1,: R, S) como se observa en la figura 6; que difieren unos de otros solamente en la configuración en el carbono 10 (C-10) en la molécula de antrona aloe-emodina [56]. OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
H
H OH
HO
H H
H O
H
H
OH
OH
OH
H O
H
O
H
HO
OH
H H
Aloína A
OH Aloína B
Figura 6. Estructura de la Aloína A y B 33
5.2.4.1. Funciones de la aloína. La aloína es el principal componente de una sustancia amarilla que la planta de Aloe vera secreta como defensa para alejar a posibles depredadores por su olor y sabor desagradables. También parece intervenir en el proceso de control de la evapotranspiración en condiciones de elevada insolación y sequía. Esta antraquinona es un veneno, laxante y abortivo [57]. Con efecto catártico, además tiene aplicaciones dermatológicas, ya que es un potente compuesto anti-malarico, antifungico, con propiedades antibacterianas y antivirales [58]. Se utiliza en preparados farmacéuticos produciendo en ocasiones alergias a personas sensibles y en la legislación europea se admite como máximo un 0,1 % y Está completamente prohibida la presencia de aloína en productos alimentarios [57]. 5.2.5. Cromonas 5.2.5.1. Definición y estructura general. Las cromonas son un grupo de compuestos de origen natural muy abundantes; especialmente en las plantas. Son compuestos heterocíclicos que contienen oxigeno con un anillo benzo- γ-pirona como se observa en la figura 7 [59]. Dentro de ellas podemos encontrar la aloesina, también denominada aloeresina B y la aloeresina A [56]. O
O
Figura 7. Estructura general de las cromonas 5.2.5.2. Funciones. Las moléculas que tiene estructura de cromona tienen un amplio rango de actividades biológicas; son componentes bio-activos en fuentes naturales, se utilizan como anti-inflamatorios y antibióticos [28]. 5.2.5.3. Fuentes. Como se había mencionado anteriormente las cromonas se encuentran en la naturaleza distribuida en hongos como: Aspergillus, nigers , líquenes como: Roccella fuciformis D.C. y plantas superiores como: Cassia obtusifolia y Aloe vera [60]. 5.2.6. Aloeresina A. Segundo componente del Aloe vera Similar a la aloína, la aloeresina tiene un azúcar C-glicosídico como se aprecia en la figura 8. El enlace carbono-carbono que une al azúcar aglicona es muy fuerte. La cromona se
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distribuye a lo largo del género, se presenta en aproximadamente el 40% de las especies ya examinadas [56].
Figura 8. Estructura de la Aloeresina A 5.2.6.1. Actividad biológica. Tiene propiedades antioxidantes y propiedades antiinflamatorias, tópicamente puede absorber la luz ultravioleta [38]. Este compuesto tiene actividad inhibidora sobre la enzima tirosinasa. que cataliza la conversión de tirosina en dopaquinona, y la cual es una subsecuente polimerización a la melanina; por lo tanto, reduce la formación de melanina y cualquier tendencia a la hiperpigmentación [56]. 5.2.7. Extracción de antraquinonas. Existen varios métodos de extracción para antraquinonas, los procedimientos usados para el aislamiento de estas sustancias dependen del tipo de núcleo de interés, es decir si se desea obtener las agliconas, los glicósidos, las formas reducidas o las formas oxidadas. La agliconas presentes en la muestra vegetal se extraen con solventes poco polares como éter etílico o benceno. Los compuestos glicosídicos se extraen ya sea con etanol, agua o mezclas de etanol-agua [52]. Los métodos de extracción empleados son los siguientes:
Extracción Soxhlet. Esta extracción se lleva a cabo usando un disolvente orgánico, el cual refluye a través de la muestra contenida en un dedal poroso de celulosa o vidrio. Las ventajas mas importantes son el contacto continuo de la muestra con disolvente fresco, simplicidad, bajo coste de adquisición y la posibilidad de procesar grandes cantidades de muestra; sus limitaciones son: el tiempo necesario para la extracción, y los volúmenes de disolvente, en general
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muy elevados frente a la extracción con otras técnicas lo que implica la necesidad de concentrar los extractos orgánicos obtenidos [61].
Extracción por ultrasonido. Es una técnica sencilla de extracción sólidolíquido, en donde la muestra se pone en contacto con un disolvente adecuado y se somete a los ultrasonidos generados en un baño de agua o por una sonda de ultrasonidos. De este modo, se produce la agitación continua de la matriz con el disolvente orgánico. El efecto mecánico de los ultrasonidos provoca una mayor penetración del disolvente en los materiales sólidos, facilitando la transferencia de los analitos de la matriz al disolvente. La elección del disolvente es esencial para que el método permita obtener elevadas recuperaciones de los analitos de interés [61]. 5.3. TÉCNICA DE ANÁLISIS Para la cuantificación de antraquinonas se han utilizado diferentes métodos instrumentales, entre ellos el espectrofotométrico, esta es una técnica que permite cuantificar las antraquinonas totales presentes en la matriz a analizar. Los métodos cromatográficos permiten una identificación más específica de estos analitos, como por ejemplo los isómeros A y B de la Aloína, en esta técnica no se requiere la preparación de derivados como en la espectrofotométrica, permitiendo así la lectura de los compuestos en la región ultravioleta (UV) [42]. Existen otros métodos que han sido reportados para la identificación y cuantificación de derivados de antraquinonas en extractos de plantas como cromatografía en contracorriente de alta velocidad (HSCCC), cromatografía electrocinética micelar (MEC), electroforesis capilar de zona, cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HPTLC) [62].
5.3.1. Cromatografía. La cromatografía es un procedimiento de separación de los constituyentes de una mezcla. Se ha convertido en un método analítico de primer orden para identificar y cuantificar los compuestos de una fase liquida o gaseosa homogénea. Se fundamenta en los equilibrios de concentración de los compuestos presentes entre dos fases no miscibles de la que una llamada estacionaria, esta inmovilizada en una columna o fija sobre un soporte y la otra, llamada móvil, se desplaza al contacto de la primera. La elución a velocidades diferentes de los compuestos presentes conduce a su separación [63]. 5.3.2. Clasificación de las técnicas cromatográficas. Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse según la naturaleza física de las fases, el 36
procedimiento utilizado o el fenómeno físico-químico. A continuación se realiza una breve descripción de las diferentes técnicas según la naturaleza de las fases involucradas [63] Cromatografía plana. Cromatografía en capa delgada. Es una técnica de adsorción sólido-líquido que cuenta con la capacidad de separar varias muestras simultáneamente en una sola placa de vidrio revestida con una capa delgada adherente de partículas finamente divididas. La fase móvil se desplaza por la fase estacionar por acción capilar [64, 65].
Cromatografía en papel. El papel cromatográfico se fabrica de celulosa pura y con un estricto control de porosidad y grosor. El papel contiene suficiente agua adsorbida para que constituya la fase estacionaria acuosa. La fase móvil es un solvente orgánico saturado en agua [65]. Cromatografía en columna. Como fase estacionaria (adsorbente) se usa, generalmente, sílice o alúmina contenida en una columna y la fase móvil pasa a través de la columna por medio de los espacios abiertos entre las partículas del material de relleno. La elución implica la purificación de una especie por lavado mediante adición continua de solvente nuevo [65]. Cromatografía gaseosa. Es una técnica donde el analito se hace pasar en forma gaseosa a través de la columna, arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamado gas portador [66]. Cromatografía de adsorción gas-solido. Se basa en una fase estacionaria sólida en la cual la retención de los analitos ocurre por adsorción, es útil para la separación de especies que no se retienen en columnas de gas-líquido; esta cromatografía se lleva a cabo tanto en columnas de relleno como en columnas tubulares abiertas [65]. Cromatografía de partición gas-liquido. En esta técnica el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida sobre la superficie de una relleno sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar [65]. En la figura 9 se observa un esquema de las técnicas cromatográficas existentes.
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Cromatografía Capa delgada Cromatografía Plana Cromatografía de papel
Clasificación técnicas cormatogáficas
Cromatografía de Gases F.M: Gaseosa
Cromatografía en Columna
Gas-Sólido
Gas-Líquida
Líquida-Sólida
Cromatografía Líquida F.M: Líquida
Líquida-Líquida
Cromatografía líquida de alta eficiencia
Intercambio Iónico Exclusión Molecular
Figura 9. Esquema de clasificación de las técnicas cromatográficas 5.3.3. Cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) La cromatografía liquida se basa en la combinación de un alto intervalo de posibles propiedades de la fase móvil, junto con la elección de numerosos tipos de fases estacionarias, significativamente diferentes, así como una amplia variedad de detectores [67]. En la CLAE el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar se inyecta en pequeñas cantidades y sus componentes eluyen diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que pasan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de su naturaleza, afinidad hacia la fase estacionaria y fase móvil; y la composición de las mismas [67, 68] 5.3.3.1. Tipos de separación por cromatografía liquida. En CLAE el método dominante es la cromatografía de fase ligada que puede clasificarse en fase normal (NP-BPC) y fase reversa de acuerdo a la polaridad relativa de la fase móvil y de los grupos funcionales químicamente ligados a la matriz [69].
38
Cromatografía de fase normal. En esta cromatografía la fase estacionaria es polar, utilizándose rellenos en los que R en la estructura del siloxano puede ser un grupo ciano (-C2H4CN), diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH), AMINO (-C3H6NH2) y dimetilamino (-C3H6N(CH3)2); La elución se lleva a cabo con solventes no polares como etiléter, cloroformo o n-hexano. El componente menos polar eluye primero, debido a que es el más soluble en la fase móvil, y un aumento de la polaridad de ésta hace disminuir el tiempo de elución [70]. Cromatografía en fase reversa. En esta técnica la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil. La columna esta rellena de partículas de sílicagel unidas a cadenas C18 como Octadecilsilano (fase estacionaria más utilizada); a cadenas C8 octilsilano, ciclohexilo y grupos fenilo [71]; los componentes más polares aparecen primero y al aumentar la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de retención de los componentes [70]. La fase móvil está constituida por un solvente polar, mezcla de agua y un modificador orgánico, a los que se les puede agregar aditivos, sales o buffers. A mayor modificador orgánico, menor retención y a mayor proporción de agua, mayor retención. Los solventes de mayor empleo además de agua son: metanol, acetonitrilo, isopropanol y tetrahidrofurano [69]. Estos solventes se pueden clasificar en términos de polaridad de la siguiente manera: Agua > MeOH > AcCN > IsoPOH > THF
A medida que disminuye la polaridad en los solventes, aumenta su poder de elución; en la tabla 12 se mostraran algunas de sus propiedades. Solvente Agua Metanol Acetonitrilo Isopropanol Tetrahidrofurano
Índice de polaridad 9.0 6.6 6.2 4.3 4.2
Fuerza dispersiva 0.03 0.04 -0.10 -0.15
Donador de protones 0.40 0.51 0.33 0.28 0.41
Aceptor de protones 0.34 0.19 0.26 0.39 0.19
Momento dipolar 0.26 0.30 0.41 0.33 0.40
Tabla 12. Propiedades de los solventes en CLAE La cromatografía en fase reversa puede clasificarse según su forma operativa como se observa en la tabla 13.
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Tabla 13. Clasificación de la cromatografía en fase reversa según su forma operativa Cromatografía Supresión iónica
Par iónico
Descripción Los solutos ionizables dan picos con baja retención y fuerte asimetría; en fase reversa solo se retendrá favorablemente la especie no iónica. Así, los factores que modifican ese equilibrio, ya sean pH o fuerza iónica, modificaran la retención [69]. En esta cromatografía la fase móvil contiene un par-ión, es decir, una especie química de carga opuesta al analito; estos forman un complejo
“neutro”
que
se
transporta
dentro
de
la
columna, particionándose entre la fase móvil y la fase estacionaria. Se trata de mantener el analito en su forma iónica [69]. Complejación con Esta modalidad se conocía como cromatografía de intercambio iones metálicos de ligandos, por el intercambio del soluto (ligando) con iones metálicos inmovilizados en la fase estacionaria [69]. El soluto puede ser insoluble en AcCN, MeOH o THF, y sus mezclas con agua. Estas muestras altamente lipofílicas pueden RP en medio no ser resueltas en fase normal; pero la fase reversa con fase móvil acuoso de baja polaridad, sin agua agregada tiene muchas veces la suficiente selectividad y poder de retención para permitir su resolución[69] Para este tipo de cromatografía se emplea como fase móvil una mezcla de agua y un modificador orgánico MeOH, AcCN o THF, De reparto en mezclas binarias, terciarias y en casos complejos, aún cuaternarias [69].
5.4. INSTRUMENTACIÓN PARA CORMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA 5.4.1. Bomba. las bombas de CLAE impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solvente hacia el inyector, y desde allí hacia la columna. Básicamente existen dos tipos de bomba: las de pistón y las de desplazamiento [69]. 5.4.2. Inyector. Es el dispositivo que permite introducir la muestra en solución sin interrumpir el caudal de solvente a través del sistema. Actualmente la totalidad de los inyectores de CLAE son válvulas que orientan el caudal hacia la columna, las válvulas pueden accionarse manual o automáticamente [69]. 5.4.3. Columna. Consta de un soporte rígido, más una fase estacionaria adjunto [64]. La fase estacionaria está contenida en un tubo que debe ser capaz de contener la presión generada en su interior durante su uso [72]. 40
5.4.4. Detectores. El detector es un transductor que convierte una característica física o química de un analito eluido en una señal eléctrica que puede estar relacionada con la concentración del analito [64], y luego transmitir la señal eléctrica a la pantalla donde se muestra como una desviación de la línea [71]. Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores generales miden el cambio en alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito, como el detector de índice de refracción y de conductividad; los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto como el detector UV, de arreglo de diodos (DAD), de fluorescencia, índice de refracción y el electroquímico [69, 71].
5.4.4.1. Detector de adsorción UV-visible. Los detectores más utilizados en la HPLC moderna son fotómetros basados en rayos ultravioleta (UV) y la absorción de luz visible. Estos detectores tienen una alta sensibilidad para muchos solutos, pero las muestras deben absorber en la región UV (o visible). La concentración de la muestra es linealmente proporcional a la absorbancia, de luz transmitida a través de la celda. 5.4.4.2. Detector de arreglo de diodos. Puede ser operado para recopilar datos en una o más longitudes de onda a través de un cromatograma, o para recoger espectros completos de uno o más analitos en una corrida. Si dos picos eluidos estrechamente tienen espectros suficientemente diferentes, puede ser posible distinguir los dos picos espectralmente con este detector [64] 5.3.3. Espectroscopia ultravioleta visible. La absorción en el UV-VIS se debe a las vibraciones de los electrones, con cambio de su nivel energético, se da más fácilmente en los compuestos que tienen enlaces dobles y triples conjugados y electrones no compartidos y esta favorecida por la resonancia. Esta técnica da información sobre la distribución de electrones en la molécula (espectros electrónicos) y de ella se obtienen algunos datos sobre la estructura molecular [73]. La región UV-Vis del espectro electromagnético, que se extiende de unos 200 a unos 800 nm, es la región espectral más utilizada en análisis químico. Los instrumentos que se utilizan en el visible y el ultravioleta son comunes, relativamente sencillos y bien adaptados al análisis cuantitativo. Existen dos clases generales de compuestos químicos que absorben en la región ultravioleta41
visible y que se pueden determinar cuantitativamente midiendo esta absorción. Se trata de los compuestos orgánicos que poseen dobles enlaces conjugados o anillos aromáticos, y los iones de los metales de transición. Los equipos destinados a la medición de la absorción de radiación contienen una fuente de radiación continua. Para la luz visible, esta fuente o foco es una lámpara de filamento de wolframio [74].
5.5. ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO 5.5.1. Análisis cualitativo. Las mediciones cualitativas son las que identifican o ayudan a identificar la estructura de un analito. En general, la cromatografía es una débil herramienta para el análisis cualitativo, pero un sistema CLAE de buen comportamiento acoplado a un detector apropiado puede hacer que sea mucho más adecuado. Existen tres métodos comunes para el análisis cualitativo por CLAE: Tiempo de retención: La técnica más común para el análisis cualitativo por HPLC es comparar el (tR) tiempo de retención del analito a la de un patrón de referencia. Análisis en línea: La elucidación estructural de analitos desconocidos se puede realizar con la ayuda de detectores de CLAE, pero rara vez esta detección es tan eficaz como los procedimientos cualitativos off-line. Varios detectores de como UV, RMN, o IR proporcionan información cualitativa espectral sobre la muestra; mientras que otros detectores, como dispersión láser de luz, MS o detectores quirales generan información más específica y cuantitativa sobre el analito. Análisis fuera de línea: Si se recogen fracciones de la corriente de efluente en CLAE en modo semipreparativa o preparativa, una cantidad suficiente de analito puro puede ser recogido para permitir el análisis fuera de línea para la determinación estructural [64]. ●
5.5.2. Análisis cuantitativo. 5.5.2.1. Calibración. La calibración es el proceso mediante el cual se determina la respuesta del detector por unidad de concentración (o masa) del analito. La
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calibración puede realizarse con tres métodos diferentes: estándar externo, estándar interno y adición de estándar [64].
5.5.2.1.1. Estándar externo. Se preparan estándares de concentración semejante al analito en la muestra y en el ensayo cromatográfico de ambas, muestra y estándar, en las mismas condiciones operativas. La concentración de analito en la mezcla se determina comparando el área del pico en cuestión con el área correspondiente al estándar de referencia. Como se observa en la ecuación 1. Ecuación 1 Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, A m y As son las áreas de la muestra y el estándar respectivamente, C s es la concentración del estándar y D es un factor de dilución. Este método requiere, obviamente, la utilización de un estándar de referencia y su exactitud dependerá ampliamente de la calidad del estándar utilizado. La precisión de los datos que se obtienen depende tanto de la preparación de la muestra y el estándar como de la inyección de ambos [69].
5.5.2.1.2. Estándar interno. Consiste en agregar cantidades exactamente medidas de una sustancia así denominada, tanto a la muestra como a un estándar que contiene al analito, preparado con la misma concentración que la muestra. Para determinar la concentración de analito en la muestra se calcula la relación de áreas de analito a estándar interno tanto en la muestra y como en el estándar y se efectúa el cociente entre amabas como se observa en la ecuación 2: Ecuación 2 Donde P es el porcentaje de analito en la muestra, R m y R s son las relaciones de área de analito a estándar interno en la muestra y el estándar respectivamente, C s es la concentración del estándar y D es un factor de dilución [69].
5.5.2.1.3. Adición de estándar: Esta técnica es utilizada cuando una muestra en blanco no está disponible, y la matriz de la muestra puede afectar el tiempo de retención y la respuesta o área del pico del analito [64]. Consiste en inyectar dos muestras para realizar un análisis, una de ellas es la muestra original y la otra es la muestra a la que se le agrega una cantidad conocida de estándar de referencia. 43
Esta segunda muestra se usa como estándar. La concentración del analito en la muestra se calcula con la ecuación 3.
Ecuación 3 Donde P es el porcentaje de analito en la muestra A m y Ams son las areas del analito en la muestra tal cual y la muestra a la que se le ha agregado estándar respectivamente, Cs es la concentración del estándar y D es un factor de dilución [69]. Debido al gran número de determinaciones realizadas en un análisis químico se hace necesario el empleo de parámetros estadísticos que simplifican el análisis de los resultados obtenidos [69]. Estos parámetros son:
5.5.2.1.4. Linealidad. Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta. Conjuntamente se determina el rango lineal o sea el intervalo comprendido en la concentración mínima y máxima de analito para el cual el método y dentro del cual se puede efectuar el cálculo por interpolación en una curva estándar [69]. Para su determinación se prepara una serie de al menos cinco patrones de un estándar, se determina la curva de regresión por el método de los mínimos cuadrados [69]. 5.5.2.1.5. Precisión. Está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea. Se expresa matemáticamente como la desviación estándar ( ), como la desviación estándar relativa ( ) o coeficiente de variación ( ) el cual tiene un criterio de aceptación no mayor al 2 %. Estos estimadores permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la medida [69]. La precisión debe medirse en condiciones repetitivas (mismo analista, mismo día, mismo instrumento) y en condiciones reproducibles (diferente analista, diferente día, diferente instrumento). El cociente repetibilidad/reproducibilidad es un parámetro muy útil para evaluar la precisión de un método analítico. Su valor esta normalmente comprendido entre 1.5 y 2 [69].
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5.5.2.1.6. Exactitud. Se conoce también como error sistemático o tendencia y corresponde a la diferencia entre la media de los valores obtenidos y el valor verdadero. Se puede expresar de los siguientes modos: desviación, desviación relativa y recuperación. La exactitud debe ser tan pequeña para que sea posible que el valor medido se aproxime al de referencia [69] . 5.5.2.1.7. Sensibilidad. Corresponde a la mínima cantidad de analito que puede producir un resultado significativo. Se debe diferenciar claramente entre dos tipos [69]: Sensibilidad de calibración: Correspondiente a la curva de calibración. Sensibilidad analítica: Correspondiente al cociente entre la sensibilidad de calibración y la desviación estándar de la medida. Al evaluar la sensibilidad se debe tener en cuenta los siguientes parámetros:
Limite de detección: Es la menor concentración de analito que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse en una muestra, en las condiciones establecidas; se expresa en unidades de concentración. Se calcula como la señal del blanco, más tres veces la desviación estándar del blanco, [69], como se observa en la ecuación 4: Ecuación 4 Limite de cuantificación: Es la menor concentración de analito que puede determinarse con precisión y exactitud en las condiciones establecidas y se expresa en unidades de concentración. Se calcula como la señal del blanco, más diez veces la desviación estándar del blanco, [69], como se puede observar en la ecuación 5: Ecuación 5 5.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 5.6.1. Análisis de varianza y paquete estadístico. El análisis de varianza ANOVA de una vía es una herramienta estadística, de gran utilidad para el control de procesos y métodos analíticos [75], cuando el número de medias obtenidas es mayor de dos. Cuando se varían factores como métodos, laboratorios, analista etc., siempre existen dos fuentes de error, la primera, el 45
error aleatorio de medida y la segunda, los errores debidos al cambio de los factores anteriormente mencionados. Mediante el ANOVA se puede controlar el error introducido por esta segunda fuente, por lo que se habla de ANOVA de un factor [76]. El objetivo del ANOVA es comparar los diversos valores medios para determinar si alguno de ellos difiere significativamente del resto.
5.6.2. Análisis de conglomerados. Es una técnica estadística que permite organizar la información de las variables para formar grupos homogéneos, denominados clusters (grupos, clases). Los grupos que se obtienen se forman por ser internamente homogéneos (todos los miembros del grupo son parecidos) y externamente heterogéneos (los miembros de un grupo son muy diferentes de los otros grupos). Es decir, con el método de cluster se pueden incluir objetos en grupos según su grado de asociación, que será máximo si pertenecen al mismo grupo o mínimo si son de grupos diferentes [77].
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6. METODOLOGÍA 6.1. INSTRUMENTACIÓN Y REACTIVOS Los equipos utilizados para este análisis fueron: estufa BINDER, ultrasonido marca BRANSON 3510, cromatógrafos HITACHI LaChrom y Jasco; y micro jeringa HAMILTON de 100µL. Los reactivos fueron acetonitrilo grado CLAE, metanol grado CLAE, agua destilada y desionizada, aloína A de pureza >97% de hojas de Aloe barbadensis Miller, y estándar de Aloe curaçao. 6.2. LUGAR DE ANÁLISIS El análisis se llevo a cabo en el laboratorio de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira ubicada a una latitud norte 04° 48 ’ N, longitud oeste de 75° 41’ O, altitud de 1411 msnm con una temperatura promedio de 22 °C y una precipitación de 2700 mm/año. 6.3. MUESTRAS DE ANÁLISIS Para el análisis se utilizaron hojas adultas no menores a 3 años recolectadas de la parte baja de la planta de Aloe vera; frescas y de aspecto sano, cultivadas en cinco fincas del departamento de Risaralda las cuales se mencionan en la tabla 14. Tabla 14. Lugares de recolección de las hojas de Aloe vera MUNICIPIO Marsella Mistrató Belén de Umbría Santuario Pereira - Corregimiento de La Florida
FINCA La Aurora La Magdalena La Esperanza Pite Tierra La Palma
6.3.1. Recolección y transporte de las muestras de Alo e vera. Se tomaron hojas de plantas adultas, realizando un recorrido en forma de zig-zag o diagonal, según la topografía y el tamaño del terreno. Se recolectaron las hojas en bolsas negras de polietileno y se trasladaron hasta la Universidad Tecnológica de Pereira en el menor tiempo posible. 6.3.2. Pre-tratamiento. Las hojas de Aloe vera se llevaron al laboratorio de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira, se dejaron a temperatura ambiente por un día, se lavaron con agua de la llave y jabón TEGO 51 para alimentos y se conservaron a 4°C para posterior análisis. 47
6.3.2.1. Obtención del acíbar. Se realizó una incisión sobre el extremo inferior de la hoja empleando un cuchillo plástico, para obtener el acíbar por gravedad y recolectarlo en un vaso de precipitados protegido de la luz (ver figura 10). Este procedimiento se realizo con dos hojas de cada zona, y cada hoja se analizo por triplicado.
Figura 10. Obtención de acíbar 6.3.2.2. Obtención y secado del gel de Aloe v era. Se pesó la hoja entera, posteriormente se realizó un corte alrededor del borde de la hoja que permitió la remoción de la corteza para obtener el mucílago; se peso y corto en láminas delgadas que fueron dispuestas en bandejas forradas con papel vinilo (ver figura 11), las cuales se colocaron en una estufa BINDER a 40°C durante dos días. Para concentrar los analitos de interés. Este procedimiento fue realizado con dos hojas de cada zona, las cuales se analizaron por triplicado.
(a)
(b)
Figura 11. Obtención del mucílago de la hoja de Aloe vera en base húmeda (a) y en base seca (b)
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6.4. EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS PARA ANÁLISIS POR CLAE Se emplearon muestras de mucilago seco y acíbar. La extracción se realizo en ultrasonido marca BRANSON referencia 3510 usando metanol grado CLAE como solvente de extracción con una relación muestra solvente 1:10 (0.5g de muestra y 5mL de metanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente [2, 13]. 6.5. EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS PARA ANALISIS POR ESPECTROSCOPIA UV-VIS Se empleo mucilago seco. La extracción se realizo en ultrasonido marca BRANSON referencia 3510 usando una mezcla agua:etanol 1:1 como solvente de extracción con una relación muestra solvente 1:2,5 (1 g de muestra y 2.5 mL de mezcla) durante 40 minutos a temperatura ambiente [2]. 6.5.1. Obtención de derivados. A los extractos obtenidos por ultrasonido se les adiciona ácido clorhídrico 0,1M y tricloruro férrico (ver figura 12); se realiza ultrasonido durante 30 minutos. Posteriormente se le realizaron 4 extracciones sucesivas con éter de petróleo. Los extractos etéreos fueron concentrados por rotaevaporación, los residuos obtenidos se redisolvieron con solución metanólica de acetato de magnesio al 1%. La solución se sometió a reflujo a una temperatura de 40ºC durante 10 min para propiciar el desarrollo del color rosado o rojo, se dejó reposar hasta alcanzar temperatura ambiente y se aforó a 10 mL con solución metanólica de acetato de magnesio al 1% para su posterior análisis por espectrofotometría [2]
Figura 12. Reacción de hidrólisis de la aloína
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6.6. ANÁLISIS DE ANTRAQUINONAS Y CROMONAS POR CLAE Para el análisis de antraquinonas y cromonas por CLAE se trabajo bajo las condiciones descritas en la tabla 15. Tabla 15. Condiciones de análisis por CLAE para antraquinonas y cromonas
Cromatógrafo Columna Fase móvil Gradiente Después de cada corrida se realizaba una re-equilibración de 15 minutos. Detector Longitud de onda Flujo Temperatura Volumen de Inyección Software
Condiciones de análisis HITACHI LaChrom Jasco* L – 2130 Bomba PU – 2089 L – 2300 Horno CO – 2065 L – 2420 Detector MD – 2015 Symmetry C18, 100Å, 5 µm, 4,6 x 250 mm Agua (A) : Acetonitrilo (B) Tiempo Proporción 0 min 84% A 12 min 84% A 37 min 67% A 50 min 40% A 60 min 100% B UV DAD 296 nm 1 mL/min 45 ºC 20 µL
EZChrom Elite® Data System * Este equipo fue utilizado para el análisis cualitativo.
6.6.1. Análisis cualitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el Aloe vera . Para establecer la identificación de antraquinonas y cromonas, se realizó la comparación con los tiempos de retención ( tr ); preparando un patrón del estándar de Aloe curaçao Sigma-Aldrich; y una muestra de acíbar; los cuales se inyectaron bajo las condiciones previamente establecidas (ver tabla 15). Además se realiza un análisis en un cromatógrafo equipado con detector de arreglo de diodos (DAD), para la obtención de los espectros UV de cada pico, determinar su naturaleza y establecer la identidad de las antraquinonas y cromonas presentes en la muestra de análisis.
6.6.2. Análisis cuantitativo de las antraquinonas y cromonas presentes en el Aloe vera . La cuantificación se realizó empleando las condiciones de separación descritas en la tabla 16 y por el método de estándar externo, realizando una curva
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de calibración de 5 puntos utilizando el estándar de aloína al 97% Sigma-Aldrich (ver tabla 16), cada patrón se preparo en balón aforado de 5 mL, protegidos de la luz con papel aluminio.
Tabla 16. Concentración de los patrones de aloína al 97% Patrón 1 2 3 4 5
Concentración 20 ppm 40 ppm 60 ppm 80 ppm 100 ppm
Para la curva de calibración se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión, sensibilidad (LD y LC) y exactitud para determinar que el método utilizado en el análisis sea el adecuado.
6.7. ANÁLISIS DE ANTRAQUINONAS TOTALES POR LA TÉCNICA ESPECTROFOTOMETRÍCA La cuantificación de los derivados antraquinónicos se realizó por espectrofotometría UV-Visible, empleando un espectrofotómetro Marca ThermoScientific Evolution 60. Las muestras fueron analizadas a una longitud de onda de 495 nm en el espectrofotómetro y la cuantificación se realizó utilizando una curva de calibración realizada con un estándar de Aloe curaçao Sigma-Aldrich (ver tabla 17) [2] Tabla 17. Concentración de los patrones de A lo e cu raçao Patrón 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración 10 ppm 20 ppm 40 ppm 60 ppm 80 ppm 100 ppm 200 ppm 312 ppm
Absorbancia 0,000 0,003 0,005 0,006 0,0091 0,011 0,021 0,034
6.8. TOMA DE DATOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó un análisis de varianza ANOVA y un análisis de conglomerados mediante el Software InfoStat versión 2011e para contribuir con el establecimiento
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de diferencias y/o similitudes en cuanto al contenido de las antraquinonas y cromonas en las diferentes zonas de estudio. Se realizó una comparación de las medias para determinar la homogeneidad de las muestras a través del nivel de significancia de los datos con un criterio del 5% y los valores críticos de la distribución F (0,05); tanto para las muestras de gel como para las muestras de acíbar. Para esto se plantearon dos hipótesis:
H0= hipótesis nula: la cual sugiere que las concentraciones de las muestras son iguales en todas las zonas de cultivo. H1= hipótesis alterna: sugiere que las concentraciones de al menos dos zonas sean diferentes.
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Anexo 3. Curva de calibración de aloína por CLAE
Curva de aloína por CLAE 7000000 6000000 5000000 a e r Á
4000000 3000000 2000000
y = 66893,864x + 4.590,00 R² = 0,99996
1000000 0 0
20
40
60
Concentración (mg/L)
97
80
100
