CENTRIF!ACIÓN ASPECTOS TEÓRICOS Técnica que permite la separación separación de moléculas por su tamaño tamaño molecular. Cuando un conjunto de moléculas en suspensión se someten s ometen a un campo gravitatorio suficientemente elevado puede conseguirse que tales moléculas sedimenten
La velocidad a la que sedimenta una partícula depende : Naturaleza de la partícula (tamaño forma ! densidad" Naturaleza del medio (viscosidad ! densidad" #uerza que se aplica a la partícula as partículas m"s #randes sedimentan m"s r"pidamente
'F( que acta so5re 3ir 4a5riel 3to6es (789,": $a (789,": $a %uer$a %riccional 'F( que una partícula esférica ! rígida de radio r que est; sedimentando a una velocidad dr-dt en un medio cu!a viscosidad es η viene dada por la e&presión:
# ' , π η r (dr-dt"
fuerza en sentido contrario al movimiento $a partícula se encuentra sometida a otras fuerzas: Fuer$a #ravitacional que #ravitacional que %ace que la partícula sedimente: m & g' ρ & ) & g E%ectos de %lotaci&n %lotaci&n rincipio de *rquímides: fuerza ascendente ascendente igual al peso del volumen de fluido desplazado por dic%o cuerpo: ρm & Teniendo en cuenta cuenta am5as fuerzas fuerzas la ecuación ecuación anterior puede puede )&g escri5irse:
(ρ + ρm" ) g ' , π η r (dr-dt" ) ' / π r0 -0 (partícula esférica" 1 r1 g (ρ + ρm" -2 ' η (dr-dt" dr )elocidad de sedimentaci&n de una partícula* dt
2 ⋅ rP2 ⋅ g ⋅ (ρP = 9 ⋅η
− ρm )
! viene determinado por la velocidad angular de
!+
- r
,
3e suele e&presar como mltiplo del campo gravitatorio terrestre: Campo centrífugo relativo (=C#" ! se e&presa en unidades conocidas como >g? 2
RCF
g
r
g'28@ cm s+1
(g )
An campo centrífugo de 7@@.@@@ g %ace referencia a un campo 7@@.@@@ veces superior al gravitatorio terrestre
2 (rpm ) (rad / s ) 60
4 RCF
2
(rpm ) 3600 980
2
r
1.119 10
5
( rpm )
2
r
idad de sedimentaci&n de una partícula sometida a un campo centrí%u
dr dt
2 ⋅ rP2 ⋅ ω 2 ⋅ r ⋅ (ρP − ρ m ) = 9 ⋅ η ⋅ (f/fo )
ara partículas no esféricas se inclu!e en el denominador la relación entre coeficiente friccional de la molécula ! el de una esfera con el mismo radio efectivo (f-f @"
COEFICIENTE .E SE.I/ENTACIÓN 'S(* velocidad a la que sedimentaría una partícula en un campo centrífugo unitario S
=
dr / dt 2 ϖ ⋅ r
$a unidad es el 3ved5erg ' 7@ +70 s
COEFICIENTE .E SE.I/ENTACIÓN 'S( valor de 3 para una partícula o 5iomolécula depende de varios factores como: Características de la macromolécula Condiciones e&perimentales en las que se realizó la medida $as propiedades del medio en el que se produce la sedimentación de la partíc $a relación entre el coeficiente de sedimentación ! la masa molecular de una partícula no es lineal sino que depende de las propias partículas. /acromol0cula
Relaci&n
Ran#o de /r 6137615
Proteínas
S+ 1211,3, - /1245
RNA
S+ ,246 8 121,, - /1239
.NA lineal
S+ ,2: 8 1211:9 - /1235;
614761:
.NA circular
S+ ,25 8 12165<; - /1233<
6147615
.NA superenrollado .NA sencillo
S+ 5233 8 1211,3 - /12<:
6147615
S+ 12161< - /12<3;
614761:
Cromatina
S+ 12166 - /12<<3
S t,m
ηt,m (ρP
ρ 20, w )
η20, w (ρP
ρ t,m )
1 ω2
dr ηt,m (ρP ρ 20, w ) r dt η20, w (ρP ρ t,m )
INSTR/ENTACIÓN TIPOS .E CENTR=F!AS 3e pueden diferenciar en: la velocidad m;&ima que alcanzan la presencia o ausencia de vacío posi5ilidad de controlar la temperatura el volumen m;&imo de muestra
Centrifugas disponi5les en el mercado: Centrífugas preparativas de gran capacidad ! 5aja velocidad Centrífugas preparativas refrigeradas de alta velocidad Altracentrífugas analíticas Altracentrífugas preparativas Centrífugas clínicas de escala grande Dicrocentrífugas de la5oratorio de pequeña escala Altracentrífugas: Ee5en de incorporar un sistema de vacio.
TIPOS .E ROTORES /aterial Altracentrifugación : aleaciones de titanio Campos centrífugos menores: aleaciones de aluminio fi5ra reforzada acero Rotores %lotantes '>asculantes(* *l actuar el campo centrífugo las carcasas dónde se introducen los tu5os se orientan a favor del campo pasando a estar colocadas perpendicularmente respecto a la posición de reposo. Rotores an#ulares : #orman un cierto ;ngulo con la vertical Rotores verticales: $os tu5os se encuentran dispuestos en posición vertical. ara un cierto tamaño de rotor en los verticales el campo centrifugo sería ma!or. 3eparaciones m;s r;pidas !a que la distancia que recorre la muestra es el di;metro del tu5o. 3i el material sedimentado so5re la pared del tu5o no esta mu! compacto puede desprenderse Rotores ?casi verticales@
=otores flotantes (5asculantes"
Rotores an#ulares
Rotores verticales
Factor de un rotor Gndica la capacidad centrifugadora de un rotor. 3e define como: 2.53 1011 ln( k max
r max ) r min
* menor valor de 6 ma!or capacidad
( rpmmax )2
3e suele dar para la velocidad m;&ima de un rotor. ara cualquier otra velocidad se puede calcular como: k
rpmmax 2 k max ( ) rpm
3i se conoce el coeficiente de sedimentación de una partícula se puede calcular el tiempo en %oras necesario para precipitarla t
k max S
elecci&n de tu>os de centrí%u#as adecuados* o 'pl"stico( Claridad =esistencia química Decanismo de sellado (de ser necesario"
TIPOS .E CENTRIF!ACIÓN
2
P
P
m
o
$as diferentes partículas de un %omogenado pueden separarse por centrifugación precipit;ndolas mediante etapas sucesivas por incremento de la fuerza ejercida o del tiempo de centrifugación. No es un proceso demasiado resolutivo
CENTRIF!ACIÓN .IFERENCIAL
'lavado(
CENTRIF!ACIÓN BONAL 3epara las partículas en función de su coeficiente de sedimentación 3e emplean tu5os de centrífuga en los cuales se %a formado un gradiente $a muestra se aplica en una 5anda discreta encima del gradiente )olmenes de muestra m;s pequeños que en la centrifugación diferencial la muestra (particulas I disolvente" %a de tener una densidad menor a la del límite inferior del gradiente $a densidad de las partículas utilizadas no de5e ser menor a la de los gradientes
ENTRIF!ACIÓN BONAL
CENTRIF!ACIÓN ISOP=CNICA $a separación se realiza tan solo en 5ase a la densidad de las partículas. $a densidad de las partículas utilizadas de5e estar dentro de los límites de las densidades de los gradientes. 3e parte de un sistema %omogéneo en el que las partículas se encuentran suspendidas en disoluciones autoformadoras de gradientes (CsCl Cs13J/ KLr KG NaLr NaG =5Lr =5Cl tricloroacetato de =5 o Cs". *l aplicar la fuerza centrífuga se genera el gradiente ! las partículas se mueven en función de sus diferencias de densidad con el medio que las rodea %asta alcanzar un punto en el cual ( ρ+ ρm" '@. Ana vez que se alcanza este cuasi equili5rio el tiempo de la centrifugación !a no influ!e en la migración de partículas
CENTRIF!ACIÓN ISOP=CNICA
Preparaci&n de #radientes 4radientes
discontinuos lineal continuos cóncavo conve&o
!radientes discontinuos: se deposita en un tu5o de centrífuga cuidadosamente ! de forma secuencial disoluciones de densidades decrecientes !radientes continuos: se emplea un equipamiento sencillo mediante un gradientador o un formador de gradientes e&ponencial
radientador: Eos recipientes comunicados entre si (vasos comunicantes"
3ecciones iguales lineal
LF* cóncavo
LM* conve&o
APLICACIONES
APLICACIONES
APLICACIONES .eterminaci&n del coe%iciente de sedimentaci&n de proteínas Dediante centrifugación zonal en gradientes de densidad en condiciones en las que la velocidad de sedimentación es constante a lo largo del gradiente ! proporcional al coeficiente de sedimentación 4radientes isocinéticos: el ma!or campo centrífugo que acta so5re una molécula segn se va alejando del eje de giro queda compensado por la ma!or resistencia que ofrece el medio al avance
APLICACIONES ntri%u#aci&n isopícnica de muestras de .NA
LTRACENTRIF!ACIÓN ANAL=TICA Determinación de parámetros moleclares !"#ar el #rado de pre"a Precisa de sistemas de observación$ se o%ser&a lo 'e ocrre en la mestra drante la aplicación del campo eci!iente de m"estra $ cllas de centri#ación$ cilindros en los 'e *a+ na peroración c+a sección trans&ersal tiene orma de sector circlar, dos laminas de car"o adosadas a las %ases del cilindro deinen la ca&idad de la mestra. -a orma del este aloamiento e&ita 'e *a+a sedimentación en las paredes
A$T=*C
Gnicialmente: célula ocupada por la disolución de soluto *l producirse la sedimentación: surge una discontinuidad en el medio líquido %a5r; una zona en la que sólo %a!a disolvente ! otra en la que %a!a disolución. *simismo %a5r; soluto que %a!a sedimentado en el fondo del tu5o.
Tomando medidas a diferentes tiempos de centrifugación se puede determinar la velocidad de desplazamiento del soluto
dr
dt 2 r
d ln r 1 2 dt
la representaci&n de lnr vs t la pendiente de la recta es el valor de S
